下文另有明確說明， 包括多個指代物。類似地，措辭"或（or)"意為包括"和（and)"，除非上下文另有明確說明。 還應(yīng)當(dāng)理解的是，為核酸或多肽給出的所有堿基大小或氨基酸大小、和所有分子量或分子 質(zhì)量值均是近似值，并且它們提供用于說明。盡管與本文所描述的方法和材料類似或等同 的方法和材料可以在本公開的實(shí)踐和測試中使用，但是下文描述了適合的方法和材料。術(shù) 語"包含（comprises) "是指"包括（includes) "?？s寫"e. g. "來源于拉丁文exempli gratia 并且在本文中用于表示非限制性實(shí)例。因此，縮寫"e.g."與術(shù)語"例如（for example)"同 義。
[0087] 定義
[0088] "產(chǎn)量"描述了由植物或一組或一批植物生產(chǎn)的谷物的量?？梢远喾N方式來測量產(chǎn) 量，包括但不限于谷物產(chǎn)量/m2、t haYt公傾4、和單株平均谷物產(chǎn)量（平均谷物產(chǎn)量/植 物，average grain yield per plant) 〇
[0089] 本文中所使用的"表型性狀"是植物的可觀察到的特征的不同變量（variant)，例 如谷物產(chǎn)量，它們可以由植物遺傳或可以通過諸如轉(zhuǎn)染等方法人工并入到植物中。
[0090] 本文中使用的"基因滲入（漸滲）"是指由于回交，一種或多種基因或一組基因從 一種植物種類移動至另一種植物種類的基因復(fù)合物中。
[0091] 本文中使用的"轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞"是指例如通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或通過使用涂 布有重組DNA的微粒的轟擊或通過其它方法，轉(zhuǎn)化有穩(wěn)定-整合的、非天然的、重組DNA的 植物細(xì)胞。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可以是最初轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其表現(xiàn)為可再生為分化 組織的微生物或子代植物細(xì)胞，例如再生為具有穩(wěn)定整合的、非天然的重組DNA的轉(zhuǎn)基因 植物或來源于子代轉(zhuǎn)基因植的種子或花粉。
[0092] 本文中使用的"轉(zhuǎn)基因植物"是指基因組被重組DNA的穩(wěn)定整合而改變的植物。轉(zhuǎn) 基因植物包括由最初轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生的植物或來自轉(zhuǎn)化植物的后代或雜交的子代轉(zhuǎn) 基因植物。
[0093] 本文中使用的"重組DNA"是指經(jīng)基因工程化并在細(xì)胞外構(gòu)建的DNA，包括含有天 然存在的DNA或cDNA或合成DNA的DNA。
[0094] "百分比同一性"是指在整個序列（例如核苷酸序列或氨基酸序列）對比窗口 中，DNA或蛋白質(zhì)片段的序列保持不變的程度。百分比同一性優(yōu)選使用局部比對算法諸如 BLASTp來在整個對比長度上進(jìn)行計算。如本文中所使用的，當(dāng)通過BLASTp產(chǎn)生的對比具有 最小e-值時，序列是"匹配的（aligned) "。
[0095] 本文中使用的"啟動子"是指用于啟動轉(zhuǎn)錄的調(diào)控DNA。"在植物細(xì)胞中是功能性的 啟動子"是能夠在植物細(xì)胞中啟動轉(zhuǎn)錄的啟動子，無論其原始來源是否是植物細(xì)胞，例如， 眾所周知農(nóng)桿菌（Agrobacterium)啟動子在植物細(xì)胞中是功能性的。因此，植物啟動子包 括獲自于植物、植物病毒和細(xì)菌（諸如農(nóng)桿菌與慢生根瘤菌（Bradyrhizobium)細(xì)菌）的啟 動子DNA。
[0096] 本文中使用的"可操作地連接"是指重組DNA構(gòu)建體中兩個或更多個DNA片段的 關(guān)聯(lián)，以便一個（例如蛋白質(zhì)編碼DNA)的功能受到另一個（例如啟動子）的控制。
[0097] 本文中使用的"表達(dá)"是指產(chǎn)生，例如當(dāng)同源DNA被轉(zhuǎn)錄至mRNA再翻譯至蛋白質(zhì) 時，在植物細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0098] 本文中使用的"對照植物"是指不含賦予增強(qiáng)的谷物產(chǎn)量的重組DNA的植物。使 用對照植物來識別并選擇具有增強(qiáng)的谷物產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物。適合的對照植物可以為用來 生成轉(zhuǎn)基因植物的親本系的非轉(zhuǎn)基因植物，即缺乏重組DNA。在一些情況下，適合的對照植 物可以是不含重組DNA的半合子轉(zhuǎn)基因植物系的子代植物，稱為陰性分離體（segregant)。
