一種篩選抗衰老藥物的試劑盒及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種篩選抗衰老藥物的試劑盒及其使用方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 21世紀(jì)是人口老齡化的世紀(jì)，人口老齡化將帶來(lái)一系列非常嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)和社會(huì)問(wèn) 題[1]，面對(duì)龐大的老年群體，要從根本上提高他們的生存質(zhì)量，就要找到改善身體機(jī)能、延 緩衰老的方法。從中醫(yī)藥和化合物庫(kù)中篩選和開(kāi)發(fā)可預(yù)防及治療衰老相關(guān)疾病、延長(zhǎng)壽命 的安全有效的抗衰老藥物，逐漸成為今后我國(guó)新藥研制的熱點(diǎn)。
[0003] 學(xué)界認(rèn)為衰老機(jī)制在生物之間是進(jìn)化保守的，現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外抗衰老藥物篩選選用 的模型主要有細(xì)胞、果蠅、線(xiàn)蟲(chóng)、斑馬魚(yú)、小鼠和大鼠。細(xì)胞為模型的藥物篩選為體外藥物 作用研究，效率高但往往相關(guān)性差；果蠅的生活模式限制了其在高通量藥物篩選中的應(yīng)用； 斑馬魚(yú)在衰老方面由于培養(yǎng)條件和發(fā)育時(shí)間的問(wèn)題應(yīng)用有所限制 [2];鼠類(lèi)的建模實(shí)驗(yàn)操作 技術(shù)要求高且因其培養(yǎng)條件高和壽命周期長(zhǎng)導(dǎo)致篩選效率低、研究成本高昂[3]。而秀麗隱 桿線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，可以在瓊脂板上或是液體培養(yǎng)基中取食細(xì)菌（E.coli);世代周期短， 通常為3天左右；壽命短，通常為3周左右；秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)群體容易放大，而且可以大 量獲得同步化(生長(zhǎng)時(shí)期處于同一階段）的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)。秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)因?yàn)閴勖芷诙?和容易實(shí)現(xiàn)高通量的優(yōu)勢(shì)，成為衰老研究的理想模型 [4]。但是現(xiàn)階段，尚未出現(xiàn)基于上述秀 麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)模型的篩選抗衰老藥物的試劑盒，供本領(lǐng)域研發(fā)人員高效準(zhǔn)確地篩選抗衰老藥 物。
[0004] 對(duì)此，本發(fā)明特提供一種篩選抗衰老藥物的試劑盒，使用該試劑盒能夠快速準(zhǔn)確 地篩選抗衰老藥物，本發(fā)明同時(shí)提供上述試劑盒的使用方法。
[0005] 此外，在篩選化合物的抗衰老藥效時(shí)，壽命分析實(shí)驗(yàn)均采用固體NGM培養(yǎng)基。但 是，NGM培養(yǎng)基會(huì)隨著水分蒸發(fā)逐漸干燥，涂在培養(yǎng)基表面的大腸桿菌0P50也會(huì)隨著秀麗 隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的取食逐漸消耗殆盡，秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)會(huì)因失水或饑餓影響其正常壽命。同時(shí)，在篩 選化合物的抗衰老藥效時(shí)，研究者在壽命分析實(shí)驗(yàn)普遍采用在秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)生育期每天轉(zhuǎn) 板、生育期結(jié)束后2飛天轉(zhuǎn)板一次直至壽命實(shí)驗(yàn)的結(jié)束 [5'6]，或者每天轉(zhuǎn)板直至秀麗隱桿線(xiàn) 蟲(chóng)全部死亡[7'8]。然而該方法由于頻繁轉(zhuǎn)板會(huì)對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)，尤其是衰老秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)造 成機(jī)械損傷，導(dǎo)致秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)非自然死亡，進(jìn)而影響壽命。以上缺陷均會(huì)給所篩藥物的抗 衰老藥效分析增加影響因素。
[0006] 并且，頻繁轉(zhuǎn)板也會(huì)帶來(lái)其他問(wèn)題，諸如藥物用量大、人工工作量大、容易污染等。
[0007] 因此，本發(fā)明基于上述問(wèn)題，提供了一種使用特殊結(jié)構(gòu)的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)專(zhuān)用培養(yǎng) 皿的試劑盒，省去了秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)培養(yǎng)過(guò)程中因?yàn)镹GM培養(yǎng)基損耗帶來(lái)的轉(zhuǎn)板過(guò)程，簡(jiǎn)化 培養(yǎng)過(guò)程，節(jié)約成本，方便操作，適合在篩選抗衰老藥物的領(lǐng)域大規(guī)模推廣。
[0008] 【1】蘇柳竹.我國(guó)人口老齡化研究及應(yīng)對(duì)措施[J]，科技故事博覽：科教創(chuàng) 新，2011，（5) :198-198. 【2】賈熙華，曹誠(chéng).秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用和進(jìn)展[J]，藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2009, 44(7) : 687. 【3】杜艷，吳海標(biāo).動(dòng)物衰老模型及艾灸抗衰老實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J]，廣西中醫(yī)學(xué)院 學(xué)報(bào)，2008，11(003) : 88-90. 【4】OlsenA,VantipalliMC,LithgowGJ.UsingCaenorhabditiselegansasa modelforagingandage-relateddiseases.AnnNYAcadSci, 2006, (5) : 120-8 【5】D.Srivastava,U.Arya,T.SoundaraRajanetal.Reserpinecanconfer stresstoleranceandlifespanextensioninthenematodeC.elegans[J],Biogerontolo gy，2008, 9: 309-316.
