禽類的糖基化的制作方法
【專利說明】禽類的糖基化
[0001] 本申請是2009年1月7日提交的同名發(fā)明專利申請200980102076. 2的分案申請。 [0002]【相關(guān)申請信息】
[0003] 本申請要求2008年1月7日提交的美國臨時申請?zhí)?1/010, 207的權(quán)利，并將其 整體納入作為參考。
[0004] 【背景】
[0005] 某些具有潛在商業(yè)用途的蛋白質(zhì)需要翻譯后修飾，這些修飾可由哺乳動物細胞有 效產(chǎn)生。然而，哺乳動物細胞，如工業(yè)標準中國倉鼠細胞（CH0)，在GMP條件下難以生長，如 果繁殖至商業(yè)目的所需規(guī)模需要大量資源?；趧游锏姆磻?yīng)器系統(tǒng)因為其低成本、低維護 且易于規(guī)模化，是具有吸引力的基于CH0和其它哺乳動物細胞的系統(tǒng)的替代品。然而，治療 性蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，尤其是糖基化，與哺乳動物細胞如CH0細胞相比，在某些動物和植 物中執(zhí)行方式不同。轉(zhuǎn)基因禽類，部分因其高效產(chǎn)卵和產(chǎn)生蛋白質(zhì)的能力，已成功用作治療 性蛋白質(zhì)的生物反應(yīng)器。在一些例子中，發(fā)現(xiàn)與禽類如雞的輸卵管產(chǎn)生的并存儲于卵的蛋 白質(zhì)相連接的糖分子（即寡糖或糖基化結(jié)構(gòu)）具有CH0和人類蛋白質(zhì)相似的基本結(jié)構(gòu)。然 而，輸卵管中產(chǎn)生的某些蛋白質(zhì)中并不出現(xiàn)某些結(jié)構(gòu)性糖元件，這些結(jié)構(gòu)性糖元件對于蛋 白質(zhì)在病人中的生物反應(yīng)性和生物利用度至關(guān)緊要。
[0006] 當卵黃在輸卵管（哺乳動物輸卵管的禽類等價物）中行進時在其周圍形成卵清。 輸卵管中卵清形成的部分叫做輸卵管膨大部（magnum)，由專門負責合成并分泌卵清蛋白質(zhì) 的稱作管狀腺細胞（TGC)的細胞聚集而成。
[0007] 蛋白質(zhì)中的兩類主要的糖基化結(jié)構(gòu)，N-和0-連接的寡糖，由不同的酶的集合合 成。對于產(chǎn)蛋母雞的輸卵管膨大部產(chǎn)生并存儲于卵清中的0-連接的寡糖（也稱作0-聚 糖），寡糖產(chǎn)生所用的酶機器似乎與人〇-聚糖產(chǎn)生所用的類似，因為在人和禽類輸卵管中 產(chǎn)生的寡糖結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)完全相同的糖和連接。
[0008] 母雞卵清N-連接寡糖（也稱作N-聚糖）具有與人中那些某種程度相似的結(jié)構(gòu)， 但通常缺少末端的半乳糖和唾液酸糖。對于某些治療性蛋白，末端的半乳糖和唾液酸也許 對于病人中的生物利用度以及因此產(chǎn)生的效果至關(guān)緊要。
[0009] 末端的唾液酸殘基在母雞輸卵管產(chǎn)生的N-聚糖結(jié)構(gòu)中很少出現(xiàn)或根本不出現(xiàn)， 它掩蓋N-聚糖不被各種凝集素（識別糖分子的受體）識別。末端具有Gal的蛋白質(zhì)可被 肝臟中表達的凝集素結(jié)合并從病人的血液循環(huán)中清除（Ashwell和Morell.Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 41:99-128,1974)。具有含末端GlcNAc的N-聚糖的蛋白質(zhì)，通常 如母雞輸卵管產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或者含末端甘露糖的N-聚糖的蛋白質(zhì)被巨嗜細胞上表達的 凝集素結(jié)合，并導(dǎo)致清除（Schlesinger等，Biochem J 192 :597-606，1980)。這些結(jié)果可導(dǎo) 致蛋白半衰期縮短，并降低效果。
[0010] 有趣的時，雞的其它器官中產(chǎn)生的N-聚糖，如血液中的那些，通常以Gal和 / 或唾液酸結(jié)尾（Ito 等，Rapid Commun Mass Spectrom 20 :3557_65, 2006 ;Raju 等， Glycobiology 10 :477-86.，2000)。因此顯然雞的基因組中包含合成完全唾液酸化N-聚糖 所需的酶的編碼基因。
[0011] 對于來自雞卵清的N-聚糖，一小部分的側(cè)鏈被Gal占據(jù)，這些Gal中的一小部分 帶有唾液酸帽子。對于卵清〇-聚糖，絕大部分的側(cè)鏈帶有唾液酸帽子。在卵清蛋白質(zhì)中 有相當數(shù)量的半乳糖和唾液酸，主要是因為〇-聚糖修飾的卵清蛋白質(zhì)的豐度（Feeney等， J Biol Chem 235:2633-7,1960 ;Feeney等，J Biol Chem 235:2307-11，1960 ;Robinson和 Monsey. Biochem J 147 :55-62,1975)。N-和0-聚糖合成通路共享相同的Gal和唾液酸庫 (Varki，等，《糖生物學(xué)綱要》(Essentials of Glycobiology)，紐約普萊恩維尤，冷泉港實驗 室出版社（Plainview，NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)。因此在 TGC 中 用于聚糖合成的Gal和唾液酸水平很高，并不是限制因素。
