一種利用ghrelin促進新生雛雞免疫器官發(fā)育的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及減少新生維雞免疫器官發(fā)育的方法具體設(shè)及一種利用曲relin促進 新生維雞免疫器官發(fā)育的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 一些鳥類包括雞，一出殼就立即攝食，伴隨著食物的攝入，共生菌開始棲息，致病 菌也開始侵入，但其淋己細胞功能發(fā)育成熟發(fā)生在2周W后，加上雞的母源抗體保護力差， 因而各種疾病隨之出現(xiàn)?，F(xiàn)有技術(shù)中主要通過維雞出殼后的一系列方法來提高維雞的免疫 功能，比如：疫苗。然而在維雞免疫器官發(fā)育健全之前，免疫器官對疫苗的免疫應(yīng)答能力較 差，疫苗的效果就大打折扣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種利用曲relin促進新生維雞免疫器 官發(fā)育的方法及應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種利用曲relin減少新生維雞免疫器官發(fā)育的方法，具 體是通過在受精蛋開始解化的第五天至第十五天之間向卵白內(nèi)注射至少一次曲relin溶 液。 陽0化]本發(fā)明的進一步改進包括：
[0006] 所述曲relin溶液的濃度為100-15化g/ul，每次每蛋注射量為0. 1ml。
[0007] 在受精蛋開始解化的第五天和第十五天時，分別向卵白內(nèi)注射一次曲relin溶 液。
[0008] 在受精蛋開始解化的第五天時，每枚蛋注射濃度為l(K)ng/ul的曲relin溶液 0. 1ml〇
[0009] 在受精蛋開始解化的第五天時，每枚蛋注射濃度為15化g/ul的曲relin溶液 0. 1ml〇
[0010] 在受精蛋開始解化的第十五天時，每枚蛋注射濃度為10化g/ul的曲relin溶液 0. 1ml〇
[0011] 在受精蛋開始解化的第十五天時，每枚蛋注射濃度為15化g/ul的曲relin溶液 0. 1ml〇
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于，曲relin在促進新生維雞免疫器官發(fā)育中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明實施方法簡單，通過卵內(nèi)飼喂，能顯著提高雞胚出殼時法氏囊指數(shù)、法氏囊 濾泡面積、法氏囊濾泡內(nèi)PCNA陽性率，能顯著提高雞胚出殼時脾臟指數(shù)、脾臟細胞PCNA光 密度值W及脾臟動脈周圍組織淋己銷
【具體實施方式】
[0014] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做詳細說明。
[0015] 實驗材料與方法
[0016] 1試驗材料
[0017] 1.1實驗動物
[0018] 選用Ross肉雞受精種蛋（新鄉(xiāng)大用有限公司）稱重，挑取重量在65-70g的蛋140 枚，隨機分成7組，每組20枚，分別為Control組（正常解化倍，不做任何處理）、E5-100組、 E5-150組、E5-醋酸組、E15-100組、E15-150組、E15-醋酸組。對各組蛋進行編號，記錄。 解化條件：37. 5 ± 0. 2°C，相對濕度55 ± 2 %。
[0019] 1.2動物處理：卵內(nèi)喂食曲relin
[0020] Control組在整個解化的過程中不做任何處理；
[0021] 65-100組在65胚齡時每枚蛋注射濃度為10化邑/111的曲'61111溶液0.11111;
[0022] 65-150組在65胚齡時每枚蛋注射濃度為150叫/111的曲'61111溶液0.11111，
[0023] E5-醋酸組在E5胚齡時每枚蛋注射醋酸0. 1ml;
[0024] ￡15-100組在￡15胚齡時每枚蛋注射濃度為100叫/111曲'61111溶液0.11111， 陽0巧]￡15-150組在￡15胚齡時每枚蛋注射濃度為15化旨/111曲'61111溶液0.11111。 陽0%] E15-醋酸組在E5胚齡時每枚蛋注射醋酸0. 1ml;
[0027] 曲relin溶液的配方：鼠曲relin粉末，用濃度為0. 1 %醋酸稀釋。
[0028] 卵內(nèi)喂食的具體步驟：E5(開始解化的第五天）胚齡時，通過照蛋器照蛋發(fā)現(xiàn)卵白 的位置在氣室的正下方，E15胚齡時，通過照蛋器照蛋，發(fā)現(xiàn)卵白的位置在氣室的斜下方，標 出注射位點。采用22G針頭卵白注射曲relin溶液，注射后，玻璃紙蠟封注射口，繼續(xù)解化， 此時，解化器搖蛋按鈕關(guān)閉，24小時后，蠟封的口凝固后，重新打開搖蛋按鈕，繼續(xù)解化。
[0029] 1. 3組織取材
[0030] 維雞出殼后新生維雞稱重，記錄。按100mg/lOOg體質(zhì)量烏拉坦麻醉，然后頸椎脫 白處死，其中每組17只雞取脾臟和法氏囊用0. 75%的生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸去多余 的水分，再用萬分之一的分析天平稱重后置于4%的多聚甲醒憐酸緩沖液（PH7. 4)中固定。
[0031] 2試驗方法
[0032] 2. 1石蠟切片制作
[0033] 將固定好的脾臟、法氏囊等組織置于水龍頭下，流水沖洗24小時后置于梯度酒 精脫水（50 %酒精化、60 %酒精化、70 %酒精化、80 %酒精化、90 %酒精比、100 %酒精 I30min、100%酒精II30min)，再放入二甲苯：無水酒精（1:1)I、11各比，最后置于二甲 苯中透明。透明后的組織順次放入蠟I、蠟II各30min，最后放入蠟III比，包埋組織，制作蠟 塊。將組織蠟塊切片機連續(xù)切片，厚度5ym，45 °C水浴展片，拱片，55 °C烤片機烤片，后置于 37 °C電熱恒溫干燥箱內(nèi)24h備用。
[0034] 2. 2常規(guī)肥染色
[0035] (1)將脫蠟處理后的組織切片用蒸饋水洗涂干凈；似蘇木精溶液染色約lOmin; (3)用蒸饋水沖洗去多余的染液，0.5%鹽酸乙醇溶液中l(wèi)-3s(至鏡檢下細胞漿為無色時取 出）；(4)蒸饋水洗涂3次，每次約5min，后自來水藍化20min; (5)依次浸入50 %乙醇溶液、 70%乙醇溶液、85 %乙醇溶液，每級l-2min; (6) 0. 5 %伊紅乙醇溶液染色約2min; (7)依次 浸入95%乙醇、無水乙醇中脫水（每級l-3min) ;(8)二甲苯：無水乙醇（l:l)3min;(9)二 甲苯透明處理lOmin，最后用中性樹膠封片，封好后置于通風柜中驚干。
[0036] 2. 3PCNA(細胞增核抗原）免疫組化
[0037]1.石蠟切片經(jīng)二甲苯I、二甲苯II各脫蠟5min，濃度遞減梯度酒精3min，最后置 蒸饋水中。
[0038] 2.于0. 01M的巧樣酸鋼酸堿緩沖液中，微波修復(fù)（要求：調(diào)整火力使緩沖液溫度 保持在92-95°C，時間持續(xù)15min，冷卻至室溫），暴露抗原。
[0039] 3. 0. 01MPBS清洗 3 次，每次 5min。
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