光皮樺植物組織培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及植物無(wú)性繁殖技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 光皮樺（Betula Iuminifera)，又名亮葉樺，其是廣泛分布于我國(guó)亞熱帶地區(qū)的一 種珍貴用材樹(shù)種。光皮樺木材質(zhì)地良好，供制各種器具，可用于家具、航空、軍工等多種用 途。目前林業(yè)生產(chǎn)部門(mén)主要采用種子培育實(shí)生苗造林，實(shí)生苗因?yàn)榛虻亩鄻有裕炝趾笊?長(zhǎng)表型不一，很難達(dá)到群體高產(chǎn)的目的。
[0003] 植物活細(xì)胞具有能夠發(fā)育成為完整植株的潛在能力，稱(chēng)之為細(xì)胞的全能性。植物 組織培養(yǎng)是根據(jù)植物細(xì)胞的全能性原理發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)植物無(wú)性繁殖技術(shù)，在無(wú)菌和人工 控制條件下，對(duì)植物的原生質(zhì)體、細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行離體培養(yǎng)，并控制其生長(zhǎng)發(fā)育，其是 當(dāng)今世界新技術(shù)革命的重要組成部分，為植物學(xué)科的研究及植物生產(chǎn)提供了有效而簡(jiǎn)便的 方法。植物組織培養(yǎng)能為林業(yè)生產(chǎn)中苗木的培育提供有效的無(wú)性繁殖方法。
[0004] 無(wú)性系是某一原始母株通過(guò)無(wú)性繁殖產(chǎn)生的無(wú)數(shù)分株的總稱(chēng)，無(wú)性系苗木因?yàn)榛?因相同，造林后表型均一。采用光皮樺組織培養(yǎng)方法能夠繁殖大量的優(yōu)良無(wú)性系苗木，造林 后可達(dá)到群體高產(chǎn)的目的。
[0005] MS培養(yǎng)基是Murashige和Skoog于1962年為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的，其特點(diǎn)是無(wú)機(jī) 鹽和離子濃度較高，是較穩(wěn)定的離子平衡溶液，它的硝酸鹽含量高，其養(yǎng)分的數(shù)量和比例合 適，能滿足植物細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和生理需要，因而適用范圍比較廣，多數(shù)植物組織培養(yǎng)快速繁殖 用它作為培養(yǎng)基的基本培養(yǎng)基。由于配方中的離子濃度高，在配制、貯存和消毒等過(guò)程中， 即使有些成分略有出入，也不會(huì)影響離子間的平衡。
[0006] 諶紅輝等人（2006)開(kāi)發(fā)了光皮樺葉芽離體培養(yǎng)再生植株技術(shù)，其增殖培養(yǎng)增殖 系數(shù)為3. 2,生根培養(yǎng)的生根率為86%。
[0007] 孫曉敏（2012)建立了光皮樺組織快繁技術(shù)，其使用6-BA和TDZ直接誘導(dǎo)叢生不 定芽分化，并單獨(dú)使用IBA對(duì)不定芽誘導(dǎo)生根。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本申請(qǐng)涉及光皮樺植物組織培養(yǎng)方法，其包括以下步驟：將外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基 中誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到誘導(dǎo)芽；將誘導(dǎo)芽在增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，得到增殖芽；和將所述增殖 芽在包含6-BA、IBA和NAA的生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，得到生根苗。
[0009] 本申請(qǐng)還涉及光皮樺植物組織培養(yǎng)基，其包括誘導(dǎo)培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基和任選地 增殖培養(yǎng)基，其特征在于所述生根培養(yǎng)基包含6-BA、IBA和NAA。
[0010] 本申請(qǐng)另外涉及由本申請(qǐng)所述的培養(yǎng)方法產(chǎn)生的誘導(dǎo)芽、增殖芽或生根苗。任選 地，還涉及由本申請(qǐng)所述的培養(yǎng)方法產(chǎn)生的植物。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1為根據(jù)本申請(qǐng)方法中誘導(dǎo)培養(yǎng)步驟得到的外植體誘導(dǎo)芽。
