一種促進(jìn)白菜小孢子胚胎發(fā)生及直接成苗的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及白菜游離小孢子培養(yǎng)方法，特別是一種促進(jìn)白菜小孢子胚胎發(fā)生及直 接成苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白菜rapaL.ssp. )屬典型的十字花科異花傳粉植物， 有顯著的雜種優(yōu)勢(shì)。要利用優(yōu)勢(shì)雜交育種必須先純化親本，傳統(tǒng)的連續(xù)自交方式所需的時(shí) 間較長(zhǎng)，費(fèi)工、費(fèi)力；利用游離小孢子培養(yǎng)方法獲得純合體的時(shí)間只需要一年，即節(jié)省了時(shí) 間，又減輕了工作量，并且通過這種方式培育出的再生植株不僅可以創(chuàng)制出新的育種材料， 而且植株的世代間穩(wěn)定性強(qiáng)，雜種優(yōu)勢(shì)也強(qiáng)。近幾十年國(guó)內(nèi)外一些研究者關(guān)于十字花科蔬 菜游離小孢子培養(yǎng)做了大量工作，致力于優(yōu)化小孢子成胚和胚狀體成苗體系，但目前尚有 許多基因型小孢子的胚胎發(fā)生率低以及胚狀體直接成苗率低，限制了這一技術(shù)在實(shí)際育種 工作中的應(yīng)用范圍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種通過改良白菜游離小孢子培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方促進(jìn)白菜 小孢子的胚胎發(fā)生及直接成苗的方法，以建立高效的白菜游離小孢子培養(yǎng)體系，為育種工 作奠定基礎(chǔ)。
[0004] 本發(fā)明提供的促進(jìn)白菜小孢子胚胎發(fā)生及直接成苗的方法，包括如下步驟： 1.選取白菜小孢子發(fā)育時(shí)期在單核靠邊期至雙核早期的花蕾，此時(shí)花蕾的特征為花瓣 長(zhǎng)度與花藥長(zhǎng)度的比值在1/2~3/4之間，用流水沖洗花蕾2~3次后，將花蕾放入滅過菌 的IOOmL燒杯內(nèi)，用濃度75%乙醇溶液表面滅菌30s，0. 1%取012溶液表面滅菌6~8min， 無菌水洗滌3次，每次5min，再加入10~15mL含130g/L蔗糖的B5液體培養(yǎng)基，用無菌研 棒擠壓花蕾，使小孢子游離出來。將含有小孢子的懸浮液先用300目細(xì)胞篩過濾，再用500 目的細(xì)胞篩過濾，收集濾液于50mL離心管中，1000~1200rpm離心3min。棄上清液，加 入10~15mL含130g/L鹿糖的B5液體培養(yǎng)基，1000~1200rpm離心3min，所得沉淀物 即為純凈的小孢子。
[0005] 2.將游離出純凈的小孢子沉淀物用常規(guī)的NLN培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋培養(yǎng)。在稀釋時(shí) 使細(xì)胞密度保持在IXIO5~2X105個(gè)/mL(用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)），將每5mL小孢子懸浮液分 裝入為60mmX15mm的無菌玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿添加100yL滅菌后的瓊脂糖0. 5g?L\ 活性炭l〇g噸1的混合液；添加用二甲基亞砜（DMSO)溶解過濾滅菌后的不同濃度SAHA(0、 0. 025、0. 050、0. 075、0. 100yM)。用石蠟?zāi)し饪诤?，先?3°C恒溫箱中熱激處理1天，再轉(zhuǎn) 至25°C下靜置暗培養(yǎng)，9~10天后肉眼可見球型胚，連同培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到25°C搖床上暗培養(yǎng)， 搖床轉(zhuǎn)數(shù)為50rpm。
[0006] 3.在接種小孢子后第18天轉(zhuǎn)接胚狀體到添加30g?L1蔗糖，7. 5g?L1瓊脂， 〇.Ig噸1活性炭的MS培養(yǎng)基上，其pH為5. 8~6. 0,高溫濕熱滅菌。接種量為每IOOmL廣 口三角瓶含50mL培養(yǎng)基接種3~5個(gè)胚狀體；于25± 1°C，16h小時(shí)光照/天條件下培養(yǎng)； 15~20天后胚狀體發(fā)育為根、莖、葉明顯健壯的小苗。
