快速鑒別大型溞幼溞性別的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及大型潘生態(tài)毒理測試，具體地指一種快速鑒別大型潘幼潘性別的方 法。
【背景技術】
[0002] 生態(tài)毒理測試技術已經廣泛地應用于新老化學品的生態(tài)風險評價。隨著歐盟 REACH法規(guī)的實施，對進入歐盟的化學品生態(tài)安全的要求越來越嚴格，我國的化工產品出口 面臨著挑戰(zhàn)，對化學品進行嚴謹?shù)纳鷳B(tài)毒理及安全評價是我國的化工產品走向國際化的前 提，因此生態(tài)毒理及安全評價技術顯得尤為重要，對其技術水平的要求也越來越高。國家環(huán) 保局化學品登記中心編寫了《化學品測試方法》來規(guī)范化與標準化各生態(tài)毒理與安全評價 測試機構的生態(tài)毒理測試方法。但是實際操作中發(fā)現(xiàn)部分生態(tài)毒理測試技術仍然存在一定 的問題，比如測試數(shù)據(jù)及測試結果尚未得到國際互認、實驗過程繁瑣、測試周期長等，各生 態(tài)毒理測試技術還有待進一步的完善與改進。
[0003] 大型潘作為國際公認的標準試驗生物，大型潘生態(tài)毒理測試已經開展多年，美國 環(huán)保局在1978年就將大型潘毒理測試定為水體毒性試驗的必測項目。20世紀80年代， 大型潘毒理測試得到了很大的重視和發(fā)展，大型潘繁殖、生長等慢性毒理試驗逐步開展起 來。到了 20世紀90年代大型潘毒理測試技術得到更廣泛的應用，用于評價工業(yè)廢水、農 藥、化學藥品和水中沉積物對水環(huán)境的污染，為制定各種水質標準提供了科學依據(jù)。歐洲 經濟合作與發(fā)展組織（0E⑶）自從20世紀80年代建立了潘類毒性測試的化學品測試導 則后，仍在不斷對潘類毒性測試方法進行改進與完善。到目前為止0ECD對潘類毒性測試 的化學品測試導則已作了三次修訂，修改的地方主要包括測試的潘類品種、化學品的暴露 時間、測試的大型潘總數(shù)量及組數(shù)、測試培養(yǎng)基與喂養(yǎng)條件等方面。大型潘生態(tài)毒理測試 技術具有廣泛的技術前景，包括大型潘急性毒性試驗與大型潘繁殖試驗。0ECD最新標準 規(guī)定，大型潘繁殖試驗中必須對新生幼潘的雌雄進行鑒定并確定新生幼潘的性別比（0E⑶ Test Guidelines Programme. Reports of the workshop on the Daphnia magna Pilot Ring Test, Shelffield University, U.K.，20_21Marchl993·)。大型潘個體較?。w長 1. 7-4. 8mm)，雌雄無法肉眼分辨，要對試驗過程中的大量新生幼潘進行雌雄鑒別并計數(shù)是 非常繁瑣、耗時的工作，如何快速而準確地對大量新生幼潘進行雌雄鑒定成為大型潘生態(tài) 毒理測試技術的技術難點。
[0004] 本發(fā)明提供一種快速鑒別大型潘幼潘性別的方法，這種方法解決新生幼潘雌性與 雄性鑒別工作量大、耗時過長的問題，達到減少人工工作量和降低測試成本的目的，可應用 于快速統(tǒng)計雌性幼潘和雄性幼潘的數(shù)量。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速鑒別大型潘幼潘性別的方法，這種方法解決新生 幼潘雌性與雄性鑒別工作量大、耗時過長的問題，達到減少人工工作量和降低測試成本的 目的，可應用于快速統(tǒng)計雌性幼潘和雄性幼潘的數(shù)量。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種快速鑒別大型潘幼潘性別的方法，包括以下 步驟：
[0007] 1)將待鑒定的新生雌性和/或雄性幼潘放置于誘導簡易裝置中的試管內，向試管 內加入16. 5cm高的GFID培養(yǎng)基，新生雌性和/或雄性幼騷在GFID培養(yǎng)基中適應lh，將試 管底部以上2. 5cm部分稱為B體系，試管液面以下14cm部分稱為A體系，其中GFID培養(yǎng)基 包括濃度分別為 192mg/L NaHC03、120mg/L CaS04.2H20、120mg/L MgS04、8mg/L KC1，其pH值 和硬度分別為7· 6~8· 0、160~180mg CaC03/L ;
[0008] 2)將步驟1)中的試管放置于誘導簡易裝置的試管架上，把誘導簡易裝置在光照 強度為30 μ EAm2. s)、溫度為20°C條件下放置24h ;
[0009] 3)利用誘導簡易裝置的黑色塑料膜將經過步驟2)處理的新生幼潘置于黑暗環(huán)境 中5min后，每隔lmin分別對進入A體系或B體系中的雄性幼潘與雌性幼潘進行統(tǒng)計，并累 計20min內進入A體系或B體系中的雄性幼潘與雌性幼潘數(shù)量；
[0010] 4)步驟3)的統(tǒng)計結果為所有雌性幼潘進入A體系，所有雄性幼潘進入B體系。
[0011] 在上述方案中，所述步驟1)中，待鑒定的新生雄性幼潘是大型潘在溫度為4°C、種 群密度為10只/100mL培養(yǎng)液、喂食濃度為0. 2mg (V (潘·(!)、光照周期為12h、黑暗處理時 間為12h的誘導條件下進行有性生殖得到的。大型潘在這樣的誘導條件下，會改變它們的 生殖方式進行有性生殖，產生大量的雄性幼潘，為幼潘性別的快速鑒別方法提供試驗材料。
