速率迅速降溫至_196°C ;
步驟四:存入液氮罐中保存。
[0033]實(shí)驗(yàn)凍存材料:按照美國臍帶血庫標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程無菌采集健康、足月分娩產(chǎn)婦的臍帶血，采集后24h內(nèi)處理。
[0034]實(shí)驗(yàn)方法:
按上述四個步驟凍存干細(xì)胞24h后，
步驟五:將凍存液從液氮中取出，投入LNG中升溫lmin ;
步驟六:將凍存液從LNG中取出，在真空狀態(tài)下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升溫速率迅速降溫至3.2-3.9°C ；
步驟七:將凍存液倒入0.9%的鹽水中，維持溫度在3.2-3.9°C的條件下，在次聲波(頻率為8~13Hz)振蕩條件下加入17%的不含纖維蛋白原的人血清白蛋白，3%的γ-球蛋白，0.8%~1%的單糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巰基乙醇，調(diào)節(jié)體系的pH為6.8-7.6，加入1.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸，繼續(xù)在次聲波條件下振蕩30~45s ；
步驟八:將稀釋后的凍存液在400r/min的條件下離心5min，去除上清液，向細(xì)胞沉淀中加入0.21%~0.23%的細(xì)胞生長因子，重新懸浮細(xì)胞。
[0035]測定細(xì)胞的復(fù)蘇率:將3X 105個復(fù)蘇凍存干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計數(shù)板計算出培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式:復(fù)蘇率=培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)+ (3X105X增值率)，得到凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率；同時將3 X 105個P2代干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計數(shù)板計算出培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式:增值率=培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)+ (3X 105)。
[0036]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:測得復(fù)蘇率為97.6% (圖1上圖為未凍存的干細(xì)胞，下圖為凍存24h后復(fù)蘇的干細(xì)胞)
實(shí)施例2
一種低冷凍損傷的臍帶血干細(xì)胞凍存方法，包括以下幾個步驟:
步驟一:抽取骨髓，提純分離出單個核細(xì)胞，將原代細(xì)胞接種培養(yǎng)48h后，在含有8mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油鈉和37.5mg/L的2-磷酸抗壞血酸的培養(yǎng)液中，5%C02的培養(yǎng)箱中，37°C的溫度下培養(yǎng)8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培養(yǎng)液進(jìn)行第1次傳代；以1.3X 104/cm2的細(xì)胞密度接種，培養(yǎng)至P2代；
步驟二:將P2代臍帶血干細(xì)胞團(tuán)完全浸泡在0.6%NaCl和67.9%去離子水的混合溶液中，維持溫度在3.9°C的條件下，在次聲波振蕩頻率為13Hz的條件下加入3.2%的DMS0，5%的聚乙二醇，0.5%的葡萄糖，0.7%的果糖，17%的不含纖維蛋白原的人血清白蛋白，3%的γ -球蛋白，2.3%的Rho抑制劑，其中Rho抑制劑為Y-27632、法蘇地爾和羥基法蘇地爾1:1:1的混合物，DMS0的濃度為0.37g/mL，聚乙二醇的濃度為0.55g/mL，繼續(xù)在次聲波條件下振蕩45s，加入玻璃化液；
步驟三:將步驟二中制得的混合液在真空狀態(tài)下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降溫速率迅速降溫至_196°C ;
步驟四:存入液氮罐中保存。
[0037]實(shí)驗(yàn)凍存材料:按照美國臍帶血庫標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程無菌采集健康、足月分娩產(chǎn)婦的臍帶血，采集后24h內(nèi)處理。
[0038]實(shí)驗(yàn)方法:
按上述四個步驟凍存干細(xì)胞24h后，
步驟五:將凍存液從液氮中取出，投入LNG中升溫lmin ;
步驟六:將凍存液從LNG中取出，在真空狀態(tài)下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升溫速率迅速降溫至3.2-3.9°C ；
步驟七:將凍存液倒入0.9%的鹽水中，維持溫度在3.2-3.9°C的條件下，在次聲波(頻率為8~13Hz)振蕩條件下加入17%的不含纖維蛋白原的人血清白蛋白，3%的γ-球蛋白，
0.8%~1%的單糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巰基乙醇，調(diào)節(jié)體系的pH為6.8-7.6，加入1.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸，繼續(xù)在次聲波條件下振蕩30~45s ；
步驟八:將稀釋后的凍存液在400r/min的條件下離心5min，去除上清液，向細(xì)胞沉淀中加入0.21%~0.23%的細(xì)胞生長因子，重新懸浮細(xì)胞。