[6]AndersOlsen,M.C.Vantipalli,G.J.Lithgow.Lifespanextension ofC.elegansfollowingrepeatedmildhormeticheattreatments[J], Biogerontology, 2006, 7:221-230. 【7】尹大強(qiáng)，于振洋，胡霞林等.用秀麗線(xiàn)蟲(chóng)測(cè)定藥品與個(gè)人護(hù)理品的世代毒性的方 法·中國(guó).200810207706.X[P]· 2009-12-25. 【8】于笑坤，何瀟瀟，付學(xué)奇，馬俊峰。水溶性人參皂苷對(duì)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)生物學(xué)功能的 影響【J】，吉林大學(xué)學(xué)報(bào)，2012, 7, 50 (4) :812-814.。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種篩選抗衰老藥物的試劑盒，使用該試劑盒能夠篩選出抗 衰老藥物。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種無(wú)需轉(zhuǎn)板的篩選抗衰老藥物的試劑盒，該試劑盒 能夠避免因?yàn)轭l繁轉(zhuǎn)板使秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)受到機(jī)械損傷造成非自然死亡，進(jìn)而影響壽命分析 實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的問(wèn)題。同時(shí)，減少培養(yǎng)過(guò)程大腸桿菌0P50和無(wú)菌水的添加頻率，簡(jiǎn)化培養(yǎng)過(guò) 程，節(jié)約成本，方便操作。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述篩選抗衰老藥物的試劑盒的使用方法。
[0011] 本發(fā)明提供一種篩選抗衰老藥物的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括以下試 劑： ① 、試劑A:秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)； ② 、試劑B:NGM培養(yǎng)基； ③ 、試劑C:大腸桿菌0P50 ; ④ 、試劑D:氟脲苷； ⑤ 、試劑E:無(wú)菌水。
[0012] 其中，所述秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的濃度為100條/20ul，大腸桿菌0P50的濃度為10mg/ ml,氟脲苷的濃度為50μΜ,無(wú)菌水的體積為50-100μL。
[0013] 所述秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)為同步化線(xiàn)蟲(chóng)，秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)同步化的步驟如下：用Μ9緩沖液 將平板上的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)沖下來(lái)，將沖洗液吸入離心管；4000rpm/min離心3min，去除上 清；加入裂解液，終濃度：3. 2%NaCIO和1MNaOH;在渦旋儀上震蕩7min，使秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的 蟲(chóng)體破裂釋放卵；4000rpm/min離心3min，去除上清，收集沉淀獲得大量的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng) 卵；M9緩沖液沖洗兩次，加入lmlM9緩沖液，置于20°C培養(yǎng)箱中孵化48小時(shí)。
[0014] 所述試劑盒還含有秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)專(zhuān)用培養(yǎng)皿，該培養(yǎng)皿皿蓋為環(huán)形鏤空形狀，鏤 空部位覆蓋有封口膜，培養(yǎng)皿中加有NGM培養(yǎng)基。
[0015] 所述試劑C為含有大腸桿菌0P50活菌的凍干粉或菌液。
[0016] 本發(fā)明還提供上述篩選抗衰老藥物的試劑盒的使用方法： (1) 將含有待測(cè)藥物的溶液與NGM培養(yǎng)基混勻，倒入秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)專(zhuān)用培養(yǎng)皿中，制板 待用，NGM培養(yǎng)基中含有濃度為50μΜ的氟脲苷，其中，空白組使用等量無(wú)菌水替換含有待 測(cè)藥物的溶液； (2) 將L4期同步化的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)，用鉬絲挑針轉(zhuǎn)移到各藥物組和空白組的秀麗隱桿 線(xiàn)蟲(chóng)專(zhuān)用培養(yǎng)皿中，藥物組為含有不同濃度待測(cè)藥物的NGM培養(yǎng)基，每個(gè)藥物濃度三個(gè)平 行，每平行板25~30條秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)，置于20°C培養(yǎng)，每天觀(guān)察并計(jì)數(shù)秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)存活 