[0012] 卵清N-聚糖的結(jié)構(gòu)以及已知有關(guān)哺乳動物中相關(guān)酶的信息提供了關(guān)于產(chǎn)生卵清 N-聚糖結(jié)構(gòu)的細胞機制的線索。在哺乳動物中，N-聚糖合成開始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中多萜醇寡糖前 體的合成，包括GlcNAc殘基和多個甘露糖和葡萄糖殘基。該復(fù)合物與靶蛋白的天冬酰胺相 連接。多種糖苷酶將前體修剪為3個甘露糖和2個GlcNac殘基（稱為核心五糖）。然后 糖苷轉(zhuǎn)移酶將GlcNac、Gal和唾液酸殘基依次加入。在此階段N-聚糖結(jié)構(gòu)的多樣性變得明 顯，可能是由于各種糖基轉(zhuǎn)移酶的胞內(nèi)水平以及糖基轉(zhuǎn)移酶間對于生長的N-聚糖側(cè)鏈上 自由接受位點的競爭（Varki，等《糖生物學(xué)綱要》（Essentials of Glycobiology)，紐約普 萊恩維尤，冷泉港實驗室出版社（Plainview, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1999)〇
[0013] 從GlcNac開始，至少有6種N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶（GnTs)負責將GlcNAc加入 到N-聚糖的三甘露糖基。卵清N-聚糖的高水平分支表明所有6種GnTs可在母雞輸卵管 細胞中某種程度表達。
[0014] 半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（如，0 1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶），本文稱為GalT，是一個具有至少 7個成員的家族，它們在N-和0-聚糖形成中扮有獨特以及重疊的角色。GalTl(l型）被 認為負責將Gal加入到N-聚糖上所有連接的GlcNac殘基中（Lee等，J Biol Chem 276: 13924-34, 2001)。該家族的其它成員，尤其是2型和3型，被認為能夠催化這種轉(zhuǎn)移，盡管 它們在N-聚糖合成中的實際作用看起來很小。GalTl在所有細胞類型中廣泛表達，盡管水 平不同。
[0015] 唾液酸轉(zhuǎn)移酶（SialT)家族催化唾液酸加入到Gal或N-乙?；肴樘前?(GalNac)(在0-連接聚糖的情況下）以及其它受體中。關(guān)于N-和0-聚糖，通過a 2, 3或 a 2, 6連接加入唾液酸，取決于所參與的具體SialT。人N-聚糖可具有a 2, 3和a 2, 6連 接之一或二者兼有。CH0-產(chǎn)生的N-聚糖僅具有a 2, 3連接，因為缺少a 2, 6SialT的表達 (Lee等，J Biol Chem 264 :13848-55,1989)。卵清N-聚糖和0-聚糖也似乎僅通過a 2, 3 連接進行連接。
[0016] a 2, 3SialT家族有6個成員。1和2型參與0-聚糖合成，因為它們使用Gal-GalNAc 鏈作為受體。3、4和6型顯然將唾液酸加入到Gal-GlcNac鏈末端，可能參與N-聚糖和0-聚 糖合成。5型似乎不參與0-聚糖或N-聚糖合成，但是可能參與將唾液酸加入到含神經(jīng)酰 胺的化合物中（Harduin-Lepers 等，Biochimie 83:727_37,2001)。除了在雞胚中對于 1 型（SialTl)進行表達分析外，對于禽類a2,3SialT家族所知甚少（Kurosawa等，Biochim Biophys Acta 1244 :216_22,1995)。
[0017]目前估計在卵清聚糖最后（即末端）或次末（即，倒數(shù)第二）位置的Gal水平少 于約10%和末端唾液酸的水平少于約2%。所需的是在輸卵管組織如輸卵管膨大部組織中 產(chǎn)生糖基化蛋白質(zhì)的鳥類，在該部位大量半乳糖和/或唾液酸加入到N-連接寡糖中。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0018] 已發(fā)現(xiàn)TGC中不表達參與Gal轉(zhuǎn)移到N-聚糖的關(guān)鍵酶。這一點尤為顯著，因為 唾液酸僅通過Gal殘基與N-聚糖連接。已發(fā)現(xiàn)表達將唾液酸轉(zhuǎn)移至N-聚糖上Gal的酶， 但是其水平似乎避免了有效的唾液酸化。這些發(fā)現(xiàn)部分導(dǎo)致了產(chǎn)生治療性蛋白質(zhì)（如，人 治療性蛋白質(zhì)）的轉(zhuǎn)基因禽類的發(fā)明，所述治療性蛋白具有含更完整的末端唾液酸殘基和 Gal (如次末Gal)殘基的補充物的寡糖結(jié)構(gòu)（如N-連接的寡糖結(jié)構(gòu)）。本文中通常將這些 鳥類稱為"轉(zhuǎn)基因-增強糖基化"鳥類。
