為R-Glul-〇rn2-Tyr3-l'虹4-Glu5-Val6-Pro7-Gln8-l'虹9-IlelO， 根據(jù)14至18個(gè)碳原子的飽和或不飽和控鏈（R)的大小而異。圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的方 法由枯草芽抱桿菌EA-CB0015生產(chǎn)的各種豐原素的結(jié)構(gòu)。
[0042] 豐原素C的各種同源物，W及表面活性膚和伊枯草菌素，可通過常規(guī)技術(shù)例如高 效液相色譜法（冊LC)進(jìn)行分離。生產(chǎn)的表面活性膚對應(yīng)于具有13至16個(gè)碳原子控鏈長 度的不同的同源物；伊枯草菌素對應(yīng)于具有14和15個(gè)碳原子的伊枯草菌素A。
[0043] 至于解淀粉芽抱桿菌EA-CB0959,通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的代謝物對應(yīng)于各種表 面活性膚同源物（C12至C15)、兩種伊枯草菌素A同源物（C14和C15)、W及兩種豐原素亞型 (A和B)，其具有4種豐原素A同源物（C14、C15、C16和C17)和2種豐原素B同源物（C16 和C17)。
[0044] 在本發(fā)明的另一方面，通過本發(fā)明的方法獲得的枯草芽抱桿菌EA-CB0015的生物 質(zhì)或解淀粉芽抱桿菌EA-CB0959的生物質(zhì)能抑制各種植物病原體的生長，植物病原體例如 斐濟(jì)球腔菌、灰霉病菌、立枯絲核菌、尖抱鑲刀菌、腐皮鑲刀菌W及炭痘病菌。運(yùn)種抑制可W 使用雙碟等技術(shù)測定，包括比較植物病原體培養(yǎng)于含有和不含待評價(jià)活性物質(zhì)的培養(yǎng)基時(shí) 的生長情況。測得的體外抑制百分比總是高于50%。
[0045] 實(shí)施本發(fā)明的方法后，可W從獲得的生物質(zhì)和/或代謝物中制備不同的組合物或 者制劑，W生產(chǎn)理化性質(zhì)穩(wěn)定的生物殺傷組合物，保證長時(shí)間內(nèi)組合物中微生物的活力和 代謝物的活性。
[0046] 運(yùn)些組合物可在適宜的密封容器內(nèi)制備W避免污染。添加生物質(zhì)和/或其代謝 物、助劑及其它成分W得到均勻的混合物。運(yùn)樣得到的最終產(chǎn)品可在適宜的容器中收集，并 儲(chǔ)存于室溫。
[0047] 在又一方面，本發(fā)明設(shè)及包含枯草芽抱桿菌EA-CB0015、解淀粉芽抱桿菌 EA-CB0959和/或其活性代謝物的生物殺傷組合物，單獨(dú)的或是與其它活性劑一起，W增強(qiáng) 生物活性。本發(fā)明的生物殺傷組合物可包含一種或多種助劑及農(nóng)用化學(xué)品可接受的載體。
[0048] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的生物殺傷組合物包括80. 0至99. 9 %w/w的濃度 為lxl07alxl〇iiCFU/mL的枯草芽抱桿菌EA-CB0015的水性懸液，W及由2. 0%至4. 0%w/v 的簇甲基纖維素鋼（CMC)、1. 0%至5. 0%v/v3M憐酸鹽緩沖液（pH5. 0)、1. 0%至4. 0%v/ v的甘油、0.25%至0.75%v/v吐溫2妒\0.25%至0.5%v/vTritonX-]0爐'、0.01%至 I. 0%v/v山梨酸鐘、0. 05%a0. 15% /v的黃原膠、0. 2%至I. 5%w/v的脫脂奶及0. 028% 至1. 0%w/v的二氧化鐵組成的混合物。該組合物為白色，抑為4. 0至6. 5,且粘度為20至 80邱。
[0049] 在一個(gè)進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的生物殺傷組合物還包括化學(xué)殺蟲劑， 例如苯胺基喀晚、bitartenol、醬醇、苯酸甲環(huán)挫、戊挫醇、氣環(huán)挫、代森儘鋒、百菌清及其它 用于生物防治害蟲的藥劑，W及一種或多種農(nóng)用化學(xué)品可接受的載體中的助劑。
[0050]在又一方面，本發(fā)明設(shè)及使用芽抱桿菌種微生物，尤其是使用枯草芽抱桿菌 EA-CBOO15、解淀粉芽抱桿菌EA-CB0959和/或其代謝物，及其生物殺傷組合物，W抑制植物 病原微生物的生長，植物病原微生物例如農(nóng)作物中的斐濟(jì)球腔菌、尖抱鑲刀菌、青枯病菌、 灰霉病菌、炭痘病菌、念珠菌屬、立枯絲核菌和腐皮鑲刀菌。
