鐵皮石斛組培快繁方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鐵皮石斛組培快繁方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵皮石斛(學(xué)名:Dendrobiumofficinale)，又稱(chēng)黑節(jié)草，屬于氣生蘭科草本植物附生蘭類(lèi)，石斛可分為黃草、金釵、馬鞭等數(shù)十種，鐵皮石斛為石斛之極品，它因表皮呈鐵綠色而得名。野生鐵皮石斛只生長(zhǎng)在懸崖峭壁上的陰面崖縫間或者原始森林的大樹(shù)上，且對(duì)溫度、濕度、光照等小氣候的要求近乎苛刻，每年植株只分枝一次，長(zhǎng)約一寸，至少要2-3年才能采收。是傳統(tǒng)的名貴中藥材，《本草綱目拾遺》中說(shuō)石斛“清胃除虛熱、生津，已勞損。以之代茶，開(kāi)胃健脾。在臨床上，石斛多用于治療陰傷津虧、口干煩渴、食少干嘔、病后虛熱，以及目暗不明等癥。
[0003]鐵皮石斛的種子極細(xì)小，胚胎發(fā)育不完全，無(wú)胚乳組織，在自然狀態(tài)下發(fā)芽率極低。加之長(zhǎng)期以來(lái)掠奪性的采挖，致使野生的鐵皮石斛資源已近枯竭，處于瀕危狀態(tài)?，F(xiàn)仍存在種源混亂，種植技術(shù)參差不齊，規(guī)范化水平低，仿野生種植面積小，產(chǎn)品質(zhì)量難以保證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是公開(kāi)一種鐵皮石斛組培快繁方法，以解決鐵皮石斛種苗的問(wèn)題，為發(fā)展鐵皮石斛的人工種植提供基礎(chǔ)條件。
[0005]鐵皮石斛組培快繁方法，包括初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根壯苗培養(yǎng)，具體步驟如下:
一、初代培養(yǎng):
(1)、種子培養(yǎng)
a、果實(shí)采集，8?9月份采集成熟沒(méi)有裂開(kāi)的蒴果；
b、滅菌，在無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面滅菌，用70%的酒精擦洗蒴果表面，再用0.1%的升汞浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗6次；
c、播種，用無(wú)菌濾紙吸去蒴果表面水分、切開(kāi)果皮，將粉末狀種子均勻播撒在培養(yǎng)基表面或?qū)⒎N子直接撒在無(wú)菌水中搖勻，再用無(wú)菌吸管取此混合液置于無(wú)菌培養(yǎng)基上；
d、培養(yǎng)條件，光照強(qiáng)度為1600?2000LX，光照時(shí)間10h/d，培養(yǎng)溫度25±2°C；
(2)、莖尖、幼莖培養(yǎng):
a、莖尖或幼莖采集，選擇長(zhǎng)勢(shì)、性狀良好，無(wú)病蟲(chóng)的莖尖或帶腋芽的幼莖，，用自來(lái)水沖洗、洗滌劑洗凈；
b、滅菌，在無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)用70%的酒精浸泡30秒鐘，再用0.1%升汞溶液浸泡15分鐘，之后用無(wú)菌水沖洗至少6次；
C、接種，將滅菌的莖尖用無(wú)菌濾紙吸去表面水分，并切割成3?5mm長(zhǎng)并帶有一個(gè)節(jié)的莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；
(3)、原球莖、側(cè)芽誘導(dǎo) a、兩種培養(yǎng)基
A: 1/2MS+BA0.2 ?0.5mg/L+NAA2 ?0.5mg/ L+ 糖 2%+ 馬鈴薯泥 5%+ 香蕉泥 5% ；
B: l/2MS+6_BAlmg/L+NAA0.2mg/ L+ 糖 2%+ 馬鈴薯泥 5%+ 香蕉泥 5%，pH 值為 5.8 ；