數(shù)和死亡數(shù)； (3) -周后培養(yǎng)皿開(kāi)始干燥，秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)開(kāi)始出現(xiàn)皮膚略顯皺縮、狀態(tài)不活躍、行動(dòng) 略緩，菌斑鏡下觀(guān)察已接近無(wú)菌等缺水、缺大腸桿菌0Ρ50表現(xiàn)，此時(shí)在無(wú)菌超凈臺(tái)中打開(kāi) 皿蓋，用移液器加入定量無(wú)菌水50-100μL和大腸桿菌0Ρ50 20-50μL，10mg/mL;加完后靜 置，待水和菌皆滲入NGM培養(yǎng)基中將培養(yǎng)基正置，用封口膜封皿，重置20°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)； 約一周又出現(xiàn)干燥和缺菌狀態(tài)，重復(fù)上述補(bǔ)充水分和菌的操作，補(bǔ)充無(wú)菌水需持續(xù)到整個(gè) 壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)束，而補(bǔ)充大腸桿菌0P50視具體情況，25-30條秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)約需補(bǔ)充2次； (4) 用挑針輕觸，秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)無(wú)反應(yīng)則判定為死亡；爬到培養(yǎng)皿邊緣或皿蓋干死、鉆 到瓊脂里面的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)從實(shí)驗(yàn)中排除； (5) 采用相關(guān)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、分析，計(jì)算出秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的平均壽命，平均 壽命顯著高于空白組則證明藥物具有抗衰老活性，平均壽命低于或等于空白組則證藥物不 具有抗衰老活性，以此評(píng)價(jià)藥物的抗衰老活性。
[0017] 本發(fā)明的有益效果： 1、本發(fā)明提供一種基于秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)模型的篩選抗衰老藥物的試劑盒，該試劑盒檢測(cè) 結(jié)果準(zhǔn)確，使用方法簡(jiǎn)單，適合在篩選抗衰老藥物的領(lǐng)域大規(guī)模推廣。
[0018] 2、本發(fā)明所述試劑盒使用特殊結(jié)構(gòu)的秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)專(zhuān)用培養(yǎng)皿，使用該培養(yǎng)皿能 夠在減少NGM培養(yǎng)基中水分蒸發(fā)的同時(shí)，保證秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)生存所需的氧氣，同時(shí)減少無(wú) 菌水和大腸桿菌0P50的添加頻率，補(bǔ)加水以1周為周期，補(bǔ)加菌以1周為周期，重復(fù)過(guò)程直 至壽命實(shí)驗(yàn)結(jié)束，使培養(yǎng)過(guò)程更簡(jiǎn)便，延長(zhǎng)NGM培養(yǎng)基的使用時(shí)間。省去了秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)培 養(yǎng)過(guò)程中因?yàn)镹GM培養(yǎng)基損耗帶來(lái)的轉(zhuǎn)板過(guò)程，避免因?yàn)轭l繁轉(zhuǎn)板使秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)受到機(jī) 械損傷造成非自然死亡，進(jìn)而影響壽命分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果的問(wèn)題；同時(shí)解決因?yàn)轭l繁轉(zhuǎn)板帶來(lái) 的諸如藥物用量大、人工工作量大、容易污染等其他問(wèn)題。
[0019] 以下提供具體實(shí)施例以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述的篩選抗衰老藥物的試劑盒，但不限于這 些實(shí)施例。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 實(shí)驗(yàn)生物： 秀而隱桿線(xiàn)蟲(chóng)早衰模型株系TK22,購(gòu)買(mǎi)于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。 秀而隱桿線(xiàn)蟲(chóng)正常株系N2,購(gòu)買(mǎi)于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。 細(xì)菌株：尿啼陡滲漏突變型大腸桿菌0P50,購(gòu)買(mǎi)于TheCaenorhabditisGenetics Center(CGC)。
[0021] 培養(yǎng)基： NGM培養(yǎng)基：NaClL5g，K2HP04L3g，ΚΗ2Ρ04 8 . 5g，蛋白胨L4g，瓊脂粉 8. 5g，蒸餾水 500mL。滅菌后加入過(guò)濾除菌的500μL膽固醇（5mg/ml，無(wú)水乙醇配制)，高壓蒸汽滅菌的 50〇μL1mol/LMgS04, 500μLlmol/LCaCl2〇
[0022] M9 緩沖液：NaCl1. 98g，Na2HP04 2 . 38g，ΚΗ2Ρ04 1. 20g，MgS04 0· 048g，蒸餾水 400mL。
[0023]LB液體培養(yǎng)基