一種花生網(wǎng)斑病抗病性鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種花生網(wǎng)斑病抗病性鑒定方法,屬于作物抗病性鑒定技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 葉斑病是花生上發(fā)生普遍、危害嚴重的一類病害,主要有花生褐斑病、黑斑病以及 近年新發(fā)生的花生網(wǎng)斑病,其中褐斑病與黑斑病常混合發(fā)生。葉斑病主要在花生生長的中、 后期發(fā)生,嚴重時引起葉片大量提早脫落。受害花生一般減產(chǎn)10~20%,嚴重的達40%以 上。然而化學藥劑對花生葉部病害的防治效果不太理想,防效在60%左右,而種植抗病品種 (系)仍是防治花生葉部病害的有效方法。
[0003] 目前,花生網(wǎng)斑病僅依賴于田間自然發(fā)病進行鑒定,受自然氣候及菌源約束較大, 且年季間差異較大。自然病圃通過人工創(chuàng)造發(fā)病條件和連年重茬種植雖可解決上述問題, 但受場地制約明顯,不能大范圍推廣應用。并且花生網(wǎng)斑病原菌為花生莖點霉,室內(nèi)培養(yǎng) 時在常規(guī)PDA上產(chǎn)孢慢(30天左右)且產(chǎn)孢量少,在燕麥培養(yǎng)基上產(chǎn)孢相對增多,但產(chǎn)孢 時間仍相對較長(20天以上),另外,由于其分生孢子器為埋生或半埋生,取孢難,且產(chǎn)孢量 對于田間接種鑒定來講遠達不到要求。非專利文獻(《花生品種(系)對葉斑病的抗性鑒 定》)公開的一種了人工接種鑒定花生網(wǎng)斑病抗病性的方法,包括:春播花生,每個品種種植 2行,行長15m,每穴2粒,3次重復;田間管理為只澆水,中耕除草,不施用任何殺菌劑;接種 方法為:在室內(nèi)培養(yǎng)基上誘發(fā)花生網(wǎng)斑病菌的分生孢子,制成孢子懸浮液,濃度為15X10 倍鏡下約15個孢子,于7月10日傍晚噴霧接種;8月20日進行病害調(diào)查,每重復隨機調(diào)查 30株,根據(jù)病級數(shù)據(jù)計算病情指數(shù)。然而由于作物品種的抗病性受到栽培、氣象、病原菌致 病性等諸多因素的影響,仍有必要對上述供試品種進行異地鑒定,以驗證其抗病穩(wěn)定性。
[0004]花生育種目標要選擇廣適多抗品種,如能從人工接種方法進行突破,將極大地提 高花生品種對網(wǎng)斑病抗病性選育的效率,加快品種選育進程。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種花生網(wǎng)斑病抗病性鑒定方法,該方法能夠克服網(wǎng)斑病菌 產(chǎn)孢難、產(chǎn)孢慢、產(chǎn)孢量小、取孢難等問題,快速、準確地對育種材料進行網(wǎng)斑病抗病性鑒 定。
[0006]為了實現(xiàn)以上目的,本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
[0007]-種花生網(wǎng)斑病抗病性鑒定方法,包括以下步驟:將花生網(wǎng)斑病病原菌制成菌絲 懸浮液,噴霧接種花生幼苗(苗齡20~40天),待發(fā)病后(一般培養(yǎng)30~40天即可開始 調(diào)查)記錄各植株的病級數(shù)并計算病情指數(shù),評價花生品種對花生網(wǎng)斑病的抗病性。
[0008] 所述菌絲懸浮液的濃度為1.0X10 3~2. 0X103g(菌絲)/mL,菌絲長度100~ 200ym,直徑6~8ym。菌絲懸浮液的制備方法為:將花生網(wǎng)斑病病原菌接種至PDA固體培 養(yǎng)基中(如每皿接3個直徑0. 5cm的菌餅),在溫度25~27°C、光暗周期12h光照/12h黑 暗條件下培養(yǎng)7~10天,刮取菌絲后加水研磨,再加入吐溫-20,混勻即得。吐溫-20的加入 量為研磨菌液總量的0. 1%~0. 2%,其目的為增加菌絲片段或孢子的分散性,以及懸浮液 在葉面上的附著能力。PDA固體培養(yǎng)基為:馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂與水按照質(zhì)量比200:10~ 20:15 ~20:1000 配方。