[0019] 本發(fā)明包括基因組中含有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因禽類（如轉(zhuǎn)基因雞），所述基因組包含 所表達的糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列。本發(fā)明還包括產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因禽類的方法。所述輸卵管組織， 例如轉(zhuǎn)基因禽類的輸卵管膨大部組織（如管狀腺細胞）可產(chǎn)生蛋白質(zhì)（如，外源性蛋白質(zhì)， 例如治療性蛋白質(zhì)），所述蛋白質(zhì)含有與至少一種轉(zhuǎn)基因不存在時不會出現(xiàn)的糖相連接的 N-連接寡糖。本發(fā)明還包含具有本文所公開的修飾的寡糖形式的蛋白質(zhì)。
[0020] 在一個實施方式中，所述糖基轉(zhuǎn)移酶是N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶，例如，N-乙酰葡 糖胺基轉(zhuǎn)移酶3,并且糖是N-乙酰葡糖胺。
[0021] 在另一實施方式中，所述糖基轉(zhuǎn)移酶是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（如，1型半乳糖基轉(zhuǎn)移 酶），并且糖是半乳糖。在一個實施方式中，在轉(zhuǎn)基因-增強半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（如1型半乳 糖基轉(zhuǎn)移酶）鳥類的輸卵管中產(chǎn)生的外源性蛋白質(zhì)（如治療性蛋白質(zhì)）可作為加入唾液酸 的底物。例如，使用熟知的體外方法將唾液酸連接于通過輸卵管中重組或外源性半乳糖基 轉(zhuǎn)移酶加入的Gal上。
[0022] 在另一實施方式中，所述糖基轉(zhuǎn)移酶是唾液酸轉(zhuǎn)移酶（如3型唾液酸轉(zhuǎn)移酶），并 且糖是唾液酸。
[0023] 在一個實施方式中，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因禽類的輸卵管組織的細胞在卵清存在時分泌蛋 白質(zhì)。
[0024] 在一個實施方式中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因包括至少一個輸卵管特異性啟動子和至少一 部分逆轉(zhuǎn)錄病毒，如LTR。
[0025] 本發(fā)明的一個方面涉及分離或純化具有改變的寡糖形式的蛋白質(zhì)。
[0026] 在一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法，其中所述蛋白質(zhì)對于 禽類是外源性的。該方法包含產(chǎn)生編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因禽類，其中所述禽類 的輸卵管組織產(chǎn)生第二轉(zhuǎn)基因編碼的外源性蛋白質(zhì)，并且具有N-連接寡糖。N-連接寡糖具 有與其連接的半乳糖和唾液酸中的至少一個，其中所述寡糖在編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因不 存在時不與半乳糖和/或唾液酸連接。
[0027] 本發(fā)明包括含有轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因禽類，所述轉(zhuǎn)基因具有合成寡糖結(jié)構(gòu)所涉及的酶 的編碼序列，所述寡糖結(jié)構(gòu)在雞輸卵管組織如膨大部分（管狀腺細胞）中出現(xiàn)的量相對較 低。例如，在輸卵管組織中所述酶出現(xiàn)的量少于鳥類其它組織中出現(xiàn)的量。例如，該酶在輸 卵管組織中的含量可能小于禽類其它組織如肝和腎組織中平均含量的約90%，或者例如， 該酶在輸卵管組織中的含量可能小于禽類其它組織如肝和腎組織中平均含量的約80%，或 者例如，該酶在輸卵管組織中的含量可能小于禽類其它組織如肝和腎組織中平均含量的約 70%，或者例如，該酶在輸卵管組織中的含量可能小于禽類其它組織如肝和腎組織中平均 含量的約60%，或者例如，該酶在輸卵管組織中的含量可能小于禽類其它組織如肝和腎組 織中平均含量的約50%，或者例如，該酶在輸卵管組織中的含量可能小于禽類其它組織如 肝和腎組織中平均含量的約30%，或者例如，該酶在輸卵管組織中的含量可能小于禽類其 它組織如肝和腎組織中平均含量的約20%，或者例如，該酶在輸卵管組織中的含量可能小 于禽類其它組織如肝和腎組織中平均含量的約10%。