[0051] 在又一方面，本發(fā)明設(shè)及治療植物抵抗由各種植物病原體導(dǎo)致的感染的方法，包 括將有效量的芽抱桿菌種微生物施加給植物，尤其是枯草芽抱桿菌EA-CB0015和解淀粉芽 抱桿菌EA-CB0959和/或其代謝物，或者使用含有它們的生物殺傷組合物，單獨(dú)的或是與其 它生物殺傷劑一起使用。
[0052] 施藥可通過噴灑范圍從0. 1至10升每公頃化Aa)的劑量來進(jìn)行，W含合適載體 的混合物或與含一種或多種殺蟲劑的其它組合物的混合物的形式進(jìn)行。
[0053]W下實(shí)施例將進(jìn)一步對本發(fā)明進(jìn)行說明，然而本發(fā)明的概念并不限于此。
[0054] 實(shí)施例
[00巧]連施例1、巧取巧和巧蔭
[0056] 芽抱桿菌的菌株從香蕉的CV.Granenano和CV.Vale巧栽培品種W及大蕉的 CV.Harton品種中獲得。為每個(gè)栽培品種選擇一個(gè)種植園，并設(shè)立五個(gè)點(diǎn)，使用不重復(fù)隨機(jī) 概率抽樣在開花前收集=種植株的混合樣品。在每個(gè)植株編號(hào)為2、5和10的樹葉上進(jìn)行 取樣，每片樹葉被分解W選擇頂部區(qū)域和底部區(qū)域。
[0057] 細(xì)菌的分離通過用憐酸鹽緩沖液和吐溫勤尹洗涂W及超聲處理樣品而進(jìn)行。采用 連續(xù)稀釋并鋪板于TSA表面（膜蛋白腺大豆瓊脂，Merck, 10% )。對革蘭氏陽性細(xì)胞進(jìn)行 純化，培養(yǎng)于芬利菲爾德培養(yǎng)基（FinleyandField'smedium) (150;rpm，4天，30°C)，并使 之接受熱休克（80°C，20分鐘）。所有的AEFB(好氧內(nèi)生芽抱生成細(xì)菌）于-80°C儲(chǔ)存在 TSB(膜蛋白腺大豆肉湯，Merck)和甘油（20%v/v)中，并于每次試驗(yàn)使用前在50%的TSA 中活化。
[0058]連施例2、巧取枯草巧和巧蔭EA-CB0015巧解淀粉巧和巧蔭EA-CB0959的牛物質(zhì)
[0059] 枯草芽抱桿菌EA-CBOO15菌株在50%的TSA中復(fù)制并于30°C培養(yǎng)48小時(shí)。該菌 株的菌落被接種于培養(yǎng)基D，并于30°C及20化pm下培養(yǎng)12小時(shí)。該培養(yǎng)物被用作預(yù)接種 物。用IOmL培養(yǎng)基D在50mL燒瓶中進(jìn)行發(fā)酵，溫度為30°C，在定軌振蕩器中轉(zhuǎn)速為20化pm。 每個(gè)錐形瓶用ImL調(diào)節(jié)至ODe。。值為1的細(xì)菌懸液接種，并于生長12小時(shí)后獲得。獲得的 枯草芽抱桿菌EA-CB0015的細(xì)胞密度高達(dá)13. 2 + 1. 7g/L。
[0060] 為了評價(jià)本方法在獲取枯草芽抱桿菌EA-CB0015的生物質(zhì)中的表現(xiàn)，將使用本 發(fā)明的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基D)得到的生物質(zhì)的量與使用CIB、M0LP、芬利菲爾德（Finleyand Field's)和TSB培養(yǎng)基得到的生物質(zhì)的量進(jìn)行比較。
[0061] 在本發(fā)明的培養(yǎng)基中得到的細(xì)胞密度比在芬利菲爾德培養(yǎng)基中得到的細(xì)胞密度 (0. 6 + 0.Ig/L)高29. 3倍，比在TSB培養(yǎng)基中得到的細(xì)胞密度化95 + 0. 4g/L)高4. 5倍， 比在CIB培養(yǎng)基中得到的細(xì)胞密度化65 + 0. 8g/L)高3. 6倍，比在MOLP培養(yǎng)基中得到的 細(xì)胞密度（4. 1 + 0. 6g/L)高3. 2倍，如圖2所示。
[0062] 按照相同的方法，得到解淀粉芽抱桿菌EA-CB0959的生物質(zhì)。對于枯草芽抱桿菌 EA-CB0015,使用本發(fā)明的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基D)得到的生物質(zhì)的量高于使用MOLP和TSB培養(yǎng) 基得到的生物質(zhì)的量。用本發(fā)明的培養(yǎng)基獲得的細(xì)胞密度范圍在8. 0至10.Og/L之間。
[0063]連施例3、提取及測定枯草巧和巧蔭EA-CB0015巧解淀粉巧和巧蔭EA-CB0959的活 忡代謝物