[0007] 4.B5培養(yǎng)基配方：pH5. 8~5. 84,溶劑為超純水，溶質(zhì)及其終濃度分別為 (NH4)2SO4 0? 134g?L\KNO3 0? 25g?L\CaCl2 ? 2H20 0? 15g?L\MgSO4 ? 7H20 0? 25g?L\ NaH2PO4 ?H2O0? 15g?L\MnSO4 ? 4H20 0?Olg?L\ZnSO4 ? 7H20 0? 002g?L\H3BO3 0? 003g?L\Na2MnO4 ? 2H20 0? 00025g?L\KI0? 00075g?L\CuSO4 ? 5H20 0? 000025g?L\ CoCl2 ? 6H20 0? 000025g?L\VB1 0?Olg?L\VB6 0?OOlg?L\ 煙酸 0?OOlg?L\ 肌醇 0?Ig?L\Na2EDTA0? 0373g?L\FeSO4 ? 7H20 0? 0278g?L\ 鹿糖 130g?L\ 高溫濕熱滅 菌。
[0008] 5.NLN培養(yǎng)基配方：pH5.8~5.84,溶劑為超純水，溶質(zhì)及其終濃度分別為 Ca(NO3)2 ? 4H20 0? 025g?L\MgSO4 ? 7H20 0? 0625g?L\KNO3 0? 0625g?L\KH2PO4 0? 0625g?L\MnSO4 ? 4H20 0? 0223g?L\ZnSO4 ? 7H20 0? 0086g?L\H3BO3 0? 0062g?L\ KI0? 00083g?L\Na2MoO4 ? 2H20 0? 00025g?L\CuSO4 ? 5H20 0? 000025g?L\CoCl2 ? 6H20 0. 000025g?L\鹽酸硫胺素0. 005g?L\鹽酸吡哆醇0. 0005g?L\肌醇0.Ig?L\煙 酸 0? 005g?L\ 葉酸 0? 0005g?L\ 甘氨酸 0? 002g?L\ 生物素 0? 00005g?L\Na2EDTA 0? 0373g?L\FeSO4 ? 7H20 0? 0278g?L\ 蔗糖 130g?L\ 谷胱甘肽 0? 03g?L\L-絲氨酸 0. Ig?L\L-谷氨酰胺0.8g?L\過濾滅菌。
[0009] 6. MS培養(yǎng)基配方：pH 5. 8,溶劑為蒸餾水，溶質(zhì)及其終濃度分別為MMNO3 1. 65g?L\KH2PO4 0? 17g?L\KNO3I. 9g?L\MgSO4 ? 7H20 0? 37g?L\CaCl2 0? 33g?L\ MnSO4 ? 4H20 0? 0169g?L\H3BO3 0? 0062g?L\Na2MoO4 ? 2H20 0? 00025g?L\CuSO4 ? 5H20 0? 000025g?L\CoCl2 ? 6H20 0? 000025g?L\KI0? 00083g?L\ZnSO4 ? 7H20 0? 0086g?L1 ，鹽酸硫胺素〇. 〇〇〇4g?L\鹽酸吡哆素0. 0005g?L\煙酸0. 0005g?L\肌醇0.Ig?L\ 甘氨酸 〇? 〇〇2g?L\Na2EDTA0? 0373g?L\FeSO4 ? 7H20 0? 0278g?L\ 蔗糖 30g?L\ 瓊脂 5. 5g?L\活性炭0.Ig?L\高溫濕熱滅菌。
[0010] 本發(fā)明的積極效果： 1.通過在胚狀體誘導(dǎo)階段在NLN誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.025yM~0.IOyMSAHA，促進(jìn)了 白菜的小孢子胚胎發(fā)生，比對(duì)照提高了 1. 42 ~ 4. 35倍。
[0011] 2.從接種白菜小孢子到獲得再生植株只需要35天左右，添加0.IOyMSAHA的NLN 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中產(chǎn)生的胚狀體，直接成苗率最高，達(dá)到了 87. 30%，添加0. 05yMSAHA的NLN誘 導(dǎo)培養(yǎng)基中產(chǎn)生的胚狀體，直接成苗率，達(dá)到了 75. 01%，比對(duì)照提高了I. 11~1. 50倍。
[0012] 3.操作簡(jiǎn)單易行，只需在誘導(dǎo)階段加入特定濃度的組蛋白去乙?；敢种苿┮灰?辛二酰苯胺異羥肟酸（SAHA)，既可以對(duì)白菜小孢子的胚發(fā)生產(chǎn)生促進(jìn)作用，又可以對(duì)胚狀 體成苗產(chǎn)生促進(jìn)作用。
【附圖說明】
[0013] 圖1為白菜博雅品種NLN培養(yǎng)基中加入0. 075yMSAHA產(chǎn)生的胚狀體； 圖2為接種到MS培養(yǎng)基上的胚狀體； 圖3為胚狀體直接成苗。
【具體實(shí)施方式】
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