一種海南地區(qū)白花油茶組培苗的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬植物組培技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種組培苗的生產(chǎn)方法，具體是一種海南地區(qū) 白花油茶組培苗的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 油茶（Camellia oleifera)又名茶子樹、油茶樹，為常綠小喬木或灌木，分布于我 國(guó)海南、福建、湖南、江西、廣西等省區(qū)，與橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物， 是我國(guó)特有的油料植物資源，也是海南省傳統(tǒng)的油料經(jīng)濟(jì)作物。油茶種子榨取的茶油色清 味香，是優(yōu)質(zhì)的食用油，具"東方橄欖油"美稱。尤其是海南省得天獨(dú)厚的綠色生態(tài)環(huán)境，使 得海南茶油氣味和滋味香醇濃厚、療效顯著，享譽(yù)國(guó)內(nèi)外。茶油還可作為潤(rùn)滑油、防銹油用 于機(jī)械工業(yè)；茶餅既是農(nóng)藥，又是肥料，可提高農(nóng)田蓄水能力和防治稻田害蟲；果皮是提制 栲膠的原料；葉部含有花黃素、茶堿等，可做醫(yī)藥工業(yè)的原料。另外，油茶樹不但具生態(tài)保護(hù) 功能，而且油茶花色潔白或艷麗，花期又長(zhǎng)，為海南國(guó)際旅游島旅游增色，與海南綠色寶島 的生態(tài)環(huán)境相輔相成。因而，油茶樹的經(jīng)濟(jì)、觀賞和生態(tài)價(jià)值極高，對(duì)發(fā)展海南綠色農(nóng)業(yè)具 有重要的作用。
[0003] 目前，海南油茶種植業(yè)正在快速發(fā)展，但由于油茶生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，從開花至果實(shí)成熟 歷時(shí)一年半，且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，油茶雜交難度大，成功率低，令油茶品種的改良效率低，全國(guó)油 茶適生區(qū)已陸續(xù)有油茶優(yōu)良品種，但依然稀缺。由于海南省油茶種質(zhì)資源調(diào)查、優(yōu)株篩選、 采穗圃建立和育種等研究工作近兩年才開始，至今尚無適應(yīng)本土生長(zhǎng)的本省油茶優(yōu)良品 種、優(yōu)株采穗圃等。相應(yīng)的優(yōu)株種子實(shí)生苗、嫁接苗和優(yōu)質(zhì)組培苗稀缺，而引進(jìn)的外省優(yōu)良 品種苗木卻因海南省獨(dú)特的地理環(huán)境和天氣，在海南本土種植時(shí)引起"水土不服"，導(dǎo)致生 長(zhǎng)、結(jié)果皆不理想。在國(guó)家政策扶持下，全國(guó)油茶適生地掀起發(fā)展油茶種植業(yè)熱潮，海南省 部分種植戶受海南本地油茶優(yōu)株種籽量少、缺乏嫁接苗等不良因素的影響，在更新衰退老 油茶林以及新建油茶林時(shí)，種苗大多數(shù)采用油茶實(shí)生苗和扦插苗。由于本地優(yōu)株數(shù)量有限， 種植戶選用良莠不齊的種子，造成育苗后代個(gè)體間性狀分離，不能獲得品質(zhì)一致的育苗產(chǎn) 品，造成油茶種植后開花、掛果期不一致，肥水管理麻煩，產(chǎn)量也高低不一，整體生產(chǎn)普遍低 效。另外，油茶扦插苗雖然保持母株的優(yōu)良基因，且苗木生長(zhǎng)迅速，掛果快，但扦插苗植株 不定根根系淺，易早衰，油茶林衰退嚴(yán)重。尤其是海南省屬熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，受季風(fēng)環(huán)流的 影響，臺(tái)風(fēng)是海南省最嚴(yán)重和普遍的自然災(zāi)害，平均每年直接登陸或影響該省的臺(tái)風(fēng)達(dá)8-9 個(gè)，且主要集中在7-10月份。每次海南油茶適生區(qū)臺(tái)風(fēng)登陸過后，油茶林不但出現(xiàn)生理性 落花、落果現(xiàn)象，更為嚴(yán)重的是，用扦插苗種植的油茶林，因?yàn)榍げ迕鐭o主根，根系不發(fā)達(dá)， 種植的油茶植株出現(xiàn)不同程度的傾倒，加上扦插苗本身生長(zhǎng)勢(shì)比較弱、容易早衰，嚴(yán)重的甚 至造成油茶植株死亡，臺(tái)風(fēng)對(duì)扦插苗種植的油茶植株造成的二次傷害給油茶種植戶造成重 大損失。
