建立可應用于人類疾病研究的雪貂模型的方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物學領域，具體設及一種雪貂促排卵技術和一種雪貂體外受精技 術，W及基于上述方面的利用CRISPR/tas9的技術建立雪貂模型的方法，所述方法可應用 于系統(tǒng)研究人類疾病。
【背景技術】
[0002] 大腦是人類控制認知、記憶、情感和活動的功能器官，某些與大腦發(fā)育相關基因的 缺失或突變直接導致神經疾病的發(fā)生。高等哺乳動物的大腦皮層具有溝和回的結構，運一 結構大大的增加了大腦皮層的表面積，研究表明運與高級認知等大腦功能密切相關。
[0003] 雪貂作為新型實驗動物，已經被廣泛的應用于呼吸道疾病等的研究，但是并沒有 在神經系統(tǒng)發(fā)育中普遍應用。雖然雪貂不屬于靈長類動物，但是它與平滑腦的小鼠相比，雪 貂的大腦具有溝和回的結構，并且是有社會性的動物，因此，應用雪貂作為模式動物，研究 直接大腦發(fā)育型疾病W及精神類疾病的發(fā)病機理和臨床治療等，具有很大的現(xiàn)實意義。此 夕F，雪貂還具有體形小、易飼養(yǎng)、繁殖周期短、一胎多盧的優(yōu)點，是研究神經系統(tǒng)疾病發(fā)病機 理的首選模式動物。
[0004] 雪貂之所W沒有被神經科學研究廣泛應用，其中主要原因是轉基因動物無法實 現(xiàn)。隨著CRISPR/tas9技術的發(fā)展，轉基因動物制備變得相對簡便[1，2]。
[0005] CRISPR/tas9運一編輯基因的技術已經廣泛應用于各種物種，包括小鼠、大鼠、 猴等。W小鼠為例，主要實驗過程如圖1所示，將一個或者多個sgRNA(單向導RNA)和 化s9mRNA注射到受精卵里，sgRNA介導化s9核酸酶在小鼠受精卵的特定基因組位點上進行 切割、修復，導致基因被改變。
[0006] 由于雪貂作為實驗動物并沒有被廣泛應用，鮮有關于轉基因雪貂的報道。雪貂作 為實驗動物的馴化和飼養(yǎng)條件要求比較嚴苛，而且生殖周期等生理習性并沒有非常詳盡 的研究資料，目前已經報道的唯一一例轉基因雪貂，是通過病毒結合核移植的方法獲得的 巧，4]，主要方法過程如圖2所示。正常的雪貂體細胞經過定向基因修飾變?yōu)楦淖冞z傳學特 性的修飾后體細胞，然后在成熟的雪貂卵母細胞中通過顯微操作的方法用修飾后的體細胞 的細胞核替換卵母細胞的細胞核。核移植后的卵母細胞經過發(fā)育，胚胎的基因就可W得到 相應的改變。
[0007] 然而，一方面，CRISPR/tas9作為新興的技術，從未應用于雪貂運種模式動物；另 一方面，病毒結合體細胞核移植的方法比較復雜，操作性不高，效率低下，只有1-3%，而 且使轉基因動物有可能帶上病毒的風險，此外，目前已經報道的雪貂的超排方案是針對 Marshall化rret的，用于Angora化rret超排效率非常低，卵子不成熟，且無法做到雪貂的 體外受精，無法滿足高效制備轉基因雪貂的要求。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中建立可應用于人類疾病研究的雪貂模型的方法的不足，一 方面提供一種雪貂促排卵技術和一種雪貂體外受精技術，另一方面，在上述基礎上，利用CRISPR/tas9的技術，W3種基因（運S個基因都與神經系統(tǒng)疾病相關，一個是平滑腦癥、一 個是頭小崎形癥、一個是精神分裂癥）為例，建立可應用于神經系統(tǒng)疾病研究的雪貂模型 的方法，并將其用于相關疾病的致病機理研究，相關藥物的篩選和安全性評價，W及臨床手 術治療研究的模式動物。