b、誘導(dǎo)步驟:1、莖尖、莖段接種到培養(yǎng)基A上進(jìn)行側(cè)芽的誘導(dǎo)，當(dāng)誘導(dǎo)側(cè)芽長(zhǎng)成球型時(shí)，切去鱗片狀葉被和周?chē)兒纸M織；?、或?qū)⑿掳l(fā)的枝切割，反復(fù)培養(yǎng)，接種到B培養(yǎng)基上進(jìn)行原球莖的誘導(dǎo)；ii1、60天后將原球莖分割成小塊繼續(xù)轉(zhuǎn)接到B培養(yǎng)基上，以后每50?60天繼代一次，使原球莖不斷增殖；
二、鐵皮石斛繼代培養(yǎng)
(1)、將初代培養(yǎng)中獲得的原球莖或芽轉(zhuǎn)接到1/2MS+6_BA0.5mg/L+NAA0.2mg/ L+馬鈴薯泥5%+香蕉泥5%+糖2%的培養(yǎng)基上反復(fù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)；反復(fù)轉(zhuǎn)接的次數(shù)由需要的苗量決定；
(2)、接種時(shí)按照苗的生長(zhǎng)情況，依大、中、小分類(lèi)轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)瓶接種的數(shù)量因容器大小而定；
(3)40?60天轉(zhuǎn)接一次；
(4)培養(yǎng)條件:溫度25?27°C，光照8?10h/d光照強(qiáng)度1600?2000LX。
[0006]三、生根壯苗培養(yǎng):
(1)、培養(yǎng)基，1/2MS++NAA0.2mg/ L +6_ΒΙΒΑ0.2mg/ L++ 馬鈴薯泥 5%+ 香蕉泥 10%+ 糖7.5%，pH 值為 5.8 ；
(2)、接種，將繼代培養(yǎng)中高度2?3cm小苗分離成單株，接種到前述生根培養(yǎng)基上；
(3)、培養(yǎng)條件，光照時(shí)間10?12h/d，光照強(qiáng)度:前兩個(gè)月1600?2000LX、以后4000LX，培養(yǎng)溫度25±2°C;當(dāng)生根苗具有5?6片展葉，高度達(dá)6cm，根系正常時(shí)即可出瓶供移栽訓(xùn)化；
(4)、生根苗煉苗訓(xùn)化:
a、煉苗基質(zhì)選擇，用純松樹(shù)皮，規(guī)格大小為0.5X0.5cm,經(jīng)消毒、并噴水充分濕潤(rùn)、發(fā)酵制得，即采用2000倍多菌靈藥液浸泡24小時(shí)，然后堆捂發(fā)酵2?3個(gè)月，做到手握成團(tuán)松手即散。
[0007]b、移栽定植，采用消毒的穴盤(pán)定植，移栽深度控制在不埋到苗的基部。
[0008]C、移栽定植后管理，移栽定植后，澆透定根水，用遮光網(wǎng)遮光80%并根據(jù)空氣溫濕度，葉面噴霧，防止葉面脫水，7天后，以葉面不被灼傷為度，逐步增強(qiáng)光照；白天棚內(nèi)保持27°C，夜間不低于15°C，15天后遮光70%，并補(bǔ)水防止干燥；每周用75%的百菌清600倍液噴霧一次，防病保苗。
[0009]d、病蟲(chóng)害防治，搞好大棚的溫度濕度調(diào)控及通風(fēng)透氣工作，相對(duì)濕度控制在60%?65%，溫度控制在20°C?30 °C ;對(duì)黑腐病、炭疽病，用75%的百菌清600倍液或25%瑞霉素600倍液，連續(xù)噴2?3次，間隔7?10天；在苗床周?chē)錾曳乐挝伵！?br>[0010]所述的胚培養(yǎng)方法中在培養(yǎng)基上播種方式是:成熟的種子播種于1/2MS+馬鈴薯泥5%的培養(yǎng)基上；未成熟的種子，在培養(yǎng)基中添加外源激素即細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素再播種，或播在1/2MS+NAA00.2mg/L+糖2%+馬鈴薯泥5%+香蕉泥5%的培養(yǎng)基上。
[0011]所述生根苗煉苗訓(xùn)化步驟中還需對(duì)種苗消毒、穴盤(pán)消毒、苗床消毒，種苗消毒采用2000倍多菌靈藥液浸泡10分鐘，穴盤(pán)播種前必須清洗干凈，后采用0.1%高錳酸鉀藥液進(jìn)行消毒；苗床在每育一批種苗后都須采用2000倍多菌靈藥液噴濕透，反復(fù)2 — 3次消毒處理。