[0004] 還有，與其他油茶產(chǎn)區(qū)省份相比，海南省油茶的種質(zhì)資源收集和保存、育種和研究 工作起步較晚，很多本土高產(chǎn)或抗風(fēng)的優(yōu)質(zhì)油茶資源卻因擴(kuò)大經(jīng)濟(jì)開發(fā)用地等人為因素正 面臨丟失的危急。另外，每年的5-9月是海南油茶的果實(shí)膨大期，恰逢臺(tái)風(fēng)和暴風(fēng)雨頻繁月 份，花期和結(jié)果期的落花落果使得海南白花油茶雜交育種困難重重，有些雜種胚在未成熟 前就因遭受風(fēng)雨肆虐而提前落果夭折。
[0005] 組織培養(yǎng)技術(shù)是植物快速繁殖、創(chuàng)造優(yōu)良品種的一種行之有效的方法，經(jīng)生產(chǎn)驗(yàn) 證，組培苗在長(zhǎng)勢(shì)、抗性、結(jié)果、產(chǎn)量和質(zhì)量等方面均得到大幅度提高。當(dāng)前制約海南省油茶 產(chǎn)業(yè)健康、穩(wěn)進(jìn)地發(fā)展的關(guān)鍵因素是匱乏改造現(xiàn)有低劣茶林和新建優(yōu)良油茶林所需的大批 量適應(yīng)本土生長(zhǎng)的良種壯苗，通過生產(chǎn)油茶組培苗來提供油茶優(yōu)良種苗是解決海南油茶優(yōu) 質(zhì)種苗匱乏的有效方法。
[0006] 油茶在全國(guó)各地品種繁多，由于不同地區(qū)的生態(tài)環(huán)境、不同品種的生長(zhǎng)習(xí)性的不 同，不同地區(qū)、不同品種的油茶離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成差別大。20世紀(jì)80年代以來，國(guó)內(nèi) 外對(duì)油茶組織培養(yǎng)相關(guān)的研究從未中斷過。早在1980年，隆振雄就利用油茶幼胚胚狀體誘 導(dǎo)出不定芽和不定根，但未獲得健壯的再生植株；1982年，盧天玲研究了油茶未成熟子葉 與幼胚離體培養(yǎng)分化成苗的過程，證明了油茶體細(xì)胞具有強(qiáng)烈的脫分化與再分化能；2004 年，畢方鋮研究了離體條件下帶芽的莖段、幼胚、子葉的愈傷組織的形成和植株再生技術(shù)， 為油茶快繁提供了新的途徑；張智俊等以子葉為外植體誘導(dǎo)獲得組培苗，但前皆以湖南、 廣西地區(qū)的油茶作為研究對(duì)象，不同省份和地區(qū)的油茶組培適宜基本培養(yǎng)基也涉及到MS、 White、等不同配方，可見因?yàn)橛筒枭L(zhǎng)區(qū)域的不同，氣候土壤條件差異大，其離體 培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件也因地而異。經(jīng)檢索，對(duì)海南區(qū)域種植的白花油茶研究報(bào)導(dǎo) 鮮見。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種海南地區(qū)白花油茶組培苗的生 產(chǎn)方法，利用組織培養(yǎng)技術(shù)，選擇合適的外植體進(jìn)行油茶組培快繁以生產(chǎn)油茶組培苗木，為 海南油茶生產(chǎn)提供充足的良種壯苗，也為開展油茶植株再生的發(fā)生及其調(diào)控機(jī)制以及再生 植株遺傳與變異的研究，為后期的油茶功能基因研究以及利用基因工程定向培育高產(chǎn)、優(yōu) 質(zhì)、高抗油茶新品種做技術(shù)保障和儲(chǔ)備。
[0008] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案：
[0009] -種海南地區(qū)白花油茶組培苗的生產(chǎn)方法，包括外植體選擇、初代培養(yǎng)（脫分化 誘導(dǎo)胚性愈傷組織和不定芽）、繼代培養(yǎng)（增殖和再分化）和植株再生（體細(xì)胞胚成熟誘導(dǎo) 和植株再生）的過程，其具體過程如下：