[0009] 本發(fā)明首次應用PMSG，F(xiàn)甜和HCG聯(lián)合超排卵方法結合體外受精技術，使得轉基 因雪貂的制備工作可W在盡量少的耗損實驗動物的基礎上順利開展。在取得的雪貂受精卵 中，本發(fā)明首次應用CRISPR/tas9技術，對受精卵的特定的與神經系統(tǒng)疾病直接相關的基 因，包括化X，Aspm，Disci進行編輯，從而最終導致運S個基因突變，無法正常行使該基因 的生物學功能，獲得類似于人類由于運=個基因突變而導致的神經系統(tǒng)疾病。
[0010] 具體而言，本發(fā)明包括W下方面：
[00川 1. 一種促進雪貂排卵的方法，所述方法使用PMSG(Pre即antMareSerum Gonadotropin)、FSH(FoilitropinAlfa)和HCG化umanChorionicGonadotropin)耳關合進 行。
[001引 2.根據第1項所述的方法，所述方法包括W下步驟：
[0013] 1)給母貂腹腔注射PMSG，優(yōu)選注射200-300單位，更優(yōu)選300單位；
[0014] 2) 24-48小時后，肌肉注射第一針FSH，此后連續(xù)注射8-10天FSH，每次的F甜注射 量優(yōu)選為5-10單位，更優(yōu)選為10單位；
[0015] 3)如果外陰腫脹，顏色由紅變白則腹腔注射HCG，HCG的注射量優(yōu)選為200-300單 位，更優(yōu)選為300單位；
[0016] 4)取卵，取卵時間優(yōu)選在HCG注射后40-48小時，更優(yōu)選為HCG注射后48小時。
[0017] 3.根據第2項所述的方法，第1)步和第2)步之間間隔48小時。
[001引 4.根據第2項所述的方法，F(xiàn)甜的注射為每天兩次，間隔12小時。
[0019] 5. -種雪貂體外授精方法，所述方法包括：
[0020] 1)取卵：手術取得雪貂的輸卵管，用預熱的肥ZB培養(yǎng)液經輸卵管傘口沖出卵丘卵 母細胞復合體，用透明質酸酶消化成無卵丘細胞的單個卵母細胞，放入38. 5°C，5%C〇2預平 衡3小時的IVF培養(yǎng)滴中備用；
[0021] 2)體外受精：將公貂經附睪尾取出精液馬上放入步驟1)中獲得的含有卵母細胞 的IVF培養(yǎng)滴中，共解育，完成體外受精。
[002引 6.根據第5項所述的方法，所述共解育時間為3-4小時。
[0023] 7.根據第5項所述的方法，所述肥ZB培養(yǎng)液的組成為：81. 62mM氯化鋼，4. 83mM 氯化鐘，1. 18mM憐酸二氨鐘，1. 18mM硫酸儀，5mM碳酸氨鋼，1. 7mM二水合氯化巧，31. 3mM 乳酸鋼，0. 27mM丙酬酸鋼，20mMH巧es,ImM谷氨酷胺，0.ImM邸TA2化，5. 5mM葡萄 糖，0. 007%PVA，1N鹽酸。
[0024] 8. -種建立雪貂模型的方法，所述方法包括W下步驟：
[0025] 1)針對目的基因設計sgRNA單向導RNA序列，并體外轉錄CAS9mRNA和sgRNA序 列；
[0026] 2)根據1-4任一項所述的方法促雪貂排卵；
[0027] 3)根據5-7任一項所述的方法進行雪貂體外受精；
[0028] 4)將步驟1)獲得的化s9mRNA和目的基因的sgRNA顯微注射入受精卵；
[0029] 5)將步驟4)獲得的受精卵移植入受體進行妊娠；
[0030] 6)鑒定子代轉基因雪貂。
[003。 9.根據第8項所述的方法，所述目的基因選自Aspm,Dcx,Disci。
[0032] 10.根據第8或9項所述的方法用于相關人類疾病研究及針對人類疾病的藥物篩 選和/或安全性評價方面的用途。