[0028] 本發(fā)明還包括含有本發(fā)明轉(zhuǎn)基因的載體。根據(jù)本發(fā)明所使用的載體設(shè)計為將本發(fā) 明的轉(zhuǎn)基因整合入雞的基因組中，并在產(chǎn)生卵清蛋白質(zhì)的輸卵管細胞中表達酶?？墒褂萌?何有用載體產(chǎn)生本發(fā)明的禽類，如轉(zhuǎn)基因-增強糖基化禽類。一些有用的載體包括病毒載 體，如能變成禽類基因組部分（即整合入基因組）的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體，質(zhì)粒和 其它核苷酸序列。
[0029] 其它有用載體如非感染性核酸載體也在本文使用范圍內(nèi)。例如，根據(jù)本發(fā)明定點 DNA整合、整合酶介導(dǎo)的整合和人工染色體也在本文使用范圍內(nèi)。
[0030] 考慮用于本發(fā)明的禽類逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子包括但不限于，禽白血病病毒（ALV)，例 如但不限于狀￥-0、狀￥-1、狀￥-2 ;禽肉瘤病毒仏3￥);禽肉瘤/急性白血病病毒仏31^)，包 括但不限于勞氏肉瘤病毒（RSV);弗吉納米肉瘤病毒（FSV);禽類成髓細胞血癥病毒（AMV); 禽骨髓成紅血細胞增多癥病毒（AEV);禽類髓細胞瘤病病毒（MCV)，例如但不限于MC29 ;網(wǎng) 狀內(nèi)皮組織增殖病毒（REV)，例如但不限于，脾壞死病毒（SNV)。本發(fā)明也考慮使用鼠白 血病病毒（MLV);莫羅尼（Moloney)鼠肉瘤病毒（MMSV);莫羅尼（Moloney)鼠白血病病毒 (MMLV);和慢病毒（如人體免疫缺陷病毒（HIV)、馬感染性貧血病毒（EIAV)、貓免疫缺陷病 毒（FIV)、牛免疫缺陷病毒（BIV)和猿免疫缺陷病毒（SIV)和這些逆轉(zhuǎn)錄病毒的復(fù)制缺陷形 式。通常，本發(fā)明所用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是復(fù)制缺陷型。
[0031] 還可使用其它方法產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因-增強糖基化禽類，其中無需使用感染性DNA產(chǎn)生 種系傳遞，如de Lavoir等，2006年6月8日的Nature第441卷，766-769中所報道的，將 其公開內(nèi)容整體納入本文作參考。
[0032] 在一個實施方式中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因-增強糖基化鳥類，所述鳥類在其基因組 中包含GalTl、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6和/或GalT7的編碼轉(zhuǎn)基因，并在輸卵 管組織，如輸卵管膨大部組織（例如管狀腺細胞）中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，如治療性蛋白質(zhì)，所 述蛋白質(zhì)含有末端位置被半乳糖完全或基本覆蓋的N-聚糖。例如，本發(fā)明產(chǎn)生的外源性蛋 白質(zhì)（如治療性蛋白質(zhì)）具有末端位置約30%被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外 源性蛋白質(zhì)具有末端位置約40%被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具 有末端位置約50%被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有末端位置約 60%被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有末端位置約70%被半乳糖 占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有末端位置約80%被半乳糖占據(jù)的N-聚糖 結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有末端位置約90 %被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例 如，外源性蛋白質(zhì)具有末端位置約95%被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋 白質(zhì)具有末端位置約1〇〇 %被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)。