[0099] 術(shù)語"數(shù)量性狀基因座"或"QTL"是指具有至少兩個反映連續(xù)分布的表型性狀的 差異表達(dá)的等位基因的多態(tài)遺傳基因座。
[0100] 在本公開的上下文中的術(shù)語"與…相關(guān)聯(lián)"或"相關(guān)聯(lián)的"是指例如，處于連鎖不 平衡中的核酸和表型性狀，即如果核酸和表型獨(dú)立地分離，核酸與性狀更經(jīng)常在子代植物 中一起發(fā)現(xiàn)。
[0101] 術(shù)語"標(biāo)記（標(biāo)記物）"或"分子標(biāo)記"或"遺傳標(biāo)記"是指遺傳基因座（"標(biāo)記焦 點(diǎn)（marker focus)")，當(dāng)識別遺傳連接的基因座（諸如基因或數(shù)量性狀基因座（QTL))時， 其用作參考點(diǎn)。該術(shù)語還可以指代與所述基因組序列互補(bǔ)的核酸序列，諸如用作探針或引 物的核酸。所述引物可以與標(biāo)記序列的上游或下游序列互補(bǔ)。該術(shù)語還可以指代與標(biāo)記相 關(guān)聯(lián)的擴(kuò)增產(chǎn)物。該術(shù)語還可以指代與標(biāo)記相關(guān)聯(lián)的等位基因。與表型相關(guān)聯(lián)的等位變異 使得標(biāo)記能夠在序列的基礎(chǔ)上區(qū)分種質(zhì)（germplasm)。
[0102] 在本公開的上下文中的術(shù)語"雜交的（crossed) "或"雜交"是指通過授粉的配子 融合以產(chǎn)生子代（即，細(xì)胞、種子或植物）。該術(shù)語還涵蓋有性雜交（一株植物被另一植物 授粉）和自交（自花授粉，即在花粉和胚珠來自相同的植物或來自遺傳上相同的植物時）。
[0103] 通過轉(zhuǎn)基因方法生產(chǎn)具有提高的谷物產(chǎn)量的水稻植物
[0104] 根據(jù)一個具體的實(shí)施方式，包含新型基因 SPIKE的核酸（優(yōu)選DNA)序列或其 產(chǎn)量提高部分可以用來生產(chǎn)具有提高的谷物產(chǎn)量的水稻植物。在這一方面，該實(shí)施方式 提供了 SPIKE或其產(chǎn)量提高部分用于產(chǎn)生具有提高的谷物產(chǎn)量的水稻植物的應(yīng)用，并且 涉及將包含SPIKE的核酸序列導(dǎo)入到秈稻品種中。所述核酸序列可以來源于任何合適 的供體水稻植物。能夠提供包含SPIKE的核酸序列的適合供體水稻植物或其產(chǎn)量提高 部分是熱帶粳稻地方品種（landrace)Daringan、NPT品種YP9(IR68522-10-2-2)(其來 源于秈稻品種Shennung89-366和Daringan的雜交）、熱帶粳稻巴厘島Ontjer、和NPT IR65564-22-2-3(來自Bali Ontjer)與IRRI146之間的雜交的子代。表現(xiàn)出相對高的谷物 產(chǎn)量并且包含SPIKE的其它相關(guān)水稻植物也可以用作供體植物。
[0105] -旦在適合的供體水稻植物已識別，可以通過任何可用的方法將包含SPIKE的核 酸序列或其產(chǎn)量提高部分轉(zhuǎn)移至適合的受體植物中。例如，可以通過將供體水稻植物與易 感受體水稻植物雜交（即通過基因滲入）、通過轉(zhuǎn)化、通過原生質(zhì)體融合、通過雙單倍體技 術(shù)或通過胚拯救、或者通過任何其它核酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來轉(zhuǎn)移所述核酸序列，任選地隨后選擇 包含SPIKE并且表現(xiàn)出提高的谷物產(chǎn)量的后代植物。對于轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)基因方法，可以通過使 用本領(lǐng)域中已知的方法從供體植物分離出包含SPIKE的核酸序列或其產(chǎn)量提高部分，并且 可以通過轉(zhuǎn)基因的方法，例如通過載體、在配子中、或以任何其它合適的轉(zhuǎn)移元件如涂敷有 所述核酸序列的彈道粒子（ballistic particle)的方式，將分離的核酸序列轉(zhuǎn)移到受體植 物中。
[0106] 植物轉(zhuǎn)化一般包括構(gòu)建在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的表達(dá)載體。在某些實(shí)施方式中， 此種載體包含含有SPIKE的核酸序列或其產(chǎn)量提高部分并且處于調(diào)控元件（諸如啟動子） 的控制中或可操作地連接至該調(diào)控元件。該表達(dá)載體可以含有一個或多個此種可操作地連 接的基因/調(diào)控元件的組合，前提條件是包含在所述組合中的基因的至少一個是SPIKE。所 述載體可以為質(zhì)粒的形式，并且可以單獨(dú)使用或與其它質(zhì)粒組合，使用本領(lǐng)域中已知的轉(zhuǎn) 化方法諸如農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，以提供具有提高的谷物產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物。
