子導(dǎo)致與沒有攜帶所述遺傳決定子的同基因型黃瓜植物相比，在苗期表現(xiàn)出更 深綠色莖，所述更深綠色莖預(yù)示果實(shí)為更深的綠色，所述方法包括：
[0066] a)使包含本發(fā)明遺傳決定子的植物，該植物的代表性種子保藏號(hào)為NCIMB 41859,與不包含所述遺傳決定子的植物雜交，獲得Fl群體；
[0067] b)任選地將來自Fl的植物進(jìn)行一輪或多輪自交和/或雜交；
[0068] c)選擇包含所述遺傳決定子的植物，所述遺傳決定子導(dǎo)致與沒有攜帶所述遺傳決 定子的同基因型黃瓜植物相比，在苗期表現(xiàn)出預(yù)示著果實(shí)為更深綠色的更深綠色莖，適宜 地通過使用與所述遺傳決定子連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行選擇。還可以通過目測(cè)檢查幼苗莖比不 包含本發(fā)明遺傳決定子的親本植物具有更深的綠色來選擇植物。
[0069] 本發(fā)明另外提供將另一種所需的性狀引入包含本發(fā)明性狀的黃瓜植物的方法，包 括：
[0070] a)使包含遺傳決定子的黃瓜植物與包含另一種所需性狀的第二種黃瓜植物雜交， 所述遺傳決定子導(dǎo)致與沒有攜帶所述遺傳決定子的同基因型黃瓜植物相比，在苗期具有更 深綠色莖，所述更深綠色莖預(yù)示果實(shí)為更深的綠色，其代表性種子保藏在ΜΠΜΒ，保藏號(hào)為 NCIMB41859 ；
[0071] b)選擇包含本發(fā)明性狀的遺傳決定子和所需性狀的遺傳決定子的Fl后代；
[0072] c)使所選擇的Fl后代與任一親本雜交，產(chǎn)生回交后代；
[0073] d)選擇包含所需性狀的遺傳決定子和本發(fā)明性狀的遺傳決定子的回交后代；以 及
[0074] e)任選地重復(fù)步驟c)和d) -次或多次，之后產(chǎn)生所選擇的包含所需性狀和本發(fā) 明性狀的第四代或第五代回交后代。本發(fā)明包括由這種方法生產(chǎn)的黃瓜植物以及由此獲得 的黃瓜果實(shí)。
[0075] 任選地，在任何一次雜交或回交步驟之后進(jìn)行自交步驟?；蛘呖梢栽诒景l(fā)明的任 何一次雜交或自交步驟之后選擇包含本發(fā)明遺傳決定子和所需性狀的植物。
[0076] 在一個(gè)實(shí)施方案中，純合或雜合地包含所述遺傳決定子的本發(fā)明的植物是自交 系、雜交、雙單倍體、或分離群體植物。
[0077] 本發(fā)明進(jìn)一步提供產(chǎn)生包含如本發(fā)明所定義的更深綠色莖的黃瓜植物的方法，所 述方法通過使用雙單倍體產(chǎn)生技術(shù)以產(chǎn)生純合地包含導(dǎo)致更深綠色莖的遺傳決定子的雙 單倍體系，所述雙單倍體系可以與缺乏所述遺傳決定子的系雜交以產(chǎn)生雜合地包含所述遺 傳決定子的本發(fā)明的植物。
[0078] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生包含導(dǎo)致本發(fā)明的更深綠色莖的遺傳決定子的黃瓜植物的方 法，所述方法通過使用在其基因組中包含導(dǎo)致本發(fā)明的更深綠色莖的遺傳決定子的種子， 以培養(yǎng)所述黃瓜植物。所述種子適宜地是保藏在NCHMB的保藏號(hào)為NCHMB 41859的代表性 樣品的種子。
[0079] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生種子的方法，包括培養(yǎng)包含本發(fā)明的遺傳決定子的黃瓜植物， 所述遺傳決定子導(dǎo)致本發(fā)明的表型性狀，使植物產(chǎn)生種子，并收獲那些種子。種子的產(chǎn)生適 宜地通過雜交或自交進(jìn)行。
[0080] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及通過使用組織培養(yǎng)物產(chǎn)生黃瓜植物的方法，所述 黃瓜植物包含更深綠色莖，所述更深綠色莖預(yù)示更深綠的果實(shí)顏色。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通 過營(yíng)養(yǎng)繁殖產(chǎn)生包含本發(fā)明的深綠色莖的黃瓜植物的方法。
