經(jīng)遺傳修飾的非人動物及其使用方法
【專利說明】經(jīng)遺傳修飾的非人動物及其使用方法
[0001]對相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求2012年9月7日提交的美國臨時申請流水號61/698，002，和2013年3月8日提交的美國臨時申請流水號61/775，171的優(yōu)先權，每篇的內(nèi)容通過提及完整收入本文。
[0003]發(fā)明背景
[0004]生物醫(yī)學研宄的目的是更好地了解人生理學以及使用此知識來預防、治療或治愈人疾病。由于對人受試者進行實驗的實際和倫理障礙，許多研宄是對小型動物模型(諸如小鼠)進行的。然而，小鼠并不是人，并且自動物實驗獲得的知識不總是適用于人。在此背景中，用人血液-淋巴樣系統(tǒng)(HHLS)再殖(repopulate)的小鼠代表一種用于在體內(nèi)研宄人造血和免疫功能的有用小型動物模型。
[0005]HHLS小鼠是通過將人造血干細胞和祖細胞(HSPC)和/或人胎兒組織移植入免疫應答的先天性和適應性分支有缺陷的接受者小鼠中生成的。在20世紀80年晚期開發(fā)出HHLS 小鼠的第一種模型(Mosier 等，1988，Nature335:256-259 ；McCune 等，1988，Science241:1632-1639 ； Kame 1-Re id 和 Dick, 1988，Science 242:1706-1709)，并且自此以后已經(jīng)經(jīng)歷了一系列改良(Legrand 等，2006，Journal of Immunology 176:2053-2058 ;Shultz等，2007，Nature Reviews Immunology 7:118-130)。目前作為接受者用于人造血移入的小鼠品系共享三項特征。第一，它們由于編碼PRKDC蛋白的基因中的Scid突變(Mosier等，1988, Nature 335:256-259 ;McCune 等，1988，Science241:1632-1639)，或者由于兩個Rag基因之一的刪除(Shultz 等，2000，Journal of immunology 164:2496-2507 ;Traggiai等，2004，Science 304:104-107)而缺乏B和T細胞。第二，編碼細胞因子受體的共同Y鏈(γ。)的I12rg基因的刪除或突變消除IL-15信號傳導，并且導致NK細胞的缺失(Traggiai 等，2004，Science304:104-107 ；Ito 等，2002，Blood 100:3175-3182)。第三，小鼠巨噬細胞上表達的SIRPA受體和人細胞上的⑶47配體之間的相互作用對小鼠巨噬細胞提供抑制信號，并且為人異種移植物賦予吞噬細胞耐受性(Takenaka等，2007，NatureImmunology 8:1313-1323 ；Takizawa 和 Manz, 2007，Nature Immunology8:1287-1289)。在使用含有Sirpa基因中的天然多態(tài)性的NOD遺傳背景時(Takenaka等，2007, NatureImmunology 8:1313-1323 ；Takizawa 和 Manz, 2007，Nature Immunology 8:1287-1289;Legrand 等，2011，Proc Natl Acad Sci USA108:13224-13229)或者通過人 SIRPA 基因的BAC 轉(zhuǎn)基因表達(Strowig 等，2011，Proc Natl Acad Sci USA 108:13218-13223)實現(xiàn)小鼠細胞上表達的SIRPA和人⑶47之間的物種間相互作用。在使用NOD Scidy (NOG (Ito等，2002，BloodlOO:3175-3182)或 NSG(Ishikawa 等，2005，Blood 106:1565-1573))或hSIRPAtg RAG2vU/-(SRG(Strowig等，2011，Proc Natl Acad Sci USA108:13218-13223))小鼠作為接受者時在人HSPC移植后實現(xiàn)高水平的人造血細胞移入。
[0006]雖然在這些接受者品系中觀察到人多譜系造血發(fā)生，但是大多數(shù)人細胞類型的終末分化、穩(wěn)態(tài)和/或效應器功能是亞最佳的。已經(jīng)假設此狀況是由于由小鼠組織分泌的細胞因子和造血細胞上表達的人受體之間的交叉反應性降低或缺失所致(Manz, 2007, Immunity26:537-541 ;Willinger 等，2011，Trends in Immunology 32:321-327)。為了避開此限制，已經(jīng)開發(fā)出數(shù)種策略來在小鼠宿主中投遞人細胞因子。