[0107] 表達(dá)載體可以包括至少一個可操作地連接至調(diào)控元件（諸如啟動子）的標(biāo)記基 因，其允許含有所述標(biāo)記的轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以通過陰性選擇（通過抑制不含有可選擇的標(biāo)記基 因的細(xì)胞生長）或通過陽性選擇（通過篩選由標(biāo)記基因編碼的產(chǎn)物）來回收。許多常用于 植物轉(zhuǎn)化的可選擇的標(biāo)記基因在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且包括例如編碼代謝解毒可能 為抗生素或除草劑的選擇性化學(xué)試劑的酶的基因或編碼對抑制劑不敏感的改變靶的基因。 本領(lǐng)域中已知多種陽性選擇方法，諸如甘露糖選擇。替代地，可以使用無標(biāo)記轉(zhuǎn)化來獲得不 具有所述標(biāo)記基因的植物，其技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。
[0108] 將表達(dá)載體導(dǎo)入到植物中的一種方法是基于農(nóng)桿菌的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（參見例如 Horsch et al.，1985)。將表達(dá)載體導(dǎo)入到植物組織中的方法包括直接感染或使用根癌農(nóng) 桿菌（Agrobacterium tumefaciens)共培養(yǎng)植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌載體系統(tǒng)的描述及農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的方法由Gruber和Crosby, 1993以及Moloney et al.，1989提供。還參見美 國專利號5, 591，616。植物表達(dá)載體和報告基因以及轉(zhuǎn)化方案的一般描述以及農(nóng)桿菌載體 系統(tǒng)和用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法的描述可以在Gruber和Crosby, 1993中找到。培 養(yǎng)植物組織的一般方法由例如Miki et al·，1993和Phillips, et al·，1988提供。用于分 子克隆技術(shù)以及適合的表達(dá)載體的適合參考手冊為Sambrook和Russell (2001)。
[0109] 使用眾所周知的方法組裝在轉(zhuǎn)基因方法中有用的重組DNA構(gòu)建體，并且典型地包 含可操作地連接至DNA的啟動子，其表達(dá)提供了增強(qiáng)的農(nóng)藝性狀。其它構(gòu)建體組分可以包 括附加的調(diào)節(jié)元件，諸如5'前導(dǎo)區(qū)和用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的內(nèi)含子、3'非翻譯區(qū)（諸如聚腺苷酸 化信號和位點(diǎn)）、轉(zhuǎn)運(yùn)用DNA(DNA for transit)或信號肽。
[0110] 已經(jīng)描述了在植物細(xì)胞中具有活性的許多啟動子。這些包括存在于植物基因組中 的啟動子以及來自其它來源的啟動子，包括攜帶在根癌農(nóng)桿菌的腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒的胭脂堿合 成酶（NOS)啟動子以及章魚堿合成酶（OCS)啟動子以及來自花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟 動子。在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動子為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知并且可用于本發(fā)明的重組多 核苷酸中以提供所需基因在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中的表達(dá)。
[0111] 另外，所述啟動子可以改變?yōu)楹卸鄠€"增強(qiáng)子序列"以協(xié)助提高基因表達(dá)。通過 包括具有此種構(gòu)建體的增強(qiáng)子序列，所選擇蛋白質(zhì)的表達(dá)可以得到增強(qiáng)。這些增強(qiáng)子經(jīng)常 出現(xiàn)在真核細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動子中轉(zhuǎn)錄起始的5'，但是經(jīng)常可以插入在編碼序列的上 游（5'）或下游（3'）。在一些情況下，這些5'增強(qiáng)元件為內(nèi)含子。作為增強(qiáng)子特別有用的 是水稻肌動蛋白1基因和水稻肌動蛋白2基因的5'內(nèi)含子、玉米醇脫氫酶基因的內(nèi)含子、 玉米熱休克蛋白70基因內(nèi)含子和玉米皺縮1基因。