[0081] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生包含深綠色莖的黃瓜植物的方法，所述方法 通過使用基因修飾的方法將本發(fā)明的遺傳決定子引入黃瓜植物，所述遺傳決定子導(dǎo)致與沒 有攜帶所述遺傳決定子的同基因型黃瓜植物相比，在苗期有更深綠色莖，所述更深綠色莖 預(yù)示果實(shí)為更深的綠色。
[0082] 本發(fā)明優(yōu)選提供黃瓜植物，所述黃瓜植物與沒有攜帶所述遺傳決定子的同基因型 黃瓜植物相比，在苗期顯示出更深綠色莖，所述更深綠色莖預(yù)示果實(shí)為更深的綠色。
[0083] 本發(fā)明還涉及產(chǎn)生黃瓜果實(shí)的方法，包括培養(yǎng)如本文所述的具有更深綠色莖的黃 瓜植物，并使它們產(chǎn)生黃瓜果實(shí)，并任選地收獲所述果實(shí)。
[0084] 本文中使用的術(shù)語"遺傳決定子（genetic determinant) "和"遺傳決定子 (genetic determinants) "包含一個(gè)或多個(gè)QTLs、基因、或等位基因。這些術(shù)語可以互換使 用。
[0085] 可以通過使用分子標(biāo)記來鑒別遺傳決定子?？梢酝ㄟ^在基因圖譜上進(jìn)行定位，或 者通過指出其在連鎖群或染色體上的位置來鑒別遺傳決定子。當(dāng)遺傳決定子不再與特定的 分子標(biāo)記連鎖時(shí)，它在染色體上的位置，如基因圖譜上所定義的，并不改變，該遺傳決定子 與它和分子標(biāo)記連鎖時(shí)仍然是相同的。因此，它所導(dǎo)致的遺傳性狀也仍然是相同的。
[0086] "遺傳性狀"是由遺傳決定子賦予的性狀或特征。遺傳性狀可以通過表型來鑒別， 例如進(jìn)行生物測(cè)定。但是，無法進(jìn)行表型測(cè)定的植物階段也會(huì)攜帶導(dǎo)致遺傳性狀的遺傳信 息?？梢允褂?性狀"或"表型性狀"而不是"遺傳性狀"。
[0087] 在不存在分子標(biāo)記時(shí)，或者在遺傳決定子和所述標(biāo)記發(fā)生重組，使得所述標(biāo)記不 再具有預(yù)測(cè)性的情況下，可以通過等位性測(cè)試來確定遺傳決定子的等同性。為了進(jìn)行等位 性測(cè)試，將對(duì)于已知的本發(fā)明的決定子為純合的測(cè)試植物與對(duì)于其遺傳決定子也是純合的 待測(cè)材料進(jìn)行雜交，當(dāng)在雜交的F2中不存在所要觀察的性狀的分離時(shí)，證明遺傳決定子是 等同或是相同的。
[0088] 當(dāng)多于一種基因負(fù)責(zé)某一性狀時(shí)，進(jìn)行等位性測(cè)試來確定等同性，進(jìn)行測(cè)試的技 術(shù)人員必須確保所有的相關(guān)基因都是以純合方式存在的，以使得測(cè)試正確地起作用。
[0089] 保藏
[0090] 包含本發(fā)明的遺傳決定子和表型性狀的黃瓜（Cucumis sativus) EX5004 的種子于 2011 年 8 月 31 日保藏在 NCIMB Ltd, Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA，UK，保藏號(hào)為 NCIMB 41859。
[0091] 保藏的種子不符合獲得植物新品種保護(hù)所要求的DUS標(biāo)準(zhǔn)，因此，不能被視為是 植物新品種。
[0092] 本發(fā)明在下述的實(shí)施例中進(jìn)行進(jìn)一步說明。
[0093] 標(biāo)記信息
[0094] 用于AFLP標(biāo)記的引物是標(biāo)準(zhǔn)化的，其結(jié)合的序列可以在例如下述網(wǎng)站找到： ttp://wheat. pw. usda. gov/ggpages/keygeneAFLPs. html〇
[0095] 附圖
[0096] 圖I :黃瓜深色莖和正常莖的比較照片。植物11AF. 873具有正常莖；植物 11AF. 874具有深色莖，以及植物11AF. 875是雜交的Fl (深色莖X正常莖）。
[0097] 圖2 :黃瓜苗莖中的葉綠素測(cè)定