[0039]測定細(xì)胞的復(fù)蘇率:將3X 105個復(fù)蘇凍存干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計數(shù)板計算出培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式:復(fù)蘇率=培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)+ (3X105X增值率)，得到凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率；同時將3 X 105個P2代干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計數(shù)板計算出培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式:增值率=培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)+ (3X 105)。
[0040]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:測得復(fù)蘇率為96.9%
實(shí)施例3
一種低冷凍損傷的臍帶血干細(xì)胞凍存方法，包括以下幾個步驟:
步驟一:抽取骨髓，提純分離出單個核細(xì)胞，將原代細(xì)胞接種培養(yǎng)48h后，在含有8mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油鈉和37.5mg/L的2-磷酸抗壞血酸的培養(yǎng)液中，5%C02的培養(yǎng)箱中，37°C的溫度下培養(yǎng)8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培養(yǎng)液進(jìn)行第1次傳代；以1.3X 104/cm2的細(xì)胞密度接種，培養(yǎng)至P2代；
步驟二:將P2代臍帶血干細(xì)胞團(tuán)完全浸泡在0.6%NaCl和67.9%去離子水的混合溶液中，維持溫度在3.5°C的條件下，在次聲波振蕩頻率為10Hz的條件下加入8.4%的滲透性保護(hù)液，0.35%的葡萄糖，0.55%的果糖，17%的不含纖維蛋白原的人血清白蛋白，3%的γ -球蛋白，2.2%的Rho抑制劑，其中滲透性保護(hù)液為43%的DMS0和57%的聚乙二醇，DMS0的濃度為0.36g/mL，聚乙二醇的濃度為0.54g/mL，Rho抑制劑為法蘇地爾和羥基法蘇地爾的混合溶液，繼續(xù)在次聲波條件下振蕩45s，加入玻璃化液；
步驟三:將步驟二中制得的混合液在真空狀態(tài)下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降溫速率迅速降溫至_196°C ;
步驟四:存入液氮罐中保存。
[0041]實(shí)驗(yàn)凍存材料:按照美國臍帶血庫標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程無菌采集健康、足月分娩產(chǎn)婦的臍帶血，采集后24h內(nèi)處理。
[0042]實(shí)驗(yàn)方法:
按上述四個步驟凍存干細(xì)胞24h后，
步驟五:將凍存液從液氮中取出，投入LNG中升溫lmin ;
步驟六:將凍存液從LNG中取出，在真空狀態(tài)下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升溫速率迅速降溫至3.2-3.9°C ；
步驟七:將凍存液倒入0.9%的鹽水中，維持溫度在3.2-3.9°C的條件下，在次聲波(頻率為8~13Hz)振蕩條件下加入17%的不含纖維蛋白原的人血清白蛋白，3%的γ-球蛋白，
0.8%~1%的單糖，0.8%~1.2%的非必需氨基酸，0.08%~0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%~0.04%的β -巰基乙醇，調(diào)節(jié)體系的pH為6.8-7.6，加入1.5%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸，繼續(xù)在次聲波條件下振蕩30~45s ；
步驟八:將稀釋后的凍存液在400r/min的條件下離心5min，去除上清液，向細(xì)胞沉淀中加入0.21%~0.23%的細(xì)胞生長因子，重新懸浮細(xì)胞。
[0043]測定細(xì)胞的復(fù)蘇率:將3X 105個復(fù)蘇凍存干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計數(shù)板計算出培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式:復(fù)蘇率=培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)+ (3X105X增值率)，得到凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率；同時將3 X 105個P2代干細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)6天，用血球計數(shù)板計算出培養(yǎng)后的細(xì)胞總數(shù)，根據(jù)公式:增值率=培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)+ (3X 105)。
[0044]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:測得復(fù)蘇率為97.4%
實(shí)施例4
一種低冷凍損傷的干細(xì)胞凍存方法，包括以下幾個步驟:
步驟一:抽取臍帶血，提純分離出單個核細(xì)胞，將原代細(xì)胞接種培養(yǎng)48h后，在含有8mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油鈉和37.5mg/L的2-磷酸抗壞血酸的培養(yǎng)液中，5%C02的培養(yǎng)箱中，37°C的溫度下培養(yǎng)8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培養(yǎng)液進(jìn)行第1次傳代；以1.3X 104/cm2的細(xì)胞密度接種，培養(yǎng)至P2代；