這些方法包括注射重組細胞因子(Lapidot 等，1992，Science 255:1137-1141 ；van Lent 等，2009，J.1mmunol 183:7645-7655)，細胞因子編碼 cDNA 的慢病毒投遞(O，Connell 等，2010，PloSOne 5 ⑶:e 12009)，質(zhì)粒 DNA 的水動力學注射(Chen 等，2009，Proc Natl Acad SciUSA106:21783-21788)，cDNA 的轉(zhuǎn)基因表達(Nicolini 等，2004，Leukemial8 (2):341-347 ；Brehm 等，2012，Blood 119:2778-2788 ；Takagi 等，2012，Bloodll9:2768_2777)或細胞因子編碼基因的敲入替換(Rongvaux 等，2011，Proc Natl Acad Sci USA 108:2378-2383 ；Willinger 等，2011，Proc Natl Acad Sci USA108:2390-2395 ;Rathinam 等，2011，Blood118:3119-3128)。后一種方法具有人基因的更為生理性的表達的優(yōu)點。此外，若人細胞因子在小鼠受體上不是完全交叉反應性的，則它能在小鼠細胞群體中誘導缺陷，并且對人細胞賦予額外的競爭優(yōu)勢。使用敲入基因替換策略，編碼血小板生成素的基因(Tpo)的人源化導致功能性人造血干細胞的維持更好和骨髓中的移入增加(Rongvaux等，2011，Proc NatlAcad Sci USA 108:2378-2383);編碼白介素_3和GM-CSF的基因(113和Csf2)的替換誘導小鼠肺泡巨噬細胞(AM)的喪失和功能性人AM的發(fā)生(Willinger等，2011，Proc NatlAcad Sci USA 108:2390-2395);并且Csfl基因(其編碼M-CSF)的替代導致多種組織中人單核細胞的數(shù)目增加(Rathinam 等，2011，Blood 118:3119-3128)。
[0007]人和小鼠造血-淋巴樣系統(tǒng)在許多方面不同(Haley, 2003,Toxico1gy188:49-7 I ；Mestas 和 Hughes, 2004, J Immunol172:2731-2738) o兩個物種間的主要差異之一在于它們的白血球(WBC)微分。人血液富含髓樣細胞，占總WBC的50-75 %。比較而言，小鼠血液以淋巴細胞占優(yōu)勢，并且僅20-30 %的WBC是髓樣譜系的。此物種差異(尚未了解其功能和進化意義)在常規(guī)HHLS小鼠(諸如N0G/NSG或SRG)中沒有重演。實際上，人髓樣發(fā)生在這些宿主中是特別有缺陷的，其中髓樣細胞僅占人WBC的5-10%。
[0008]具有功能性人免疫系統(tǒng)的小鼠的一項應用是開發(fā)和測試人疫苗。在歷史上，免疫應答的體內(nèi)誘導相對低效(2004，Traggiai 等，Science 304:104-107 ；2002, Ito 等，Blood100:3175-3182 ；2005, Ishikawa 等,Blood 106:1565-1573 ；2005,Shultz 等,J Immunol174:6477-6489 ;2006，Baenziger 等，Proc Natl Acad Sci USA 103:15951-15956)。數(shù)項研宄已經(jīng)報告了感染后成功的病原體特異性免疫應答。雖然報告了 50%左右的小鼠在登革熱病毒感染后生成病毒特異性IgM和IgG(2007，Kuruvilla等，Virology 369:143-152)，但是其它研宄報告了在HIV和EBV感染后生成抗原特異性IgM和IgG的小鼠的頻率低于 20% (2006，Baenziger 等，Proc Natl Acad Sci USA 103:15951-15956 ；2008, Yajima等，J Infect Dis 198:673-682) ?在用佐劑和抗原免疫后，抗原特異性免疫球蛋白的類別轉(zhuǎn)換在歷史上也是低效的，僅一部分經(jīng)免疫動物顯示抗原特異性IgG應答(2004，Traggiai等，Science 304:104-107 ；2002, Ito 等，Blood 100:3175-3182 ；2005, Ishikawa 等，Blood106:1565-1573 ；2005,Shultz 等，J Immunol174:6477-6489 ；2009,Watanabe 等，IntImmunol 21:843-858 ；2010, Becker 等，PLoS ONE 5) o 這些研宄包括 NSG 和 BALB/cRAG2+y廣小鼠和不同佐劑/抗原組合。
[0009]本領域中需要能夠支持和維持人造血細胞移入的人源化非人動物。本發(fā)明解決本領域中沒有得到滿足的這種需要。
[0010]發(fā)明概述
[0011]一般而言，本發(fā)明涉及表達人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA或人TPO中至少一種的經(jīng)遺傳修飾的非人動物及其使用方法。如此，在一個實施方案中，本發(fā)明是經(jīng)遺傳修飾的非人動物，其包含基因組，該基因組包含編碼下組中至少一種的至少一種核酸:人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人ΤΡ0，其中所述至少一種核酸與啟動子可操作連接，且其中所述動物表達至少一種選自下組的多肽:人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人ΤΡ0。