[0012] 圖2例示了本申請(qǐng)?jiān)鲋撑囵B(yǎng)步驟的效果。
[0013] 圖3為根據(jù)本申請(qǐng)方法中生根培養(yǎng)步驟得到的生根苗。 具體實(shí)施方案
[0014] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝烁倪M(jìn)的用于光皮樺組織培養(yǎng)方法及用于該方法的培養(yǎng)基，以及通過(guò) 該方法產(chǎn)生的植物，其與已知的培養(yǎng)基及方法相比提供了顯著的優(yōu)勢(shì)。本申請(qǐng)利用植物組 織培養(yǎng)方法，采集光皮樺樹(shù)葉芽進(jìn)行無(wú)性繁殖，培育出優(yōu)良無(wú)性系苗木用于生產(chǎn)造林，以提 高林地木材產(chǎn)量。本申請(qǐng)能通過(guò)技術(shù)組裝配套，對(duì)優(yōu)良無(wú)性系苗進(jìn)行工廠化快速繁育，既能 保證按計(jì)劃生產(chǎn)苗木，擺脫樹(shù)木產(chǎn)種量大小年對(duì)苗木的限制，降低苗木生產(chǎn)成本，又能提高 林地木材產(chǎn)量，相對(duì)于傳統(tǒng)的實(shí)生苗培育有著明顯的整體優(yōu)勢(shì)。
[0015] 在第一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝斯馄逯参锝M織培養(yǎng)方法，其包括以下步驟：將外植體 在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到誘導(dǎo)芽；將誘導(dǎo)芽在增殖培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)，得到增殖芽； 和將所述增殖芽在包含6-BA、IBA和NAA的生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，得到生根苗。
[0016] 6-BA，6-芐氨基腺嘌呤，屬于一種安全高效的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，主要用于促進(jìn)細(xì)胞 分裂，促進(jìn)非分化組織分化，促進(jìn)側(cè)芽發(fā)生，防止老化等作用。
[0017] IBA，吲哚丁酸，可誘導(dǎo)根原體的形成，促進(jìn)細(xì)胞分化和分裂，有利于新根生成和維 管束系統(tǒng)的分化，促進(jìn)插條不定根的形成。
[0018] NAA，萘乙酸，能促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大，誘導(dǎo)形成不定根。
[0019] 在一實(shí)施方案中，所述生根培養(yǎng)基包含約0· 15-0. 25mg/L的6-BA、約0· 8-1. 2mg/ L的IBA和約0. 8-1. 2mg/L的NAA。在一實(shí)施方案中，所述生根培養(yǎng)基包含約0. 2mg/L的 6-BA、約 1.0 mg/L 的 IBA 和約 1.0 mg/L 的 NAA。
[0020] 在一實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含6-BA和NAA。在一實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培 養(yǎng)基包含約I. 2-1. 8mg/L的6-BA和約0. 15-0. 25mg/L的NAA。在一實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo) 培養(yǎng)基包含約I. 5mg/L的6-BA和約0. 2mg/L的NAA。
[0021] 在一實(shí)施方案中，所述增殖培養(yǎng)基包含6-BA、IBA和NAA。在一實(shí)施方案中，所述增 殖培養(yǎng)基包含約 〇. 8-1. 2mg/L 的 6-BA、約 0. 15-0. 25mg/L 的 IBA 和約 0. 8-1. 2mg/L 的 NAA。 在一實(shí)施方案中，所述增殖培養(yǎng)基包含約I. 〇mg/L的6-BA、約0. 2mg/L的IBA和約0. lmg/L 的 NAA0
[0022] 申請(qǐng)人根據(jù)長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用MS培養(yǎng)基作為光皮樺培養(yǎng)基的基礎(chǔ)組分，并進(jìn)行 改良。MS培養(yǎng)基的大量元素和微量元素組成如表1所示。
[0023] 表1MS培養(yǎng)基中的大量元素和微量元素配方
[0024]
