丁香葉忍冬快速繁殖方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及丁香葉忍冬無菌快速繁殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丁香葉忍冬是北京市二級瀕危植物，在北京市域范圍內(nèi)記錄有7株，但僅見一株。為了拯救該瀕危植物，首先應(yīng)該擴大其種群個體數(shù)量，但是多年來一直沒有采集到種子，只能通過摸索組培快繁的手段獲得一定數(shù)量的單株，并利用建立的丁香葉忍冬快速繁殖技術(shù)對周邊省區(qū)種源進行繁殖，然后與北京本地種源一同重新栽培到野生環(huán)境，實現(xiàn)丁香葉忍冬的野外回歸。然而，建立丁香葉忍冬無菌快速繁殖體系異常困難。
[0003]因而，建立有效的丁香葉忍冬無菌快速繁殖體系，意義重大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的:
[0005]建立丁香葉忍冬無菌快速繁殖體系異常困難，在第一步至外植體接種過程均有許多難題需解。良種、珍稀瀕危植物快繁最常用的外植體為單芽莖段，然而丁香葉忍冬外植體單芽莖段接種后，要么污染、要么被消毒液殺死，多種消毒液、多濃度梯度配合外植體消毒試驗發(fā)現(xiàn)，丁香葉忍冬單芽莖段含有內(nèi)生菌，而且是內(nèi)生真菌，導(dǎo)致了外植體引入的失敗；若以葉片作為外植體，雖然可以建立無菌體系，但是叢生芽誘導(dǎo)率極低，而且變異幾率可能較大，不能作為丁香葉忍冬快速繁殖的有效途徑。
[0006]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種能夠有效的丁香葉忍冬無菌快速繁殖方法。
[0007]根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種丁香葉忍冬快速繁殖方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟:
[0008](1)制備外植體:取帶微量木質(zhì)部的丁香葉忍冬芽體，利用單面刀片剝離芽鱗，隨后從基部快速去除葉柄，繼續(xù)剝離基部芽鱗；待芽鱗被完全剝離后，接著向枝條皮部延伸，將芽基部周圍枝條表皮層全部剝離干凈，保留少許淡綠色形成層；刀口稍微傾斜，芽基部上下各一刀，注意絕不將木質(zhì)部切透，以刀尖輕挑芽體基部，使芽帶有不超過0.5mm厚的木質(zhì)部，作為外植體；
[0009](2)消毒:在超凈臺內(nèi)，用經(jīng)過高壓滅菌的鑷子將切制獲得的外植體移至盛有10 %的新鮮過氧化氫溶液的三角瓶中，滴入3-5滴吐溫-60，震蕩12分鐘，然后倒出過氧化氫溶液，并用無菌水沖洗外植體，瀝干水分，準(zhǔn)備接種；
[0010](3)接種:迅速將經(jīng)過消毒的外植體從所述三角瓶移至盛有啟動增殖培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進行封閉培養(yǎng)，其中芽體基部的木質(zhì)部要完全浸入培養(yǎng)基；
[0011](4)待所述培養(yǎng)瓶中的外植體生出叢生芽后，將所述叢生芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，以便獲得生根苗；
[0012](5)將所述生根苗進行煉苗移栽。
[0013]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方法能夠有效地進行丁香葉忍冬快速繁殖，并且相對于現(xiàn)有的丁香葉忍冬快速繁殖技術(shù)，本發(fā)明的方法污染率、死亡率低，接種成活率、叢生芽誘導(dǎo)和生根率高。
[0014]另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例的丁香葉忍冬快速繁殖還可以具有如下附加的技術(shù)特征:
[0015]根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述丁香葉忍冬芽體來源于野生丁香葉忍冬植株的一年生枝條。由此，丁香葉忍冬芽體健康易成活，且生長旺盛，易于誘導(dǎo)叢生芽，有利于快繁的進行。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的實施例，于8月下旬至9月上旬采集所述丁香葉忍冬芽體，并在制備外植體之前保濕避光保存。由此，外植體易成活，便于后續(xù)步驟的進行。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的實施例，在制備外植體之前，進一步包括對所述丁香葉忍冬芽體進行預(yù)處理的步驟。由此，能夠有效降低污染率，提高后續(xù)接種成活率。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的實施例，按照以下步驟進行所述預(yù)處理:從頂芽開始將所述丁香葉忍冬芽體自上而下自來水沖洗6分鐘；將芽體下剪口蘸75%醫(yī)用酒精30秒，用小塊保鮮膜封包下剪口 ；然后將整個芽體放入含0.2%洗滌靈的溶液中浸泡20分鐘；無菌水沖洗2遍。由此，后續(xù)污染率低，接種成活率高。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟(1)中，制備外植體時:
[0020]取3片鋒利的單面刀片，在75%醫(yī)用酒精中浸泡5分鐘；取出刀片于酒精燈上灼燒10秒，刀背放入小卡槽內(nèi)降溫；保持1個刀片在浸泡，1個刀片在降溫，1個刀片在手中切制外植體，每使用刀片做5-6個動作后，更換刀片。由此，能夠有效避免交叉污染，降低污染率，提高后續(xù)接種成活率。
[0021]根據(jù)本發(fā)明的實施例，取用降至室溫的刀片剝離芽鱗，以免灼傷芽體。
[0022]根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟(2)中，每個三角瓶最多消毒5個外植體。由此，能夠有效降低污染率，提高后續(xù)接種成活率。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟(2)中，倒出過氧化氫溶液時，要一邊緩緩傾倒、一邊同時旋轉(zhuǎn)消毒三角瓶，使消毒液流經(jīng)瓶口每個部位。由此，能夠有效降低污染率。
[0024]根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟(2)中，用無菌水沖洗外植體沖洗3-5遍。由此，能夠有效避免因消毒液殘留而傷害外植體。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟(3)中，每個培養(yǎng)瓶接種一個外植體。由此，能夠有效降低污染率，提高接種成活率。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟(3)中，所述啟動增殖培養(yǎng)基為添加有2.5mg/L6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)和0.lmg/L NAA (萘乙酸)的WPM培養(yǎng)基(Woody Plant medium)。由此，能夠有效誘導(dǎo)外植體生出叢生芽。
[0027]根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟(4)中，所述生根培養(yǎng)基為添加了 0.lmg/L NAA和0.3mg/L IBA的1/2MS培養(yǎng)基。由此，能夠有效誘導(dǎo)叢生芽生根，獲得健壯的生根苗。
[0028]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
【附圖說明】
[0029]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0030]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，切制帶微量木質(zhì)部的丁香葉忍冬芽體的示意圖；
[0031]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，培養(yǎng)瓶中木質(zhì)部完全浸入培養(yǎng)基的外植體；以及
[0032]圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，培養(yǎng)瓶中長出叢生芽的外植體。
【具體實施方式】
[0033]下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0034]實施例1:
[0035]根據(jù)本發(fā)明的丁香葉忍冬快速繁殖方法，按照以下步驟，進行丁香葉忍冬快速繁殖:
[0036]1、采集枝條
[0037]本發(fā)明所使用的外植體是帶微量木質(zhì)部的丁香葉忍冬芽體，因而，要按照以下要求采集材料:
[0038]1.1采集時間:8月下旬至9月上旬最佳，較冬季和春季更為飽滿，枝條皮層活細(xì)胞較多，容易剝離。
[0039]1.2采集方法:中午以后12點至下午2點，在野生丁香葉忍冬植株上采集，用鋒利剪刀剪取一年生枝條，另取用一把干凈小剪刀迅速從葉柄中下部剪掉葉片，保留一小段葉柄，用以保護腋芽，同時特別注意不