[0033] 本發(fā)明首次使用PMSG，F(xiàn)甜和HCG聯(lián)合促排卵，排卵穩(wěn)定高效，達到25-35枚/ 只。而現(xiàn)有技術中僅有的可參考的超排方案是使用PMSG和HCG聯(lián)合超排方案，效率低，卵 不成熟。此外，本發(fā)明首次使用雪貂的體外受精而不需要體外獲能。另外本發(fā)明首次應用 CRISPR/tas9技術制備的轉基因雪貂，相比之前唯一一例應用病毒結合體細胞核移植的方 法，效率提高很多，可W達到80%左右，并且沒有病毒危害性。本發(fā)明的模型可W例如模擬 人由于Dcx基因突變或者Aspm基因突變引起的神經疾病，成為最為合適的疾病模式動物。 而之前已有的化X突變小鼠模型，因小鼠的大腦沒有溝回，故不能復制人的疾病表型。
【附圖說明】
[0034] 圖1.應用CRISPR/tas9技術制備轉基因小鼠示意圖。
[0035] 圖2.通過基因編輯體細胞核結合核移植的方法改變胚胎基因組的示意圖。圖 3.sgRNA的設計，其中對于每個基因設計了 2個sgRNA,其中灰色帶下劃線的GGT/GGA/GGG/ GGC序列為Protospacer-adjacentmotif(PAM)，其余灰色不帶下劃線的為基因干擾革己序 列。
[0036] 圖4.S個不同品系的轉基因雪貂經過T7EN1酶切鑒定，可W被酶切的是基因突變 雪貂，被星號標出。
[0037] 圖5.S個不同品系的轉基因雪貂經過測序分析具體的基因突變位點。與野生型 比較，刪除的堿基用點表示，增加的堿基用小寫字母標注。同時，括號內表示缺失了或者增 加了幾個堿基，W及運種類型的結果在20個檢測中所占數量。
[0038] 圖6.Dcx轉基因雪貂的大腦結構改變。轉基因雪貂大腦皮層變薄、溝回變少、腦室 變大。
[0039] 圖7.Aspm轉基因雪貂的大腦結構改變。轉基因雪貂大腦變小、溝回變淺。
【具體實施方式】
[0040] 實施例1.CRISPR/化s9祀向修飾基因載體構建和體外轉錄
[0041] 1)SgRNA轉錄載體的構建：針對雪貂Aspm(GenBankAccession No:XM_004756200) ,Dcx(GenBankAccessionNo:XM_004769082),Disci(GenBank AccessionN〇:XM_013047589)S個基因，設計了特異的SgRNA序列（圖3)，具體序列參見 表1。
[0042] 表 1
[0043]
[0044] 每2條單鏈核酸序列（表2)退火形成雙鏈DNA，雙鏈DNA連接到 px330(Addgene，42230)載體中。
[0045] 表2.sgRNA克隆引物序列
[0046]
[0047] 2)化s9和SgRNA體外轉錄：利用表3中的引物將T7轉錄子通過PCR方法加入到 化s9和SgRNA的轉錄起始位點，化s9序列和參考文獻凹中一致，PCR產物經過回收凈化， 用mMESSAGEmMACHI肥T7ULTRA試劑盒化ifeTechnologies)進行體外轉錄。轉錄產生的 Cas9mRNA和SgRNA用MEGAclear試劑盒化ifeTechnologies)純化并測量濃度。
[004引表3.連接T7轉錄子引物 [0049]
[0050] 實施例2.雪貂促排卵
[0051] 選擇2-3歲，體重1. 5-2KG，3周左右未發(fā)情經產母貂，腹腔注射300單位 PMSG(Pre即antMareSerumGonadotropin)(寧波S生藥業(yè)），48小時后肌肉注射第一針 FSHO^ollitropinAlfa)(MerckSerono) 10單位，此后連續(xù)注射10天，每天兩次，間隔12小 時，每次10單位，在注射FSH后持續(xù)觀察雪貂發(fā)情情況，如果發(fā)情，則腹腔注射300單位 HCG(HumanQiorionicGonadotropin