[0112] 將表達(dá)載體導(dǎo)入到植物中的另一種方法基于微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化 (microprojectile-mediated transformation)，其中 DNA 被攜帶在微粒（微彈， microprojectile)的表面上。使用彈道裝置將表達(dá)載體導(dǎo)入到植物組織中，所述彈道 裝置將微粒加速到速度300~600m/s，這足以穿透植物細(xì)胞壁和膜（參見，Sanford et al.，1987, 1993 ;Sanford, 1988, 1990 ;Klein et al.，1988, 1992)。用于將 DNA 導(dǎo)入到植物 中的另一種方法是通過革E細(xì)胞的超聲處理（參見Zhang et al.，1991)。替代地，已經(jīng)使用 脂質(zhì)體或原生質(zhì)體融合來將表達(dá)載體導(dǎo)入到植物中（參見例如Deshayes et al.，1985和 Christou et al.，1987)。已經(jīng)報道了使用〇3(]12沉淀、聚乙稀醇或聚-L-鳥氨酸將DNA向原 生質(zhì)體中的直接攝?。▍⒁娎鏗ain et al. 1985和Draper et al·，1982)。還已經(jīng)描述了 原生質(zhì)體和完整細(xì)胞和組織的電穿孔（D'Halluin et al.，1992和Laursen et al.，1994)。
[0113] 在轉(zhuǎn)化水稻靶組織之后，上述可選擇的標(biāo)記基因的表達(dá)允許使用當(dāng)前在本領(lǐng)域中 公知的再生和選擇方法擇優(yōu)先擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織和/或植物。本文所描述的標(biāo)記也可以 用于該目的。
[0114] 通過非轉(zhuǎn)基因方法生產(chǎn)具有提高的谷物產(chǎn)量的水稻植物
[0115] 在用于生產(chǎn)具有提高的產(chǎn)量的水稻植物的另一個實(shí)施方式中，可以使用原生質(zhì)體 融合將核酸從供體植物轉(zhuǎn)移至受體植物中。原生質(zhì)體融合是兩個或更多個原生質(zhì)體（通過 酶處理除去了細(xì)胞壁的細(xì)胞）之間的誘發(fā)或自發(fā)的聯(lián)合，諸如體細(xì)胞雜交，以生產(chǎn)單個雙 核或多核細(xì)胞。（甚至可以由不能在自然界中雜種繁殖的植物物種來獲得的）所述融合細(xì) 胞組織培養(yǎng)成表現(xiàn)出性狀的所需組合的雜交植物。更具體地，第一原生質(zhì)體可以獲自于表 現(xiàn)出提高的谷物產(chǎn)量的水稻植物或其它植物系。例如，可以使用來自Darigan、YP9或Bali Ontjer的原生質(zhì)體。第二原生質(zhì)體可以獲自水稻或其它植物種類，優(yōu)選廣受歡迎的秈稻品 種。此外，所述第二原生質(zhì)體可以來自包含商業(yè)所需特性的水稻種類，諸如但不限于抗病 性、抗蟲性、耐雜草性等。然后使用本領(lǐng)域中已知的傳統(tǒng)原生質(zhì)體融合程序來融合原生質(zhì) 體。
[0116] 替代地，在包含SPIKE的核酸從供體植物向受體植物的轉(zhuǎn)移中可以采用胚拯救。 胚拯救可以用作在植物不能產(chǎn)生有活力的種子時從雜交（雜種，cross)中分離胚的程度。 在這種工藝中，植物的受精子房或未成熟的種子經(jīng)組織培養(yǎng)以產(chǎn)生新植物。
[0117] 還可以使用傳統(tǒng)育種技術(shù)以將編碼SPIKE的核酸序列基因滲入到其中需要更 高的谷物產(chǎn)量的靶受體水稻植物中，優(yōu)選秈稻品種。在一個方法中，被稱為家系育種 (pedigree breeding)，將包含編碼SPIKE的核酸序列的供體水稻植物與其中需要更高的谷 物產(chǎn)量的水稻植物雜交，優(yōu)選秈稻品種。然后將產(chǎn)生的植物群體（表示為Fl雜種）自花授 粉和結(jié)籽（F2種子）。然后，對由F2種子生長的F2植物提高的谷物產(chǎn)量進(jìn)行篩選?？梢栽S 多不同的方式對所述群體進(jìn)行提高谷物產(chǎn)量的篩選。例如，可以通過幾個季節(jié)的田間評估 來篩選群體?？梢酝ㄟ^谷物產(chǎn)量/m2(GYS)、每公頃谷物的重量（例如t ha \kg ha ^、單株 平均粒重或本領(lǐng)域中已知的其它方法來確定產(chǎn)量。
[0118] 可通過本文所描述的方法獲得的具有提高的谷物產(chǎn)量的水稻植物或其部分也是 本發(fā)明的一個實(shí)施方式
[0119] -個特定的實(shí)施方式涉及具有提高的谷物產(chǎn)量的水稻植物或其部分，其包含處于 其基因組中的SPIKE或其產(chǎn)量提高部分，其中SPIKE或其產(chǎn)量提高部分不處于其天然遺傳 背景中。本文中所描述的具有提高的谷物產(chǎn)量的水稻植物可以是任何遺傳類型，諸如自交、 雜交、單倍體、二倍體、