[0064] 從根據(jù)實(shí)施例2得到的枯草芽抱桿菌EA-CB0015培養(yǎng)物，使用甲醇進(jìn)行其活性代 謝物的提取。隨后，使用甲醇作為有機(jī)溶劑進(jìn)行固相萃?。⊿PE)，活性組分由帶有紫外檢測 器的反相HPLC在波長為214皿處進(jìn)行純化。
[006引圖3示出了相應(yīng)的色譜圖。16至19分鐘間的洗脫峰對應(yīng)于伊枯草菌素A(圖3A)， 峰Pl至P14 (圖3B)對應(yīng)于豐原素C，W及峰P15至P19 (圖3B)對應(yīng)于表面活性膚。一些 活性代謝物也通過ESI-MS/MS(電噴霧質(zhì)譜）鑒定，如圖4和5所示。
[0066] 為了評價(jià)本方法在獲取枯草芽抱桿菌EA-CB0015的兩組活性代謝物中的表現(xiàn)，將 使用本發(fā)明的培養(yǎng)基（培養(yǎng)基D)得到的代謝物的量與使用CIB、M0LP、芬利菲爾德（Finley andField'S)和TSB培養(yǎng)基得到的代謝物的量進(jìn)行比較。如圖6所示，當(dāng)在過程中使用本 發(fā)明的培養(yǎng)基D時(shí)，峰面積及得到的代謝物的量更高。
[0067] 按照與前述相同的提取和HPLC純化步驟，對解淀粉芽抱桿菌EA-CB0959生產(chǎn)的代 謝物進(jìn)行鑒定，對應(yīng)于各種表面活性膚同源物（C12和C15)，兩種伊枯草菌素A同源物（C14 和C15)，W及兩種豐原素亞型（A和B)，其具有4種豐原素A同源物（C14、C15、C16和C17) 和2種豐原素B同源物（C16和C17)。
[0068]連施例4、評價(jià)枯草巧和巧蔭EA-CB0015巧解淀粉巧和巧蔭EA-CB0959對植物病原 微牛物的活忡
[0069]使用環(huán)法對抗真菌活性進(jìn)行評價(jià)。簡言之，在含馬鈴馨葡萄糖瓊脂（PDA)的陪替 氏培養(yǎng)皿（Petridish)(直徑為9cm)中制作枯草芽抱桿菌EA-CB0015的圓形印記（直徑 為6cm)，然后將真菌（生長了10天）的盤（直徑為5mm)置于其中屯、。僅使用真菌盤接種 的陪替氏培養(yǎng)皿作為絕對對照（油solutecontrol)，當(dāng)真菌的生長達(dá)到細(xì)菌所形成的圓的 直徑時(shí)，測量徑向菌絲生長。
[0070] 實(shí)驗(yàn)具有完全隨機(jī)的單變量的設(shè)計(jì)，每個(gè)處理重復(fù)=次。建立的響應(yīng)變量為菌絲 生長抑制百分比，其根據(jù)絕對對照的生長作為100%進(jìn)行計(jì)算。如圖7所示，枯草芽抱桿菌 EA-CB0015產(chǎn)生的抑制百分比在盤多毛抱屬（PestalotiaSP.)上約為20%，在芙腐病菌 (Moniliophthoraroreri)上約為 80%。
[0071] 此外，枯草芽抱桿菌EA-CB0015還表現(xiàn)出對各種微生物的抗細(xì)菌活性，包括青枯 病菌，在BGTA培養(yǎng)基中產(chǎn)生高達(dá)6毫米的抑制區(qū)。對青枯病菌的定量括抗試驗(yàn)通過在BGTA 瓊脂表面接種100yL的青枯病菌懸液進(jìn)行，青枯病菌懸液調(diào)節(jié)至l〇6CFU/mL。然后，將枯草 芽抱桿菌EA-CB0015的TSA盤巧mm)于30°C培養(yǎng)48小時(shí)。最后，在72小時(shí)之后測定產(chǎn)生 的抑制區(qū)。
[0072] 按照與上述相同的方法，評價(jià)解淀粉芽抱桿菌EA-CB0959對尖抱鑲刀菌、斐濟(jì)球 腔菌和青枯病菌的活性，分別為抑制百分比58. 5%和76%，及抑制半徑10. 9mm。
[0073]連施例5、評價(jià)枯草巧和巧蔭EA-CB0015巧解淀粉巧和巧蔭EA-CB0959對蘋濟(jì)球脖 蔭的活忡
[0074] 為了選擇括抗細(xì)菌，使用化IcSez2006[10]的改良方法的微孔板技術(shù)進(jìn)行初步篩 選。快速確定了當(dāng)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，哪種分離的AEFB的無細(xì)胞上清液（CF巧能對斐 濟(jì)球腔菌產(chǎn)生菌絲生長抑制。
[00巧]為了評價(jià)，使用了斐濟(jì)球腔菌EASGK09、斐濟(jì)球腔菌EASGK10、斐濟(jì)球腔菌EASGK11 和斐濟(jì)球腔菌EASGK14菌株，按照Dupont, 1982 [11]的方法分離自CV.Granenano