[0033] 在一個實施方式中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因-增強糖基化鳥類，所述鳥類在其基因組 中包含一種或多種GalTl、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6和/或GalT7的編碼轉(zhuǎn)基因， 并在輸卵管組織，如輸卵管膨大部組織（例如管狀腺細胞）中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，如治療性蛋 白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)含有次末位置被半乳糖完全或基本覆蓋的N-聚糖。例如，本發(fā)明產(chǎn)生的 外源性蛋白質(zhì)（如治療性蛋白質(zhì)）具有次末位置約30%被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者 例如，外源性蛋白質(zhì)具有次末位置約40%被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性 蛋白質(zhì)具有次末位置約50%被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有次 末位置約60 %被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有次末位置約70% 被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有次末位置約80%被半乳糖占據(jù) 的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有次末位置約90%被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié) 構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有次末位置約95%被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如， 外源性蛋白質(zhì)具有次末位置約100%被半乳糖占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)。
[0034]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因-增強糖基化鳥類，所述鳥類在其基因組 中包含一種或多種GalTl、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6和/或GalT7的編碼轉(zhuǎn)基因， 并在輸卵管組織，如輸卵管膨大部組織（例如管狀腺細胞）中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，如治療性 蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)含有末端位置被唾液酸完全或基本覆蓋的N-聚糖。例如，外源性蛋白 質(zhì)具有末端位置約30%被唾液酸占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有末端位 置約40 %被唾液酸占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有末端位置約50 %被 唾液酸占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有末端位置約60 %被唾液酸占據(jù)的 N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有末端位置約70 %被唾液酸占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)， 或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有末端位置約80%被唾液酸占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外 源性蛋白質(zhì)具有末端位置約90%被唾液酸占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具 有末端位置約95%被唾液酸占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)，或者例如，外源性蛋白質(zhì)具有末端位置約 100 %被唾液酸占據(jù)的N-聚糖結(jié)構(gòu)。
[0035]在一個實施方式中，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因-增強糖基化鳥類，所述鳥類在其基因組 中包含一種或多種GalTl、GalT2、GalT3、GalT4、GalT5、GalT6和GalT7的編碼轉(zhuǎn)基因并在 輸卵管組織，如輸卵管膨大部組織（例如在管狀腺細胞中）中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，如治療性蛋 白質(zhì)，其中寡糖中三分之一的GlcNac殘基附連有半乳糖殘基，或者例如，其中寡糖中三分 之二的GlcNac殘基附連有半乳糖殘基，或者例如，其中寡糖中三分之三的GlcNac殘基附連 有半乳糖殘基，或者例如，其中寡糖中四分之一的GlcNac殘基附連有半乳糖殘基，或者例 如，其中寡糖中四分之二的GlcNac殘基附連有半乳糖殘基，或者例如，其中寡糖中四分之 三的GlcNac殘基附連有半乳糖殘基，或者例如，其中寡糖