華南紫萁離體再生體系建立的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種以孢子囊群為外植體的華南紫萁離體再生體系建立的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]
華南紫萁{Osmunda vachellii Hook.)是紫萁蕨科紫萁屬植物，產(chǎn)于亞洲亞熱帶濕潤(rùn)地區(qū)。分布于我國(guó)海南島、兩廣、福建、江西、浙江、貴州、云南南部及香港，也產(chǎn)于越南、緬甸和印度。常野生于濕潤(rùn)的山地、草叢或溪邊，是我國(guó)南部酸性土壤的指示植物。
[0003]華南紫萁具較高的觀賞價(jià)值。植株高達(dá)lm，根狀莖直立，圓柱狀，葉簇生于頂部，似蘇鐵，株型美觀，葉姿態(tài)優(yōu)雅，可供庭園中栽植或室內(nèi)盆栽觀賞。華南紫萁的根莖及葉柄的髓部可入藥，有清熱解毒、止血生肌作用。主要用于外感、風(fēng)熱、頭痛等癥，也可治療外傷出血、燙火傷、癰癤及腮腺炎。上世紀(jì)90年代末，何天士等人將其配制為藥酒和藥茶供人飲用，對(duì)人體保健有積極的作用，可解各種熱毒癥、預(yù)防癌癥及其他疑難病癥，性味平和，無副作用。相關(guān)的研究產(chǎn)品獲得4項(xiàng)專利。
[0004]華南紫萁目前資源主要依靠野生，但自然條件下繁殖效率較低，人工繁殖一般采用分株方式進(jìn)行，難以快速大規(guī)模栽培。由于華南紫萁集觀賞和藥用價(jià)值于一身，其潛在的市場(chǎng)需求非常大。利用組織培養(yǎng)技術(shù)建立蕨類植物再生體系，快速獲得大量種苗，可以滿足園林、保健市場(chǎng)對(duì)華南紫萁的需求，同時(shí)也間接保護(hù)了野生華南紫萁資源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種華南紫萁離體再生體系建立的方法，即以華南紫萁的成熟孢子為外植體，經(jīng)過外植體表面消毒、孢子無菌萌發(fā)、原葉體增殖、孢子體誘導(dǎo)與瓶苗移栽等步驟，建立了華南紫萁離體再生體系，從而快速可持續(xù)地獲得大量種苗。
[0006]本發(fā)明采用下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)。華南紫萁離體再生體系建立的方法，包括以下步驟:
(1)外植體采集與表面消毒:剪取華南紫萁孢子葉，進(jìn)行表面消毒。
[0007](2)孢子無菌萌發(fā):分離孢子葉上的孢子囊群，將其接種于孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。孢子萌發(fā)培養(yǎng)基配方為:改良Beneck基本培養(yǎng)基+ 0~15g/L蔗糖+6-芐氨基嘌呤(6-BA) 0.2mg/L + 2,4 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.lmg/L+瓊脂 7g/L
(3)原葉體增殖培養(yǎng):將步驟(2)孢子萌發(fā)形成的原葉體剪切至增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行原葉體增殖培養(yǎng)。每50d更換一次增殖培養(yǎng)基。增殖培養(yǎng)基配方為:改良Beneck基本培養(yǎng)基+ 15g/L 蔗糖 + 6-BA 0-0.6mg/L +2，4-D 0.lmg/L+ 瓊脂 7g/L。
[0008](4)孢子體的誘導(dǎo):將步驟(3)形成的原葉體粉碎轉(zhuǎn)接至孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生幼孢子體。孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:改良Beneck基本培養(yǎng)基+赤霉素(GA3)0~1.2mg/L +5g/L蔗糖+瓊脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。
[0009](5)生根培養(yǎng)與煉苗:將步驟(4)誘導(dǎo)的幼孢子體分離出來，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)孢子體形成不定根。生根培養(yǎng)基配方為:改良Beneck基本培養(yǎng)基+10g/L鹿糖+ 6-BA0.05mg/L +2，4-D 0.lmg/L (或NAA0.lmg/L) +瓊脂7g/L發(fā)現(xiàn)不定根根尖突出后，隨即在培養(yǎng)室內(nèi)松開、虛掩瓶蓋10d，期間培養(yǎng)基因水分較快消耗而收縮，但不致干涸，孢子體結(jié)構(gòu)分化更完善。