[0012]采用初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)(增殖培養(yǎng))、生根壯苗培養(yǎng)三段式培養(yǎng)步驟，即初代培養(yǎng)將鐵皮石斛種子在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成原球莖并進(jìn)一步形成小芽，接著把鐵皮石斛小芽轉(zhuǎn)接于繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)成具有2?3片真葉并帶有I?2條幼根的小苗，再將小苗轉(zhuǎn)移到生根壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)成具有2?3條根、4片葉片、株高多2.5cm、莖粗多0.2cm的商品組培苗，然后將商品組培苗移栽至大棚內(nèi)苗床上的基質(zhì)中并培養(yǎng)至可采收。
[0013]通過(guò)實(shí)施本發(fā)明，種子萌發(fā)率高，芽苗生產(chǎn)快、污染低，商品組培苗粗壯、葉面展開(kāi)、根系發(fā)達(dá)、成活率高；從而實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛種苗快速無(wú)毒繁育的目的，解決種苗稀缺難題。為推廣栽培提供有力的科學(xué)依據(jù)和指導(dǎo)，使瀕危鐵皮石斛資源得到合理開(kāi)發(fā)利用。
【具體實(shí)施方式】
[0014]以下作為本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0015]一、鐵皮石斛初代培養(yǎng):這是整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程的基礎(chǔ)，其目的是對(duì)外植體進(jìn)行表面滅菌、建立無(wú)菌體系，這一階段的效果依外植體的滅菌方法、接種操作手段以及培養(yǎng)基的成分而異。鐵皮石斛無(wú)菌繁殖體系的建立，可通過(guò)兩種方法(蒴果、莖尖或莖段)來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0016]1.種子(胚)培養(yǎng)，鐵皮石斛的果實(shí)為蒴果、內(nèi)部含有極多粉塵細(xì)小的種子(10?30萬(wàn)粒甚至更多)，種子發(fā)育不全僅有一個(gè)簡(jiǎn)單的胚、缺少胚乳組織，自然條件下種子不發(fā)芽或發(fā)芽率極低。a、果實(shí)采集，8?9月份采集成熟種子，還沒(méi)有裂開(kāi)的蒴果。這時(shí)蒴果內(nèi)的種子相互分離容易播種、滅菌，可只對(duì)蒴果進(jìn)行表面滅菌即可。b、滅菌，去除蒴果宿存的花被、果柄，在無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行表面滅菌。用70%的酒精擦洗蒴果表面，再用0.1%的升汞浸泡10分鐘，無(wú)菌水沖洗6次。C、播種，用無(wú)菌濾紙吸去蒴果表面水分、切開(kāi)果皮，將粉末狀種子均勻播撒在培養(yǎng)基表面或?qū)⒎N子直接撒在一定量的無(wú)菌水中搖勻，然后用無(wú)菌吸管取此混合液于無(wú)菌培養(yǎng)基上(此方法播種較均勻、出苗較整齊)。d、培養(yǎng)基，成熟的種子播種于1/2MS+馬鈴薯泥5%的培養(yǎng)基上，不需要添加外源激素。未成熟的種子，培養(yǎng)基需要添加外源激素，可播在1/2MS+NAA00.2mg/L+糖2%+馬鈴薯泥5%+香蕉泥5%的培養(yǎng)基上。e、培養(yǎng)條件，光照強(qiáng)度為1600?2000LX，光照時(shí)間10h/d，培養(yǎng)溫度25±2°C。培養(yǎng)15?20天種子由黃色轉(zhuǎn)綠、呈球形增大，基部有絲狀毛的原球莖；50?60天長(zhǎng)出大量的原球莖及分化出小苗。溫度在25?27°C之間時(shí)，種子萌發(fā)生長(zhǎng)較快；當(dāng)溫度低于15°C時(shí)，即使?jié)M足營(yíng)養(yǎng)條件萌發(fā)率也較低；當(dāng)溫蒂在23?25°C時(shí)原球莖生長(zhǎng)良好、增殖較快。