[0012] 在上述方案中，所述培養(yǎng)液為M4培養(yǎng)液，所述M4培養(yǎng)液包括濃度分別為 2.8595mg/L Η3Β03、0· 3605mg/L MnCl2 · 4Η20、0· 306mg/L LiCl、0. 071mg/L RbCl、0. 152mg/ L SrCl2*6H20、0.016mg/L NaBr、0.063mg/L Na2Mo04*2H20、0.01675mg/L CuC12*2H20、 0.013mg/L CaCl2.2H20、0.01mg/L ZnCl2、0.00325mg/L CoCl2.6H20、0.00219mg/ L KI、0.000575mg/L Na2Se03、2.5mg/L NH4V03、0.9955mg/L Na2EDTA.2H20、293.8mg/L FeS04.7H20、123.3mg/L MgS04.7H20、5.8mg/L KCl、64.8mg/L NaHC03、10mg/L Na2Si03.9H20、 0.274mg/L KH2P04、0. 143mg/L NaN03、0. 184mg/L K2HP04、0.075mg/L鹽酸硫胺、0.001mg/L氰 鈷胺、〇.〇〇〇75mg/L鈣長石。
[0013] 在上述方案中，所述誘導簡易裝置包括光照培養(yǎng)箱，所述光照培養(yǎng)箱內放置有試 管架，在所述試管架周圍包裹有黑色塑料膜，所述試管架上放置有6支的試管，所述光照培 養(yǎng)箱在試管上方處設置有光照強度可以調整的光源。幼潘性別的快速鑒別方法采用上述裝 置，操作簡便，也利于光照強度、溫度等參數(shù)的控制。
[0014] 在上述方案中，所述試管是口徑為2. 5cm、長為20cm的玻璃試管。
[0015] 在上述方案中，所述光源設置在試管頂端上方15cm處。
[0016] 本發(fā)明的原理在于：M4培養(yǎng)液富含多種營養(yǎng)物質，可能會影響大型潘對環(huán)境因子 的行為反應，如光照強度和溫度等，因此先將待鑒定雌雄的新生幼潘在GFID培養(yǎng)基先適應 lh，消除M4培養(yǎng)液對鑒別結果的影響；新生雌性幼潘與新生雄性幼潘對光照強度、溫度等 環(huán)境因子變化的應急反應不相同，因此先將待鑒定雌雄的新生幼潘在光照強度為30 μΕ/ (m2. s)、溫度為20°C條件下放置24h，接著黑暗環(huán)境中5min后，所有雌性幼潘進入Α體系， 所有雄性幼潘進入B體系。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：這種方法可以快速鑒別新生幼潘的性別，解決新生幼潘 雌性與雄性鑒別工作量大、耗時過長的問題，達到減少人工工作量和降低測試成本的目的， 可應用于快速統(tǒng)計雌性幼潘和雄性幼潘的數(shù)量。
【附圖說明】
[0018] 圖1為誘導簡易裝置的結構示意圖。
[0019] 圖中：光照培養(yǎng)箱1 ;試管架2 ;黑色塑料膜3 ;試管4 ;光源5。
【具體實施方式】
[0020] 以下結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述，但該實施例不應該理 解為對本發(fā)明的限制。
[0021] 本發(fā)明快速鑒別大型潘幼潘性別的方法所使用的新生雄性幼潘是大型潘通過有 性繁殖得到的。我們先進行篩選大型潘有性繁殖的最佳誘導條件，以產生大量的雄性幼潘， 為幼潘性別的快速鑒別方法提供試驗材料。我們設計多組如表1所示的試驗，結果顯示大 型潘在溫度為4°C、種群密度為10只/100mL培養(yǎng)液、喂食濃度為0. 2mg (V (潘·(!)、光照周 期為12h、黑暗處理時間為12h的誘導條件下進行有性生殖，產生數(shù)量最多的雄性幼潘，為 幼潘性別的快速鑒別方法提供試驗材料。
[0022] 本發(fā)明快速鑒別大型潘幼潘性別的方法所使用的誘導簡易裝置是我們自行設計 的，如圖1所示，其包括光照培養(yǎng)箱1，光照培養(yǎng)箱1內放置有試管架2,在試管架2周圍包 裹有黑色塑料膜3,試管架2上放置有六支口徑為2. 5cm、長為20cm的玻璃試管4,光照培養(yǎng) 箱1在試管4頂端上方15cm處設置有光照強度可以調整的光源5。
[0023] 實施例1
[0024] 一種快速鑒別大型潘幼潘性別的方法，包括以下步驟：
[0025] 1)誘導簡易裝置左邊三支試管4分別放置有10只24h內4°C誘導產生的新生雄 性幼潘，右邊三支試管4分別放置有10只24h內4°C誘導產生的新生雌性幼潘。向試管內 加入16. 5cm高的GFID培養(yǎng)基，新生幼潘在GFID培養(yǎng)基中適應lh，將試管4底部以上2. 5cm 部分稱為B體系，試管4液面以下14cm部分稱為A體系，其中GFID培養(yǎng)基包括濃度分別為 192mg/L、120mg/L、120mg/L、8mg/L 的 NaHC03、CaS04 · 2H20、MgS04、KC1，其 pH 值和硬度分別 為 7· 6 ~8· 0、160 ~180mg CaC03/L ;
[0026] 2)將步驟1)中的試管4放置于誘導簡易裝置的試管架2上，把誘導簡易裝置在光 照強度為30 μΕΛπι2. s)、溫度為20°C條件下放置24h ;
[0027] 3)利用誘導簡易裝置的黑色塑料膜3將經過步驟2)處理的新生幼潘置于黑暗環(huán) 境中5m