[0010](6)移栽:取出步驟(5)的孢子體幼苗，洗去根部附著的凝膠培養(yǎng)基，將幼苗移栽入經(jīng)高溫滅菌的基質(zhì)中。定期澆水，覆蓋薄膜，保持相對(duì)濕度90%以上。
[0011]上述改良Beneck 基本培養(yǎng)基配方為:NH4N03 2 00mg/L、KH2P04 1 00mg/L、MgS04.7H20 100mg/L、CaCl2 100mg/L、KI 0.83 mg/L、H3B03 6.2 mg/L、MnS04.4H20 22.3mg/L、ZnS04.7H20 8.6 mg/L、Na2Mo04.2HZ0 0.25 mg/L、CuS04.5H20 0.025 mg/L、CoCl2.6H20 0.025 mg/L、FeS04.7H20 6.95mg/L、Na2_EDTA.2H20 9.325 mg/L。瓊脂培養(yǎng)基pH值均調(diào)節(jié)至5.8。
[0012]上述培養(yǎng)條件均為:12h光照+12h黑暗，光照強(qiáng)度2500Lx，25±2°C。
[0013]上述步驟(1)中表面消毒條件優(yōu)選如下:先用70%的酒精浸泡15s，棄酒精，加入0.1% 升汞(HgCl2)消毒 2min。
[0014]上述步驟(2)孢子萌發(fā)培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:改良Beneck基本培養(yǎng)基+ 5g/L蔗糖+6-芐氨基嘌呤(6-BA) 0.2mg/L + 2,4 二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.lmg/L+瓊脂 7g/L
上述步驟(3)中，增殖培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:改良Beneck基本培養(yǎng)基+ 15g/L鹿糖+6-BA 0.6mg/L +2，4-D 0.lmg/L+ 瓊脂 7g/L。
[0015]上述步驟(4)中，孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:改良Beneck基本培養(yǎng)基+赤霉素(GA3)0.8mg/L +5g/L蔗糖+瓊脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。接種方式優(yōu)先為粉碎性接種。
[0016]上述步驟(5)中，生根培養(yǎng)基配方優(yōu)選為:改良Beneck基本培養(yǎng)基+10g/L鹿糖+6-BA 0.05mg/L +2，4-D 0.lmg/L+ 瓊脂 7g/L。
[0017]本發(fā)明首次建立了華南紫萁離體再生體系的方法，填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)空白；使用本發(fā)明的快速繁殖的方法，可實(shí)現(xiàn)高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，可在短時(shí)期內(nèi)獲得大量?jī)?yōu)質(zhì)的華南紫萁幼苗，為園藝生產(chǎn)和中藥栽培提供的可靠的技術(shù)保障。
【附圖說明】
[0018]圖1華南紫萁原葉體增殖效果圖。
[0019]圖2華南紫萁孢子體誘導(dǎo)效果圖。
[0020]圖3華南紫萁移栽效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]準(zhǔn)備工作:按配方制備改良Beneck基本培養(yǎng)基，其配方為:NH4N03 2 00mg/L、KH2P04100mg/L、MgS04.7Η20 100mg/L、CaCl2 100mg/L、KI 0.83 mg/L、H3B03 6.2 mg/L、MnS04.4Η2022.3 mg/L、ZnS04.7H20 8.6 mg/L、Na2Mo04.2HZ0 0.25 mg/L、CuS04.5H20 0.025 mg/L、CoCl2.6H20 0.025 mg/L、FeS04.7H20 6.95mg/L、Na2_EDTA.2H20 9.325 mg/L。瓊脂培養(yǎng)基pH值均調(diào)節(jié)至5.8。
[0022]本發(fā)明提供的華南紫萁離體培養(yǎng)體系建立的方法，包括如下順序步驟:
(1)外植體采集與表面消毒處理:在華南紫萁孢子囊群色澤黃褐，孢子葉軸尚呈黃綠新鮮狀態(tài)時(shí)，剪取孢子葉自封袋中帶回，及時(shí)處理新鮮材料，或貯4°C保存，2d內(nèi)處理完。孢子葉表面消毒:孢子葉剪裁為3~4cm的小段，置50ml廣口瓶中，飽和洗衣粉溶液浸泡，加入1滴吐溫-80，蓋瓶蓋，浸洗20min，期間每3~5min輕輕旋搖瓶體數(shù)次；自來水緩緩沖洗孢子葉lOmin ;在超凈工作臺(tái)上，棄瓶?jī)?nèi)自來水，加入70%的酒精浸泡15s，棄酒精，加入0.1%HgCl2消毒2min，再以無菌水沖洗5次，備用。