[0010] 1、外植體選擇
[0011] 取開花后170~190d發(fā)育時(shí)期的油茶果實(shí)進(jìn)行消毒后解剖刀切開，剖開胚乳，夾 取幼胚子葉，切成薄片，備用。選用油茶種子未成熟胚子葉作為外植體，其外面有果皮、種皮 和胚乳包被保護(hù)，處于無菌狀態(tài)，有效降低了因外植體消毒不徹底而使培養(yǎng)物遭受污染的 機(jī)率。
[0012] 2、初代培養(yǎng)
[0013] 將胚子葉薄片平鋪接種在初代培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23~27°C，每天光照 13~16h，光照強(qiáng)度為1500~20001x。每25d繼代一次，直至外植體脫分化誘導(dǎo)出結(jié)節(jié)胚 性愈傷組織。一般誘導(dǎo)培養(yǎng)約第70d即可誘導(dǎo)出結(jié)節(jié)胚性愈傷組織。所述初代培養(yǎng)基是以 改良MS作為基本培養(yǎng)基，并添加 Kt 2. Omg · L \ NAAO. 2mg · L \ Zt 5. Omg · L 1 (Zt為過濾 滅菌）、椰汁5%、蔗糖30g · L 1和植物凝膠2. 2g · L \ pH5. 5。根據(jù)誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果，篩選優(yōu) 化出適宜的外植體。
[0014] 3、繼代培養(yǎng)
[0015] 將適宜外植體誘導(dǎo)出的結(jié)節(jié)胚性組織接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，誘導(dǎo)胚 性愈傷組織增殖，每25d繼代一次，30~40d增殖系數(shù)約4. 7~5. 0 ;將增殖后的胚性組織 轉(zhuǎn)接到再分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體細(xì)胞胚發(fā)生，40~50d后即可再分化出體細(xì)胞胚，子葉形體 細(xì)胞胚再分化率約75%。所述增殖培養(yǎng)基是以改良MS為基本培養(yǎng)基，并添加 Kt 1. 0~ 2. Omg · L \ NAA 0· 2mg · L \ 椰汁 10%、蔗糖 30g · L 1和植物凝膠 2. 2g · L \ ρΗ5· 5。所 述再分化培養(yǎng)基是以改良MS為基本培養(yǎng)基，并添加 Kt 0. 7π^·?/、ΝΑΑ 0. lmg.L^ABA 0· 05mg .L \椰汁10%、水解酪蛋白400mg .L \蔗糖30g .L \植物凝膠2. 3g .L 1和0· 1% 活性炭，pH5. 5。
[0016] 4、植株再生
[0017] 待子葉形體細(xì)胞胚成熟后，單獨(dú)剔剝下來，轉(zhuǎn)接至植株再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)植 株再生，30~40d后形成具健壯胚芽和主根的體細(xì)胞胚再生植株。所述植株再生誘導(dǎo)培 養(yǎng)基是以改良MS為基本培養(yǎng)基，并添加 Kt 0. 35π^·?/、ΝΑΑ 0.0 Smg.L1、水解酪蛋白 200mg · L \ 蔗糖 30g · L \ 植物凝膠 2. 3g · L 1和 0· 1%活性炭，ρΗ5· 5。
[0018] 所述改良MS是將大量元素降低至2/3,并將MS的有機(jī)成份改成仏有機(jī)成份（海南 地區(qū)典型土壤為赤紅壤，礦質(zhì)養(yǎng)分較貧乏，有機(jī)質(zhì)含量低，土壤偏酸，針對(duì)土壤的理化特性， 本發(fā)明將大量元素降低至2/3,并將MS有機(jī)成份改成仏有機(jī)成份）。
[0019] 本發(fā)明利用組織培養(yǎng)，選擇花后180d油茶果發(fā)育時(shí)期的種子未成熟胚子葉為外 植體進(jìn)行油茶組培快繁，建立一整套經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生途徑獲得油茶再生植株的體系，為海 南地區(qū)白花油茶工廠化育苗提供技術(shù)依據(jù)，并為海南地區(qū)白花油茶的基因工程改良奠定了 材料和技術(shù)