一種鐵皮石斛的快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鐵皮石斛的快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵皮石斛又名黑節(jié)草，為蘭科石斛屬多年生的草本植物，生長于海拔高度100~ 3000米的山地，喜溫暖潮濕、半陰半陽的環(huán)境，不耐寒冷。主要分布于安徽、浙江、云南、福建 等地。鐵皮石斛以其新鮮或干燥莖入藥，味甘、性微寒，主要藥效成分為石斛多糖、生物堿和 氨基酸等，具生津、降血糖和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功效，被歷版《中國藥典》所收錄。鐵皮石斛 種子細(xì)小如塵埃，不具胚乳，在自然條件下極難萌發(fā)，加上人為的過度采挖，其資源已瀕臨 滅絕。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種鐵皮石斛的快速繁殖方法，以解決現(xiàn)有技術(shù) 存在的繁殖技術(shù)效率低下的問題。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：
[0005] -種鐵皮石斛的快速繁殖方法，它包括如下步驟：
[0006] (1)將鐵皮石斛蒴果消毒滅菌后剖開，取出鐵皮石斛蒴果種子；
[0007] (2)將步驟（1)中得到的鐵皮石斛種子均勻播撒于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，20~25°C 下暗培養(yǎng)6~8天后，正常培養(yǎng)60~75天，鐵皮石斛種子萌發(fā)成鐵皮石斛幼苗；
[0008] (3)將步驟（2)中得到的鐵皮石斛幼苗接種到原球莖分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)80~ 100,得到鐵皮石斛分化苗；
[0009] (4)將步驟（3)中得到的鐵皮石斛分化苗轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)后90~ 100,得到鐵皮石斛組培苗。
[0010] 步驟（1)中，所述的鐵皮石斛蒴果為15~20周的成熟未開裂蒴果。
[0011] 步驟（1)中，消毒滅菌的方法為：將鐵皮石斛蒴果用水沖洗并自然風(fēng)干后，在超凈 工作臺(tái)內(nèi)于70~75%體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液中浸泡45s，取出后用無菌水沖洗2~3次；再 將蒴果放入0. 1 %質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化汞水溶液中浸泡lOmin，取出后用無菌水沖洗4~6次； 最后用滅菌后的濾紙吸干蒴果表面的水分，用滅菌后的解剖刀從中部取出種子。
[0012] 步驟⑵中，所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基的配方為：MS+0. 2-0. 5mg/L萘乙酸 +0? 5-1. 0mg/L6-芐氨基腺嘌呤+50-100g/L土豆+25g/L蔗糖+6. Og/L瓊脂粉，pH5. 8 ~6. 0。
[0013] 步驟⑵中，所述的正常培養(yǎng)的條件為溫度20~25°C，光照強(qiáng)度為2000~ 2500Lux，光照時(shí)間為10~12h/d。
[0014] 步驟⑶中，所述的原球莖分化培養(yǎng)基的配方為：N6大量元素+MS微量元素+MS有 機(jī)物 +0-1. 〇mg/L 萘乙酸 +50-100g/L 香蕉 +25g/L 鹿糖 +6. Og/L 瓊脂粉，pH5. 8 ~6. 0。
[0015]步驟（3)中，培養(yǎng)條件為溫度20~25°C，光照強(qiáng)度為2000~2500Lux，光照時(shí)間 為 10 ~12h/d〇
[0016] 步驟⑷中，所述的壯苗生根培養(yǎng)基的配方為：N6大量元素+MS微量元素+MS有 機(jī)物+0~1. 〇mg/L萘乙酸+50~100g/L香蕉+0. 5~2. Og/L活性炭+25g/L鹿糖+6. 0g/ L瓊脂粉，pH5.8~6.0。
[0017] 步驟（4)中，培養(yǎng)條件為溫度為20~25°C，光照強(qiáng)度為2000~2200Lux，光照時(shí) 間為10~12h/d。
[0018] 其中，所述的MS培養(yǎng)基的配方為：
[0019] 大量元素：硝酸銨1650mg/L、硝酸鉀1900mg/L、二水合氯化鈣440mg/L、七水合硫 酸鎂370mg/L和磷酸二氫鉀170mg/L ;
[0020] 微量元素：四水合硫酸錳22. 3mg/L、七水合硫酸鋅8. 6mg/L、六水合氯化鈷 0? 025mg/L、五水合硫酸銅0? 025mg/L、碘化鉀0? 83mg/L、硼酸6. 2mg/L、七水合硫酸亞鐵 27. 8mg/L和乙二胺四乙酸二鈉37. 3mg/L ;
[0021] 有機(jī)物：煙酸〇? 5mg/L、鹽酸吡咳醇0? 5mg/L、鹽酸硫胺素0? lmg/L、甘氨酸2mg/L 和肌醇l〇〇mg/L。
[0022] 其中，所述的N6大量元素配方為：硝酸鉀2830mg/L、硫酸銨463mg/L、二水合氯化 ?丐166mg/L、七水合硫酸鎂185mg/L和磷酸二氫鉀400mg/L。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢：