在另一個實施方案中，本發(fā)明是經(jīng)遺傳修飾的非人動物，其包含基因組，該基因組包含編碼人M-CSF的核酸、編碼人IL-3的核酸、編碼人GM-CSF的核酸、編碼人SIRPA的核酸和編碼人TPO的核酸，其中編碼人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人TPO的核酸中每種與啟動子可操作連接，且其中所述動物表達人M-CSF多肽、人IL-3多肽、人GM-CSF多肽、人SIRPA多肽和人TPO多肽。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物是免疫缺陷的。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物不表達重組活化基因2(1^^-2+)。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物不表達IL2受體γ鏈(γ鏈_勺。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物不表達Rag-2，并且經(jīng)遺傳修飾的非人動物不表達IL2受體γ鏈(Rag-2+γ鏈_勺。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物是嚙齒動物。在一些實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物是小鼠。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物還包含至少一種人造血細胞。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物還包含至少一種人癌細胞。在一些實施方案中，人癌細胞是白血病細胞或黑素瘤細胞。
[0012]在另一個實施方案中，本發(fā)明是一種在經(jīng)遺傳修飾的非人動物中移入造血干細胞和祖細胞(HSPC)的方法，其中所述動物表達下組中至少一種:人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人ΤΡ0，所述方法包括下述步驟:對表達下組中至少一種的經(jīng)遺傳修飾的動物施用至少一種HSPC:人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人ΤΡ0。在一些實施方案中，HSPC是人HSPC。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物是嚙齒動物。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物是小鼠。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物是免疫缺陷的。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動物不表達重組活化基因2 (Rag-2V0。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動物不表達內(nèi)源IL2受體(γ鏈+)。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的免疫缺陷非人動物不表達內(nèi)源Rag-2且不表達內(nèi)源γ鏈(Rag-2+γ鏈_勺。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的動物包含人癌細胞。在一個實施方案中，人癌細胞是白血病細胞或黑素瘤細胞。
[0013]在另一個實施方案中，本發(fā)明是經(jīng)遺傳修飾的Rag-2+、γ鏈+小鼠，其具有基因組，該基因組包含編碼下組中至少一種的至少一種核酸:人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人ΤΡ0，其中所述至少一種核酸與至少一種啟動子可操作連接，其中所述小鼠表達至少一種選自下組的多肽:人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人ΤΡ0。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物包含基因組，該基因組具有編碼人M-CSF的核酸、編碼人IL-3的核酸、編碼人GM-CSF的核酸、編碼人SIRPA的核酸和編碼人TPO的核酸，其中編碼人M-CSF、人IL-3、人GM-CSF、人SIRPA和人TPO的核酸中每種與啟動子可操作連接，且其中所述動物表達人M-CSF多肽、人IL-3多肽、人GM-CSF多肽、人SIRPA多肽和人TPO多肽。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物是嚙齒動物。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物是小鼠。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物包含人造血細胞。在一個實施方案中，經(jīng)遺傳修飾的非人動物包含人癌細胞。在一些實施方案中，人癌細胞是白血病細胞或黑素瘤細胞。
[0014]附圖簡述