[0023](2)孢子無菌萌發(fā):分離孢子葉上的孢子囊群，將其接種于孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。孢子萌發(fā)培養(yǎng)基配方為:改良Beneck基本培養(yǎng)基+ 0~15g/L蔗糖+6-BA 0.2mg/L + 2，4-D 0.lmg/L+瓊脂7g/L。培養(yǎng)條件均為:12h光照+12h黑暗，光照強(qiáng)度2500Lx，25±2°C。
[0024](3)原葉體增殖培養(yǎng):將步驟(2)孢子萌發(fā)形成的原葉體剪切至增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行原葉體增殖培養(yǎng)。每50d更換一次增殖培養(yǎng)基。增殖培養(yǎng)基配方為:改良Beneck基本培養(yǎng)基 + 15g/L 蔗糖 + 6-BA 0-0.6mg/L +2, 4-D 0.lmg/L+瓊脂 7g/L。培養(yǎng)條件均為:12h 光照+12h黑暗，光照強(qiáng)度2500Lx，25±2°C。
[0025](4)孢子體的誘導(dǎo):將步驟(3)形成的原葉體粉碎轉(zhuǎn)接至孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生幼孢子體。孢子體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配配方為:改良Beneck基本培養(yǎng)基+ GA3 0-1.2mg/L+5g/L蔗糖+瓊脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。培養(yǎng)條件均為:12h光照+12h黑暗，光照強(qiáng)度 2500Lx，25±2°C。
[0026](5)生根培養(yǎng)與煉苗:將步驟(4)誘導(dǎo)的幼孢子體分離出來，轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基誘導(dǎo)孢子體形成不定根。生根培養(yǎng)基配方為:改良Beneck基本培養(yǎng)基+10g/L鹿糖+ 6-BA
0.05mg/L +2，4-D 0.lmg/L (或 NAA0.lmg/L) + 瓊脂 7g/L。10_15d 陸續(xù)發(fā)現(xiàn)各幼孢子體不定根根尖突出后，隨即在培養(yǎng)室內(nèi)松開、虛掩瓶蓋10d，期間培養(yǎng)基因水分較快消耗而收縮，但不致干涸，孢子體結(jié)構(gòu)分化更完善。培養(yǎng)條件均為:12h光照+12h黑暗，光照強(qiáng)度2500LX，25±2°C。
[0027](6)移栽:取出步驟(5)的孢子體幼苗，洗去根部附著的凝膠培養(yǎng)基，將幼苗移栽入經(jīng)高溫滅菌的基質(zhì)中，基質(zhì)為草炭:蛭石=3: 1。定期澆水，覆蓋薄膜，保持相對(duì)濕度90%以上。
[0028]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整說明:
實(shí)施例1
外植體采集與表面消毒處理:在華南紫萁孢子囊群色澤黃褐，孢子葉軸尚呈黃綠新鮮狀態(tài)時(shí)，剪取孢子葉自封袋中帶回，及時(shí)處理新鮮材料，或貯4°C保存，2d內(nèi)處理完。孢子葉表面消毒:孢子葉剪裁為3~4cm的小段，含10-12個(gè)孢子囊群，置50ml廣口瓶中，飽和洗衣粉溶液浸泡，加入1滴吐溫-80，蓋瓶蓋，浸洗20min，期間每3~5min輕輕旋搖瓶體數(shù)次；廣口瓶口扎以紗布，以自來水緩緩沖洗孢子葉lOmin，至瓶?jī)?nèi)液體澄清；在超凈工作臺(tái)上，棄瓶?jī)?nèi)自來水，加入70%的酒精浸泡15s，棄酒精，加入0.1%取(:12消毒2min，再以無菌水沖洗5次，備用。分離孢子葉上的孢子囊群，將其接種于孢子萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，每瓶接種10個(gè)孢子囊群。培養(yǎng)條件均為:12h光照+12h黑暗，光照強(qiáng)度2500Lx，25±2°C。
[0029]孢子萌發(fā)培養(yǎng)基配方為: a)改良 Beneck 基本培養(yǎng)基 + 0/L 鹿糖+6-BA 0.2mg/L + 2, 4-D 0.lmg/L+瓊脂 7g/L。
[0030]b)改良 Beneck 基本培養(yǎng)基 + 5g/L