一種利用ghrelin促進(jìn)新生雛雞小腸發(fā)育的方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及減少新生維雞小腸發(fā)育的方法具體設(shè)及一種利用曲relin促進(jìn)新生 維雞小腸發(fā)育的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在雞胚解化的過程中，卵黃囊是其主要的能源庫(kù)，然而，小雞一出殼，就面臨著由 W脂肪為主的液體食物向W碳水化合物和蛋白質(zhì)為主的固體食物轉(zhuǎn)變的巨大挑戰(zhàn)，為了適 應(yīng)運(yùn)一挑戰(zhàn)，小雞的胃腸道就必須盡快完成結(jié)構(gòu)和功能上的轉(zhuǎn)變。而小腸黏膜機(jī)械屏障的 結(jié)構(gòu)完整性，是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化與吸收的基礎(chǔ)，特別是小腸絨毛高度、黏膜厚度W及絨毛高度 與隱窩深度的比值（V/C)是衡量小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)，各種消化酶的活性產(chǎn)生是 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收的前提。然而目前對(duì)于提高維雞出殼時(shí)小腸發(fā)育的方法還很少見。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種利用曲relin促進(jìn)新生維雞小腸發(fā) 育的方法及應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種利用曲relin減少新生維雞小腸發(fā)育的方法，具體是 通過在受精蛋開始解化的第五天至第十五天之間向卵白內(nèi)注射至少一次曲relin溶液。
[0005] 本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)包括：
[0006] 所述曲relin溶液的濃度為100-15化g/ul，每次每蛋注射量為0. 1ml。
[0007] 在受精蛋開始解化的第五天和第十五天時(shí)，分別向卵白內(nèi)注射一次曲relin溶 液。
[0008] 在受精蛋開始解化的第五天時(shí)，每枚蛋注射濃度為l(K)ng/ul的曲relin溶液 0. 1ml〇
[0009] 在受精蛋開始解化的第五天時(shí)，每枚蛋注射濃度為15化g/ul的曲relin溶液 0. 1ml〇
[0010] 在受精蛋開始解化的第十五天時(shí)，每枚蛋注射濃度為10化g/ul的曲relin溶液 0. 1ml〇
[0011] 在受精蛋開始解化的第十五天時(shí)，每枚蛋注射濃度為15化g/ul的曲relin溶液 0. 1ml〇
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于，曲relin在促進(jìn)新生維雞小腸發(fā)育中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明實(shí)施方法簡(jiǎn)單，通過卵內(nèi)飼喂，能顯著提高雞胚出殼時(shí)十二指腸、空腸、回 腸的絨毛高度和肌層厚度，提高消化酶SI和化ptlmRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明。
[0015] 實(shí)驗(yàn)材料與方法
[001引 1試驗(yàn)材料
[0017] 1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0018] 選用Ross肉雞受精種蛋（新鄉(xiāng)大用有限公司）稱重，挑取重量在65-70g的蛋140 枚，隨機(jī)分成7組，每組20枚，分別為Control組（正常解化倍，不做任何處理）、E5-100組、 E5-150組、E5-醋酸組、E15-100組、E15-150組、E15-醋酸組。對(duì)各組蛋進(jìn)行編號(hào)，記錄。 解化條件：37. 5 ± 0. 2 °C，相對(duì)濕度55 ± 2 %。
[0019] 1. 2動(dòng)物處理：卵內(nèi)喂食曲relin
[0020] Control組在整個(gè)解化的過程中不做任何處理；
[0021]E5-100組在E5胚齡時(shí)每枚蛋注射濃度為10化g/ul的曲relin溶液0. 1ml;
[0022] E5-150組在E5胚齡時(shí)每枚蛋注射濃度為150ng/ul的曲relin溶液0. 1ml，
[0023] E5-醋酸組在E5胚齡時(shí)每枚蛋注射醋酸0. 1ml ;