[0009] 所述鑒定包括室內(nèi)盆栽接種鑒定和田間鑒定,室內(nèi)盆栽接種鑒定的條件為:溫度 20~30°C,濕度95%以上;田間鑒定的條件為:通過灌溉控制環(huán)境溫度20~35°C,濕度控 制以有晨露為準(控制土壤含水量在25 %左右,冠層的相對濕度> 90 % ),接種時選擇無風 或風速小于2m/s的傍晚進行。
[0010] 所述病級數(shù)參照通用的花生葉斑病國際9級標準優(yōu)化改良,病害分級標準如下:
[0011] 〇級:無病斑;
[0012] 1級:病斑面積不超過葉面積的10% ;
[0013] 2級:病斑面積不超過葉面積的20%;
[0014] 3級:葉片無病斑性脫落,病斑面積不超過葉面積的30%;
[0015]4級:葉片脫落不超過總?cè)~片的10 %,病斑面積不超過葉面積的40 %;
[0016]5級:葉片脫落不超過總?cè)~片的25 %,病斑面積不超過葉面積的50 %;
[0017]6級:葉片脫落不超過總?cè)~片的50 %,病斑面積不超過葉面積的60 %;
[0018]7級:葉片脫落不超過總?cè)~片的75 %,病斑面積不超過葉面積的75 %;
[0019] 8級:葉片脫落不超過總?cè)~片的95 %,病斑面積不超過葉面積的95 %;
[0020] 9級:葉片脫落達95%以上,葉片全部有病斑。
[0021] 所述病情指數(shù)的計算公式如下:
[0022] 病情指數(shù)% = 2 (病級值X相應病株數(shù))八調(diào)查總株數(shù)\9)父100。
[0023] 所述抗病性評價標準可采用下述兩種評價標準中的任意一種,當兩種評價標準不 一致時,以病種的級別或指數(shù)為準進行判定。
[0024] 按病級評價標準:0級,免疫(I) ;1級,高抗(HR) ;2級、3級,抗(R) ;4級、5級、6 級,中抗(MR) ;7級、8級,感⑶;9級,高感(HS)。
[0025] 按絕對病指數(shù)(無統(tǒng)一標準):0,免疫;> 0且彡10%,高抗;> 10 %且彡30%, 抗;> 30%且彡70%,中抗;> 70%且彡90%,感;> 90%且彡100%,高感。
[0026] 本發(fā)明的有益效果:
[0027] 本發(fā)明采用花生網(wǎng)斑病菌絲懸浮液接種花生幼苗,能夠克服網(wǎng)斑病菌產(chǎn)孢難、產(chǎn) 孢慢、產(chǎn)孢量小、取孢難等問題,無需等待產(chǎn)孢,可快速、準確地對育種材料進行網(wǎng)斑病抗病 性鑒定。該方法可大量擴繁病原菌絲,不受時限批量生產(chǎn),相較分生孢子鑒定法(目前僅 能做小批量盆栽鑒定,而不能大規(guī)模地應用于田間材料的篩選),周期短,占用資源少,成本 低,操作簡便,適用于室內(nèi)盆栽和田間花生材料的抗病性鑒定,克服了田間自然發(fā)病受氣候 約束,不發(fā)病或發(fā)病不勻的弊端,增加對材料選育的準確性,有利于加快抗病育種進程。
【具體實施方式】
[0028] 下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明,但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0029] 實施例1
[0030] 本實施例中花生網(wǎng)斑病抗病性鑒定方法,包括以下步驟:
[0031] 1)制備花生網(wǎng)斑病菌絲懸浮液
[0032] 將花生網(wǎng)斑病病原菌接種至PDA固體培養(yǎng)基(馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂與水的質(zhì)量 比為200:20:18:1000)上,每個培養(yǎng)皿分散接種3個直徑0. 5cm的菌餅,在26 ±1°C光照培 養(yǎng)箱內(nèi)光暗交替培養(yǎng)(12h光照/12h黑暗)8天,至菌絲長滿整個培養(yǎng)基,刮取菌絲并將其 裝入盛有玻璃珠的2mLPE離心管中,在離心管內(nèi)加入200yL無菌水,于BulletBlender STORM研磨儀(NextAdvance) 8檔研磨45s,鏡檢菌絲長度100~200ym,直徑6~8ym, 取出研磨液并稀釋至菌絲濃度為I. 6X10 3g/mL,按0. 15%加入吐溫-20后搖勻備用;
[0033] 2)接種菌絲并培養(yǎng)
[0034] 將菌絲懸浮液置于IOOmL噴壺中,噴霧接種苗齡20天的花生幼苗(豫花22號,夏 播生育期113天,室內(nèi)盆栽接種15株),整株噴施并采用薄膜罩保濕(12h光照不保濕和