[0017]2、莖尖、幼莖培養(yǎng)，利用莖尖或幼嫩的帶腋芽的莖段為繁殖材料進(jìn)行培養(yǎng)。種苗可較好保持母株性狀、生長(zhǎng)整齊、長(zhǎng)勢(shì)旺、易于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，對(duì)新品種的選育和擴(kuò)繁是非常有效的方法；但技術(shù)要求高、周期長(zhǎng)、成本高、難度大，選擇適宜的培養(yǎng)基及其方法至關(guān)重要。a、外植體(莖尖或幼莖)采集，選擇長(zhǎng)勢(shì)、性狀良好，無(wú)病蟲(chóng)的莖尖或帶腋芽的幼莖，去除不要的葉、葉鞘等，用自來(lái)水沖洗、洗滌劑洗凈，所述洗滌劑為餐具或水果用的洗滌用品。b、滅菌，在無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)用70%的酒精浸泡30秒鐘，再用0.1%升汞溶液浸泡15分鐘，之后用無(wú)菌水沖洗6次。C、接種，將滅菌的外植體用無(wú)菌濾紙吸去表面水分，并切割成3_5mm長(zhǎng)帶有一個(gè)節(jié)的莖段接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。
[0018]3、原球莖、側(cè)芽誘導(dǎo)，A: 1/2MS+BA0.2_0.5mg/L+NAA2_0.5mg/ L+ 糖 2%+ 馬鈴薯泥5%+ 香蕉泥 5%。B: l/2MS+6_BAlmg/L+NAA0.2mg/ L+ 糖 2%+ 馬鈴薯泥 5%+ 香蕉泥 5%，pH 值為5.8 ;莖尖、莖段接種到培養(yǎng)基A上進(jìn)行側(cè)芽的誘導(dǎo)，當(dāng)誘導(dǎo)側(cè)芽長(zhǎng)成球型時(shí)，切去鱗片狀葉被和周?chē)兒纸M織；也可以將新發(fā)的枝切割，反復(fù)培養(yǎng)，接種到B培養(yǎng)基上進(jìn)行原球莖的誘導(dǎo)。60天后將原球莖分割成小塊繼續(xù)轉(zhuǎn)接到B培養(yǎng)基上，以后每50?60天繼代一次，使原球莖不斷增殖。原球莖不經(jīng)切割在誘導(dǎo)培養(yǎng)基B上培養(yǎng)60天左右，不定芽會(huì)逐漸產(chǎn)生，最后發(fā)育成帶葉幼芽。
[0019]低濃度糖(2%)比較適合分化生長(zhǎng)。培養(yǎng)條件:光照強(qiáng)度為1600?2000LX，光照時(shí)間10h/d,培養(yǎng)溫度25±2°C。
[0020]二、鐵皮石斛繼代培養(yǎng)(增殖培養(yǎng)):這一階段培養(yǎng)目的是繁殖大量有效的芽尖或幼苗，使之?dāng)?shù)量擴(kuò)大，迅速獲得大量的無(wú)菌繁殖體系，達(dá)到組培快繁目的。1、將初代培養(yǎng)中獲得的原球莖或芽轉(zhuǎn)接到1/2MS+6_BA0.5mg/L+NAA0.2mg/ L+馬鈴薯泥5%+香蕉泥5%+糖2%的培養(yǎng)基上反復(fù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，母瓶轉(zhuǎn)接的數(shù)量依生產(chǎn)規(guī)模、生產(chǎn)計(jì)劃而定。2、接種時(shí)按照苗的生長(zhǎng)情況，依大、中、小分類(lèi)轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)瓶接種的數(shù)量因容器大小而定，疏密適中均勻，大小要一致。3、40?60天