[0024]E15-100組在E15胚齡時(shí)每枚蛋注射濃度為lOOng/ul曲relin溶液0. 1ml，
[00巧]E15-150組在E15胚齡時(shí)每枚蛋注射濃度為15化g/ul曲relin溶液0. 1ml。
[0026]El5-醋酸組在E5胚齡時(shí)每枚蛋注射醋酸0. 1ml;
[0027] 曲relin溶液的配方：鼠曲relin粉末，用濃度為0. 1%醋酸稀釋。
[0028] 卵內(nèi)喂食的具體步驟：E5(開始解化的第五天）胚齡時(shí)，通過照蛋器照蛋發(fā)現(xiàn)卵白 的位置在氣室的正下方，E15胚齡時(shí)，通過照蛋器照蛋，發(fā)現(xiàn)卵白的位置在氣室的斜下方，標(biāo) 出注射位點(diǎn)。采用22G針頭卵白注射曲relin溶液，注射后，玻璃紙蠟封注射口，繼續(xù)解化， 此時(shí)，解化器搖蛋按鈕關(guān)閉，24小時(shí)后，蠟封的口凝固后，重新打開搖蛋按鈕，繼續(xù)解化。
[0029] 1.3組織取材
[0030] 維雞出殼后新生維雞稱重，記錄。按100mg/lOOg體質(zhì)量烏拉坦麻醉，然后頸椎脫 白處死，其中每組17只雞取十二指腸、空腸、回腸用0. 75%的生理鹽水沖洗干凈，用濾紙吸 去多余的水分，再用萬分之一的分析天平稱重后置于4%的多聚甲醒憐酸緩沖液（PH7. 4) 中固定。另外Ξ只取十二指腸、空腸、回腸液氮冷凍后，置于-80°C冰箱中保存?zhèn)溆?br>[0031] 2試驗(yàn)方法
[0032] 2. 1石蠟切片制作
[0033] 將固定好的脾臟、法氏囊等組織置于水龍頭下，流水沖洗24小時(shí)后置于梯度酒 精脫水（50 %酒精化、60 %酒精化、70 %酒精化、80 %酒精化、90 %酒精比、100 %酒精 I30min、100%酒精I(xiàn)I30min)，再放入二甲苯：無水酒精（1:1)I、11各比，最后置于二甲 苯中透明。透明后的組織順次放入蠟I、蠟II各30min，最后放入蠟III比，包埋組織，制作蠟 塊。將組織蠟塊切片機(jī)連續(xù)切片，厚度5μm，45 °C水浴展片，拱片，55 °C烤片機(jī)烤片，后置于 37°C電熱恒溫干燥箱內(nèi)24h備用。
[0034] 2. 2常規(guī)肥染色
[003引（1)將脫蠟處理后的組織切片用蒸饋水洗涂干凈；似蘇木精溶液染色約lOmin; (3)用蒸饋水沖洗去多余的染液，0.5%鹽酸乙醇溶液中l(wèi)-3s(至鏡檢下細(xì)胞漿為無色時(shí)取 出）；(4)蒸饋水洗涂3次，每次約5111^，后自來水藍(lán)化20111山；（5)依次浸入50%乙醇溶液、 70%乙醇溶液、85 %乙醇溶液，每級(jí)l-2min;(6) 0. 5 %伊紅乙醇溶液染色約2min;(7)依次 浸入95%乙醇、無水乙醇中脫水（每級(jí)l-3min) ;(8)二甲苯：無水乙醇（l:l)3min;(9)二 甲苯透明處理lOmin，最后用中性樹膠封片，封好后置于通風(fēng)柜中驚干。
[0036] 2. 3PCNA(細(xì)胞增核抗原）免疫組化
[0037]1.石蠟切片經(jīng)二甲苯I、二甲苯II各脫蠟5min，濃度遞減梯度酒精3min，最后置 蒸饋水中。
[003引2.于0.01M的巧樣酸鋼酸堿緩沖液中，微波修復(fù)（要求：調(diào)整火力使緩沖液溫度 保持在92-95°C，時(shí)間持續(xù)15min，冷卻至室溫），暴露抗原。
[0039] 3. 0. 01MPBS清洗 3 次，每次 5min。
[0040] 4. 3%雙氧水（用甲醇和30%雙氧水配制）處理，置于濕盒室溫避光解育30min， 封閉內(nèi)源性的過氧化物酶。
[0041] 5. 0. 01MPBS清洗 3 次，每次 5min。
[004引 6. 5%的山羊血清（用0. 01PBS配制）處理，置于濕盒室溫解育30min，進(jìn)一步抑 制假陽性表達(dá)。
[0043]7.不清洗，甩去多余液體，加PCNA單抗（小鼠抗人，用0. 01MPBS1:200倍稀釋）， 每張片上選擇1-2片組織作為陰性對(duì)照，陰性對(duì)照加等量的0. 01MPBS，4°C解育過夜。
[0044] 8.室溫恒溫比。
[0045] 9. 0. 01MPBS清洗 3 次，每次 5min。
[004引 10.加二抗（山羊抗小鼠IgG，用0. 01MPBS1:100倍稀釋），置于濕盒室溫解育化。
[0047] 11. 0. 01MPBS清洗 3 次，每次 5min。
[0048] 12.利用DAB顯色試劑盒顯色：1血蒸饋水中，加入A試劑一滴，混勻，再依次加 入B、C各一滴，混勻。滴加至切片上，置于濕盒室溫避光解育，顯微鏡下觀察，控制顯色時(shí) 間（注意：在保證充分解育的同時(shí)，又要防止背景顏色過深），顯色完成后，用蒸饋水漂洗干 凈。
[0049] 13.蘇木素復(fù)染