[0098] 圖3 :收獲時(shí)和貯存后的平均黃瓜果實(shí)顏色
[0099] 圖4 :收獲時(shí)和貯存后外皮中的葉綠素含量 實(shí)施例
[0100] 實(shí)施例1
[0101] 本發(fā)明的表型特征
[0102] 為了獲得具有提高的耐貯性的黃瓜果實(shí)，一個(gè)方面是改良果實(shí)的顏色，其中更深 綠色的果實(shí)顏色是有利的。然而，這是育種中要達(dá)到的一個(gè)復(fù)雜目標(biāo)。
[0103] 在黃瓜育種程序的種質(zhì)中，培育出了一種植物，在發(fā)芽后已經(jīng)過了幾天之后還表 現(xiàn)出不尋常的深色苗莖。在隨后對(duì)植物的培育過程中監(jiān)測(cè)該表型性狀。隨后的植物莖，包 括主莖，和葉的莖、或葉柄以及后來果實(shí)的莖，看來都顯示出不尋常的深色。
[0104] 決定研究深綠色莖是否存在與果實(shí)顏色相關(guān)潛在的益處，預(yù)期其與葉綠素含量的 提高有關(guān)聯(lián)。令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出更深綠色的莖顏色的植物也會(huì)具有更深綠色的果實(shí) 顏色。之前從未發(fā)現(xiàn)在黃瓜的果實(shí)和莖的顏色之間有關(guān)聯(lián)。
[0105] 將包含更深綠色莖顏色的植物與具有正常莖顏色的植物進(jìn)行雜交，以觀察遺傳。 清楚的是，F(xiàn)l也表現(xiàn)出更深的莖顏色，其證明了該性狀的表型的顯性遺傳（圖1)。還比較 了所述植物的果實(shí)，更深綠色的果實(shí)顏色的遺傳也證明是顯性的。
[0106] 在Fl植物自交之后，來自F2和后代的隔離數(shù)據(jù)與該性狀存在單性決定子相符。
[0107] 實(shí)施例2
[0108] 本發(fā)明的生物化學(xué)特征
[0109] 分析實(shí)施例1中培育的幼苗莖的葉綠素含量。為了得到可靠的比較，對(duì)純合地包 含所述性狀的不同植物進(jìn)行測(cè)量，對(duì)遺傳上相同但缺乏本發(fā)明的遺傳決定子的同基因型系 進(jìn)行比較。
[0110] 分析證明更深綠色的苗莖是葉綠素含量提高的結(jié)果。存在的兩種葉綠素組分，葉 綠素 a和葉綠素 b，均提高，導(dǎo)致總?cè)~綠素含量的顯著提高（圖2)。
[0111] 還測(cè)量了 Fl苗莖的葉綠素含量。這表明在苗莖中，該生物化學(xué)特征也作為完全顯 性的性狀遺傳。與正常莖顏色相比葉綠素含量的提高是明顯存在的，并且甚至略高于其中 遺傳決定子以純合方式存在的親本的含量。
[0112] 而且，還對(duì)莖中葉綠素含量提高的植物的果實(shí)進(jìn)行了觀察。對(duì)這些植物的更深綠 色果實(shí)的測(cè)量證明其更深的顏色也是果實(shí)外皮中葉綠素含量提高的結(jié)果，并且該特征是顯 性遺傳的。因此在本發(fā)明的植物的果實(shí)和莖的葉綠素含量的提高之間具有明顯的關(guān)聯(lián)。
[0113] 實(shí)施例3
[0114] 本發(fā)明的分子表征
[0115] 從深色莖和正常莖的Fl培育90DH植物群體。最終使用48DH個(gè)體通過群組隔離 分析（Bulk Segregant Analysis, BSA)法來鑒別與該性狀連鎖的AFLP標(biāo)記。一半的個(gè)體 具有深綠色莖的表型，另一半是正常的綠色。群體的兩個(gè)親本都包括在分析中。
[0116] 最初用192個(gè)引物組合（PC' s)使用兩群10個(gè)個(gè)體進(jìn)行篩選。由該篩選，發(fā)現(xiàn)6 個(gè)PC' S在48個(gè)DH個(gè)體上得以驗(yàn)證，獲得了 7個(gè)共顯性評(píng)分的AFLP標(biāo)記。進(jìn)一步分析產(chǎn) 生的AFLP標(biāo)記與本發(fā)明性狀的連鎖關(guān)系。最終，確定有3個(gè)AFLP標(biāo)記與該群體中的深色 莖性狀完全相關(guān)，這些標(biāo)記是 E13/M51-143. 48、E13/M51-154. 68、和 E16/M60-