[0015]在結合附圖閱讀時會更好地理解本發(fā)明的優(yōu)選實施方案的以下詳細描述。為了例示本發(fā)明，在圖中顯示了目前優(yōu)選的實施方案。然而，應當理解本發(fā)明不限于圖中顯示的實施方案的精確排列和手段。
[0016]圖1 (包括圖1A-1E)描繪了實驗結果，其顯示了 MISTRG小鼠支持高水平的人造血移入。通過肝內(nèi)注射100，000個人胎兒肝-(FL-)⑶34+細胞移入經(jīng)X射線預先條件化的指定品系的新生小鼠。在7-9周后在血液中及在10-12周后在BM中測量人移入水平(hCD45+細胞)。(圖1A)指定接受者小鼠的血液和BM中小鼠和人CD45+細胞的頻率的代表性流式細胞術分析。門控區(qū)旁邊的數(shù)字指示總CD45+細胞間的百分比。(圖1B)來自19項獨立實驗的血液移入水平(％h⑶45+細胞)的組合數(shù)據(jù)。在每項實驗中，將單一 FL-⑶34+細胞樣品拆分，并注射入相應品系的小鼠中。每個符號代表一只小鼠個體，并且紅色棒指示均值數(shù)值(n = 56-155 ;ns，不顯著；*p〈0.05Tukey檢驗(關于完全統(tǒng)計學分析，見圖6))。灰色的水平線指示10% hCD45+細胞。(圖1C)來自組(圖6B)的一個代表性小鼠子集(圖6C)的BM中的移入水平(n = 12-16 ;*ρ〈0.05Tukey檢驗;還可見圖6D-6E)。(圖1D)在將200，000個FL-⑶34+細胞肝內(nèi)注射入非照射新生MISTRG小鼠中后3個月血液和BM中的h⑶45 +細胞移入的代表性流式細胞術分析。(圖1E)如(圖1D)中移植的MISTRG小鼠的血液和BM中的人⑶45+細胞移入水平(η = 16) ο在此情況中，顯示了所有小鼠(包括血液h⑶45+〈10%的小鼠)的BM。
[0017]圖2(包括圖2A-2K)描繪了實驗結果，其顯示了 MISTRG小鼠支持淋巴樣和非淋巴樣組織中的有效髓樣發(fā)生和維持。(圖2A)在X射線預先條件化后通過肝內(nèi)注射FL-⑶34+細胞作為新生兒移入的，指定接受者小鼠的血液中的人造血細胞(hCD45+)間的人髓樣細胞(h⑶33+)百分比。每個符號代表一只小鼠個體，并且紅色棒標示均值數(shù)值(η = 20-113 ;圖7Α中顯示了統(tǒng)計學分析)。(圖2Β)相同小鼠中的人WBC組成(η = 20-113只小鼠/組；η = 8名人供體；誤差棒標示SEM)。(圖2C)指定接受者小鼠的非髓樣組織中人髓樣細胞(h⑶68+)的免疫組織學染色。黑色棒代表20 μπι，并且顯示的圖像代表每組分析的至少三只小鼠。(圖2D和圖2Ε)人單核細胞子集的代表性流式細胞術分析(圖2D)和頻率(圖2Ε)，這是通過接受者小鼠的血液中的h⑶45+⑶33+細胞間⑶14和⑶16表達鑒定的(η = 8-12只小鼠/組；誤差棒標示SEM)。(圖2F和圖2G)自MITRG接受者的BM分離并用LPS (圖2F)或R848(圖2G)體外刺激的人單核細胞的細胞因子生成(誤差棒標示一式三份的SD ;代表3項獨立實驗)。(圖2H)MITRG小鼠的血液中存在的人細胞對表達GFP的大腸桿菌的體外吞噬(η = 7)。(圖21、2J、2K)用LPS (圖1 ;90分鐘，η = 15-18)處理的，或用單核細胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(圖 2J ;第 2 天，η = 6-15)或流感 A/PR8H1N1 (圖2Κ ;第3天，η = 3-5)感染的小鼠的血清中通過ELISA或肺中通過RT-PCR測量的體內(nèi)細胞因子生成。(圖2A、2J、2K)通過單因素AN0VA，接著Tukey事后檢驗計算的P值(*p〈0.05)；(圖21)以1glO轉(zhuǎn)化的數(shù)值通過非配對Student t檢驗計算的p值。
[0018]圖3(包括圖3A-3I)描繪了實驗結果，其顯示了 MISTRG小鼠有效支持人NK細胞的發(fā)生和功能。(圖3A)移入NSG、MITRG、和MISTRG小鼠的肝中人IL-15和IL_15Ra mRNA表達的定量RT-PCR分析(η = 7-8 ;通過單因素ANOVA計算的ρ值；*，p〈0.05Tukey事后檢驗)。將表達相對于小鼠Hprt標準化。(圖3B)自移入MITRG的骨髓純化的人細胞群體中人IL-15和IL-15R a mRNA表達的定量RT-PCR分析(η = 4-5,誤差棒標示SEM)。將表達相對于人HPRT標準化，并且相對于hCD14+hCD16_細胞顯示。(圖3C和圖3D)移入NSG、MITRG、和MISTRG中人NK細胞(hNKp46+hCD3-)的代表性流式細胞術分析(對hCD45+mCD45-細胞門控，淋巴細胞門；接近有輪廓區(qū)域的數(shù)字標示細胞的百分比)(圖3C)和絕對數(shù)或頻率(圖3D) (η = 8-16 ;通過單因素ANOVA計算的ρ值；*，p〈0.05Tukey事后檢驗)。(圖3E)來自保持未處理或用脂質(zhì)體包囊的氯膦酸鹽處理連續(xù)3天以消減吞噬細胞的移入MISTRG小鼠的人肝NK(hNKp46+h⑶3_)和T細胞(h⑶3+，作為對照顯示)的絕對數(shù)目(η = 8 ;通過未配對Student t檢驗計算的ρ值；ns，不顯著)。(圖3F)以1:1比率1.V.注射經(jīng)標記的LCL721.221 (HLA I類陰性