一種文冠果豐產(chǎn)高接換冠的分子設(shè)計(jì)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及使用分子識(shí)別技術(shù)設(shè)計(jì)經(jīng)濟(jì)林豐產(chǎn)高接換冠的嫁接方法，屬于生物技 術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國(guó)大面積種植文冠果始于上世紀(jì)60-70年代。"千花一果"導(dǎo)致文冠果的果實(shí)產(chǎn) 量非常低。1999年，我國(guó)文冠果平均畝產(chǎn)油僅為1.67公斤。經(jīng)濟(jì)效益的低下，降低了種植 戶管撫文冠果的積極性，僅上世紀(jì)末，被荒廢和砍伐損失的文冠果達(dá)60萬(wàn)畝，占當(dāng)時(shí)全國(guó) 文冠果的50%以上。
[0003] 為提高文冠果果實(shí)產(chǎn)量和規(guī)?；茝V文冠果優(yōu)良種質(zhì)，我國(guó)學(xué)者研究了嫩枝扦 插、硬枝扦插和根插等文冠果的無(wú)性克隆繁殖方法。穗長(zhǎng)以13_15cm、帶2-3片葉，插前用濃 度為250mg/L的IBA溶液處理，嫩枝扦插文冠果成活率可達(dá)41. 2% (趙國(guó)錦和戴雙，山東農(nóng) 業(yè)科學(xué)，2006,（4) :21-24);隨母株年齡的增大，硬枝扦插的生根率和苗生長(zhǎng)量、根數(shù)、地徑 都會(huì)下降（康國(guó)生和馬明呈，陜西林業(yè)科技，2008,（2) : 18-20)，而使用濃度為100和300mg/ L的IBA及100mg/L的ABT-6處理硬枝后，文冠果平均成活率可達(dá)33. 22% (莫保儒等，甘 肅林業(yè)科技，2014, 39 (1) : 18-21，55);插根長(zhǎng)度10cm，扦插時(shí)用濃度均為250mg/L的NAA、 IBA或ABT溶液處理插條基部30s，生根率可達(dá)92%左右，平均成活率達(dá)82.9% (趙國(guó)錦 和戴雙，山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006,（4) :21-24)。
[0004] 通過(guò)對(duì)常規(guī)嵌芽接、改良嵌芽接和切接方法的比較分析，韓淑賢等發(fā)現(xiàn)采用改良 嵌芽接法，文冠果的嫁接成活率最高達(dá)57. 44%，常規(guī)嵌芽接法次之，成活率為36. 71 %，切 接法最低成活率僅為29. 54% ;改良嵌芽接和常規(guī)嵌芽接法相比，改良嵌芽接將切芽長(zhǎng)度從 Icm提高到2-3cm，可以增加切芽和砧木切口的愈合面積，從而提高嫁接成活率、砧木和接 穗利用率（韓淑賢等，園藝與種苗，2012, 2012 (7) :72-74)。春季帶木質(zhì)芽接、夏季T形芽 接、秋季帶木質(zhì)芽接和春季插皮接的對(duì)比結(jié)果表明：文冠果砧木粗度大于〇. 4cm有利于嫁 接成活率的提高（常月梅和張彩紅，經(jīng)濟(jì)林研究，2013, 31 (2) :154-156)。在嵌芽接中，使 用1000 ppm吲噪丁酸和500ppm a-萘乙酸快速蘸抹接芽有利于提高文冠果嫁接成活率，成 活率可達(dá)94. 32%，保存率達(dá)47. 9-76. 9%，當(dāng)年即可掛果；穗條以0. 3-0. 7厘米為優(yōu)，在4 月初嫁接較好。另外，張桂琴（1984年）開(kāi)展的文冠果芽砧苗嫁接表明：芽砧苗嫁接成活率 達(dá)80 %，一年四季均可開(kāi)展；芽砧苗嫁接的部位為幼嫩組織，接合部位能形成全面的愈合 組織，抗病蟲(chóng)害性強(qiáng)，且可防止后期習(xí)腐病的發(fā)生（張桂琴，特產(chǎn)研究，1984(4) :17-20)。