[0025] 在一實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含約1/4-3/4份的MS培養(yǎng)基中的大量兀素和 約0. 8-1. 2份的MS培養(yǎng)基中的微量兀素。在一實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含約1/2份 的MS培養(yǎng)基中的大量元素和約1份的MS培養(yǎng)基中的微量元素。
[0026] 在一實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包含約1.6-2. 4mg/L的氨基乙酸，約 0· 08-0. 12mg/L的鹽酸硫胺素、約0· 4-0. 6mg/L的鹽酸吡哆醇、約0· 4-0. 6mg/L的煙酸和約 80-120mg/L的肌醇。在一實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含約2mg/L的氨基乙酸，約0.1 mg/ L的鹽酸硫胺素、約0. 5mg/L的鹽酸吡哆醇、約0. 5mg/L的煙酸和約100mg/L的肌醇。
[0027] 在一實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包含約15000_25000mg/L的糖類(lèi)。在一實(shí)施 方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含約20000mg/L的糖類(lèi)。
[0028] 在一實(shí)施方案中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基還包含凝固劑。
[0029] 在一實(shí)施方案中，所述增殖培養(yǎng)基包含約0. 8-1. 2份的MS培養(yǎng)基中的大量元素和 約0. 8-1. 2份的MS培養(yǎng)基中的微量元素。在一實(shí)施方案中，所述增殖培養(yǎng)基包含約1份的 MS培養(yǎng)基中的大量元素和約1份的MS培養(yǎng)基中的微量元素。
[0030] 在一實(shí)施方案中，所述增殖培養(yǎng)基還包含約0.8-1. 2mg/L的氨基乙酸，約 0· 08-0. 12mg/L的鹽酸硫胺素、約0· 4-0. 6mg/L的鹽酸吡哆醇、約0· 4-0. 6mg/L的煙酸和約 40-60mg/L的肌醇。在一實(shí)施方案中，所述增殖培養(yǎng)基包含約lmg/L的氨基乙酸，約0.1 mg/ L的鹽酸硫胺素、約0. 5mg/L的鹽酸批唆醇、約0. 5mg/L的煙酸和約50mg/L的肌醇。
[0031] 在一實(shí)施方案中，所述增殖培養(yǎng)基還包含約25000-35000mg/L的糖類(lèi)。在一實(shí)施 方案中，所述增殖培養(yǎng)基包含約30000mg/L的糖類(lèi)。
[0032] 在一實(shí)施方案中，所述增殖培養(yǎng)基還包含凝固劑。
[0033] 在一實(shí)施方案中，所述生根培養(yǎng)基包含約1/8-3/8份的MS培養(yǎng)基中的大量兀素和 約0. 8-1. 2份的MS培養(yǎng)基中的微量兀素。在一實(shí)施方案中，所述生根培養(yǎng)基包含約1/4份 的MS培養(yǎng)基中的大量元素和約1份的MS培養(yǎng)基中的微量元素。
[0034] 在一實(shí)施方案中，所述生根培養(yǎng)基還包含約0.8-1. 2mg/L的氨基乙酸，約 0· 08-0. 12mg/L的鹽酸硫胺素、約0· 4-0. 6mg/L的鹽酸吡哆醇、約0· 4-0. 6mg/L的煙酸和約 40-60mg/L的肌醇。在一實(shí)施方案中，所述生根培養(yǎng)基包含約lmg/L的氨基乙酸，約0.1 mg/ L的鹽酸硫胺素、約0. 5mg/L的鹽酸批唆醇、約0. 5mg/L的煙酸和約50mg/L的肌醇。
[0035] 在一實(shí)施方案中，所述生根培養(yǎng)基還包含約15000-25000mg/L的糖類(lèi)。在一實(shí)施 方案中，所述生根培養(yǎng)基包含約20000mg/L的糖類(lèi)。
[0036] 在一實(shí)施方案中，所述生根培養(yǎng)基還包含凝固劑。
[0037] 在上述實(shí)施方案中，糖類(lèi)可以為單糖或二糖。在一實(shí)施方案中，所述單糖為葡萄 糖。在一實(shí)施方案中，所述二糖為蔗糖。
[0038] 在上述實(shí)施方案中，所述凝固劑可以為卡拉膠、瓊脂粉或其任選的組合。在一實(shí)施 方案中，凝固劑可以為卡拉膠。在一實(shí)施方案中，所述卡拉膠的量為約5500-8500mg/L。在 一實(shí)施方案中，所述卡拉膠的量為約7000mg/L。在一實(shí)施方案中，凝固劑可以為瓊脂粉。在 一實(shí)施方案中，所述瓊脂粉的量為約4000-6000mg/L。在一實(shí)施方案中，所述瓊脂粉的量為 約 5000mg/