[0024] 利用鐵皮石斛未開裂的蒴果，可以有效的避免其內(nèi)生菌對(duì)組織培養(yǎng)帶來的一些干 擾，降低污染率；利用種子萌發(fā)、繼代培養(yǎng)和壯苗生根三代培養(yǎng)法，大大縮短了育苗周期，降 低了生產(chǎn)成本，且所培養(yǎng)的組培苗苗植株健壯，根系發(fā)達(dá)，成活率高。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0026] 下述實(shí)施例中提到的MS培養(yǎng)基配方為：
[0027] 大量元素：硝酸銨1650mg/L、硝酸鉀1900mg/L、二水合氯化鈣440mg/L、七水合硫 酸鎂370mg/L、磷酸二氫鉀170mg/L ;
[0028] 微量元素：四水合硫酸錳22. 3mg/L、七水合硫酸鋅8. 6mg/L、六水合氯化鈷 0? 025mg/L、五水合硫酸銅0? 025mg/L、碘化鉀0? 83mg/L、硼酸6. 2mg/L、七水合硫酸亞鐵 27. 8mg/L、乙二胺四乙酸二鈉 37. 3mg/L ;
[0029] 有機(jī)物：煙酸〇? 5mg/L、鹽酸吡咳醇0? 5mg/L、鹽酸硫胺素0? lmg/L、甘氨酸2mg/L、 肌醇 l〇〇mg/L。
[0030] 下述實(shí)施例中提到的N6大量元素配方為：硝酸鉀2830mg/L、硫酸銨463mg/L、二水 合氯化媽166mg/L、七水合硫酸鎂185mg/L、磷酸二氫鉀400mg/L。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] -種鐵皮石斛的快速繁殖方法，具體步驟如下：
[0033] 1、將野外采集的20周未開裂成熟蒴果在自來水下沖洗干凈，自然風(fēng)干后，在超凈 工作臺(tái)內(nèi)用75%體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液浸泡45s，取出后用滅菌后的蒸餾水沖洗3次；再將 蒴果在0. 1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化汞水溶液中浸泡滅菌10min，取出后用滅菌蒸餾水沖洗6次， 并不時(shí)攪動(dòng)；最后用用滅菌后的濾紙吸干蒴果表面的水分，用滅菌后的解剖刀從蒴果中部 取出種子。
[0034] 2、將取出的鐵皮石斛種子均勻播撒于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為： MS+0. 5mg/LNAA+l. 0mg/L6-BA+50g/L 土豆 +25g/L 蔗糖 +6. Og/L 瓊脂粉，pH5. 8。在 22°C下， 暗培養(yǎng)7天，7天后改變培養(yǎng)條件，在溫度22°C，光照強(qiáng)度為2000LUX，光照時(shí)間為12h/d的 條件下培養(yǎng)60天。經(jīng)過該階段培養(yǎng)后，鐵皮石斛種子萌發(fā)成幼苗。
[0035] 3、將鐵皮石斛幼苗接種到原球莖分化培養(yǎng)基中，25 °C，光照強(qiáng)度2500LUX，光照 時(shí)間為12h/d下培養(yǎng)90天；在該培養(yǎng)基的配方為：N6大量元素+MS微量元素+MS有機(jī)物 +0. 5mg/LNAA+50g/L香蕉+25g/L蔗糖+6. Og/L瓊脂粉，pH5. 8。經(jīng)過該階段培養(yǎng)后，鐵皮石 斛幼苗生長為分化苗。
[0036] 4、將鐵皮石斛分化苗轉(zhuǎn)接到壯苗生根培養(yǎng)基上，25°C，光照強(qiáng)度2200Lux，光照時(shí) 間12h/d的條件下培養(yǎng)95天。該培養(yǎng)基配方為：N6大量元素+MS微量元素+MS有機(jī)物 +1. 0mg/LNAA+75g/L 香蕉 +2. Og/L 活性炭 +25g/L 鹿糖 +6. Og/L 瓊脂粉，pH5. 8。經(jīng)過該階 段培養(yǎng)后，鐵皮石斛分化苗生長為組培苗。
[0037] 5、經(jīng)過上述培養(yǎng)階段共計(jì)245天，即可得根系健壯、株高蘭8cm，平均直徑蘭0? 3cm 以上的優(yōu)質(zhì)組培苗，經(jīng)過上述三個(gè)階段，每顆重約2g左右的鐵皮石斛蒴果可生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)鐵皮 石斛種苗5萬株以上。
[0038] 實(shí)施例2
[0039] -種鐵皮石斛的快速繁殖方法，具體步驟如下：
[0040] 1、將野外采集的20周未開裂成熟蒴果在自來水下沖洗干凈，自然風(fēng)干后，在超凈 工作臺(tái)內(nèi)用75%體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液浸泡45s，取出后用滅菌后的蒸餾水沖洗3次；再將 蒴果在0. 1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氯化汞水溶液中浸泡滅菌lOmin，取出后用滅菌蒸餾水沖洗6次， 并不時(shí)攪動(dòng)；最后用用滅菌后的濾紙吸干蒴果表面的水分，用滅菌后的解剖刀從蒴果中部 取出種子。
[0041] 2、將取出的鐵皮石斛種子均勻播撒于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為： MS+0. 5mg/LNAA+0. 5mg/L6-BA+50g/L 土豆 +25g/L 蔗糖 +6. 0g/L 瓊脂粉，pH5. 8。在 22°C下， 暗培養(yǎng)7天，7天后改變培養(yǎng)條件，在溫度25°C，光照強(qiáng)度為2000LUX，光照時(shí)間為12h/d的 條件下培養(yǎng)60天。經(jīng)過該階段培養(yǎng)后，鐵皮石斛種子萌發(fā)成幼苗。<