[0005] 以上研究在一定程度上提高了文冠果林產(chǎn)量，但由于文冠果存在自交不親和，如 果相鄰穗條為自交不親和（SI)的同一基因型，則自交敗育更易發(fā)生，從而造成低產(chǎn)。因此， 只有明晰文冠果種質(zhì)間的親緣關(guān)系并改變文冠果林傳粉格局，其低產(chǎn)問(wèn)題才獲得有效突 破。但是目前還沒(méi)有關(guān)于文冠果種質(zhì)間親緣關(guān)系SSR分析的研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)SSR標(biāo)記檢測(cè)Dice遺傳系數(shù)，再根據(jù)結(jié)實(shí)率和坐果率 選配出最佳授粉組合的Dice遺傳系數(shù)范圍I ;根據(jù)嫁接成活率，選出最適嫁接的Dice遺傳 系數(shù)范圍II，Dice遺傳系數(shù)范圍I和Dice遺傳系數(shù)范圍II的共同部分為最適文冠果種質(zhì) 組合的Dice遺傳系數(shù)范圍；對(duì)此Dice遺傳系數(shù)范圍內(nèi)的文冠果進(jìn)行高異交傳粉設(shè)計(jì)配置， 可有效地降低自交和同株異花授粉發(fā)生率，提高異交傳粉率，從而保證文冠果高產(chǎn)。本發(fā)明 的技術(shù)方案如下：一種文冠果豐產(chǎn)高接換冠的分子設(shè)計(jì)方法，包括以下順序的步驟：
[0007] (1)選擇不同文冠果種質(zhì)，分別提取其DNA ;
[0008] (2)篩選適用于文冠果的SSR標(biāo)記引物；
[0009] (3)利用篩選出的SSR標(biāo)記引物，計(jì)算不同文冠果種質(zhì)間的Dice遺傳系數(shù)；
[0010] (4)將Dice遺傳系數(shù)劃分為8個(gè)級(jí)別；在每個(gè)Dice遺傳系數(shù)級(jí)別內(nèi)，設(shè)計(jì)文冠果 組合；
[0011] (5)根據(jù)步驟（4)設(shè)計(jì)的文冠果組合，以2個(gè)不同文冠果種質(zhì)互為授粉樹(shù)，進(jìn)行人 工授粉；
[0012] (6)根據(jù)步驟（4)設(shè)計(jì)的文冠果組合，進(jìn)行人工嫁接；
[0013] (7)在人工授粉后的第20天統(tǒng)計(jì)并計(jì)算結(jié)實(shí)率，第60天統(tǒng)計(jì)并計(jì)算坐果率；得到 配合力最高的Dice遺傳系數(shù)范圍I ;
[0014] (8)嫁接后第60天統(tǒng)計(jì)并計(jì)算嫁接成活率，得到嫁接成活率最高的Dice遺傳系數(shù) 范圍II ;
[0015] (9)以步驟（7)、步驟⑶得到的Dice遺傳系數(shù)范圍共同部分的文冠果為種質(zhì)材 料，設(shè)計(jì)文冠果豐產(chǎn)高接換冠模式。
[0016] 進(jìn)一步的，所述步驟（1)提取DNA的方法為改良CTAB法。
[0017] 進(jìn)一步的，所述步驟（2)篩選SSR標(biāo)記引物的方法包括如下步驟：
[0018] 1)利用RNA-Seq技術(shù)開(kāi)發(fā)文冠果的SSR標(biāo)記序列；
[0019] 2)采用Primer Premier 5. 0軟件設(shè)計(jì)特異引物：參數(shù)為：引物長(zhǎng)度（20~24nt)、 3'端穩(wěn)定性（-6. 0~-9. Okal/mol)、引物Tm值（55~60°C )、GC含量（45~55% )、引物 rating值> 90。以2個(gè)不同文冠果種質(zhì)的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)聚丙烯酰胺垂 直凝膠電泳結(jié)果，篩選出SSR標(biāo)記引物。
[0020] 進(jìn)一步的，所述步驟（6)嫁接方法為撕皮嵌接法。
[0021] 進(jìn)一步的，所述步驟（9)文冠果豐產(chǎn)高接換冠模式，文冠果的嫁接枝條之間的距 離為0. 45m-0. 81m，文冠果種質(zhì)間的Dice遺傳系數(shù)范圍為0. 651-0. 700。
[0022] 本發(fā)明利用SSR標(biāo)記檢測(cè)不同文冠果種質(zhì)間的Dice遺傳系數(shù)，選配出結(jié)實(shí)率、坐 果率和嫁接成活率均較高的Dice遺傳系數(shù)范圍為：0. 651-0. 700,結(jié)實(shí)率、坐果率和嫁接成 活率分別達(dá)68%、50%和73%以上，再以高異交傳粉配置格局成功實(shí)現(xiàn)文冠果豐產(chǎn)高接換 冠模式，為我國(guó)大面積的低產(chǎn)文冠果林改造提供了豐產(chǎn)高接換冠的技術(shù)基礎(chǔ)。
[0023] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0024] (1)本發(fā)明的分子識(shí)別方法操作簡(jiǎn)單，易推廣擴(kuò)大使用；
[0025] (2)使用本發(fā)明方法提供的分子識(shí)別方法，篩選出Dice遺傳系數(shù)范圍 0. 651-0. 700的授粉組合為最佳，異交授粉的結(jié)實(shí)率、坐果率、嫁接成活率分別達(dá)68%、 50 %和73 %以上，極大的提高了文冠果的結(jié)實(shí)率和坐果率；
[0026] (3)本發(fā)明提供文冠果豐產(chǎn)高接換冠模式，為我國(guó)大面積改造低產(chǎn)文冠果林提供 了豐產(chǎn)高接換冠的技術(shù)基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明，但這不限制本發(fā)明的范圍，實(shí)施例以 阜蒙和通遼文冠果種質(zhì)基地的6個(gè)文冠果品種和50個(gè)文冠果優(yōu)良無(wú)性系為材料。文冠果 品種分別為：文冠 1號(hào)、文冠 2號(hào)、文冠3號(hào)、文冠4號(hào)、中淳1號(hào)和中淳2號(hào)；優(yōu)良無(wú)性系分 別為：FM1、FM2、FM4、FM5、FM6、FM7、FM8、FM10、FM12、FM13、FM14、FM15、FM16、FM17、FM19、 FM21、FM22、FM23、FM24、FM25、FM26、FM27、FM28、FM29、FM33、FM36、FM37、FM40、FM41、FM43、 FM48、FM50 ;NaAc 溶液的濃度為 3mol/L，PH 為 5. 2。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] -、選擇最佳的文冠果授粉組合的Dice遺傳系數(shù)范圍
[0030] (1)以6個(gè)文冠果品種和50個(gè)文冠果優(yōu)良無(wú)性系為材料，利用改良CTAB方法分別 提取其DNA，步驟如下：
[0031] 1)將文冠果葉片10克放入研缽，倒入適量液氮研磨后，移入預(yù)先加有700 μ L 2XCTAB的離心管中，置于65°C水浴處理45~60min，離心（4°C，lOOOrpm，IOmin)得上清 液I ;
[0032] 2)取步驟1)離心管中上清液I 600 μ L于新離心管中，加入總體積為600 μ L的 酸、氯仿和異戊醇混合液（體積比為25 :24 :1)，搖勾后離心（4°C，lOOOrpm，IOmin)得上清 液II ;
[0033] 3)取上清液II 550 μ L于新離心管中，加入500 μ L 10XCTAB，搖勻后置于65°C水 浴中溶解2~3min，再加入總體積為50 μ L的酸：氯仿：異戊醇混合液（體積比