一種海桐體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種植物繁殖方法，特別是一種海桐體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生方法。
【背景技術(shù)】
[0002]海桐(Pittosporum tobira(Thunb.)Ait))主要分布于長江流域以南各省區(qū)，海桐屬常綠灌木或小喬木，對(duì)二氧化硫、氯氣、氟化氫等有害氣體有較強(qiáng)抗性，是國內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)各部位均具有較強(qiáng)化感作用的園林綠化植物。海桐枝葉，異名七里香葉(臺(tái)灣)，具有解毒、殺蟲的功能，主要用于治療疥瘡、腫毒(國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì)編，中華本草4，上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:65-66)。
[0003]現(xiàn)代研究表明，海桐的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子中均含有類胡蘿卜素、萜類等復(fù)雜化學(xué)成分，表現(xiàn)抗菌、抗腫瘤、殺蟲、神經(jīng)保護(hù)、除草等多種生物活性和很高的藥用價(jià)值，海桐具有保護(hù)谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的活性，其枝葉可以止血、解毒、抗菌，根可以散瘀止痛、祛風(fēng)活絡(luò)，果實(shí)總皂苷能抑制腫瘤細(xì)胞的增生，種子具有固精、澀腸、保護(hù)心血管系統(tǒng)、預(yù)防冠心病等功效，因此，海桐具有醫(yī)藥工業(yè)、食品(保健型食用油)、日用化妝品等廣泛開發(fā)前景，其種植需求量日益增長(孫卓，劉紅星與黃初升，海桐植物化學(xué)成分以及生物活性的研究，化工技術(shù)與開發(fā)，2014(01)，22-26)。
[0004]海桐的傳統(tǒng)繁育方法為壓條、扦插和播種，但壓條繁殖既破壞樹形又難以大量繁殖，扦插繁殖的繁殖系數(shù)受生根效率的影響，且根系不發(fā)達(dá)，株型不豐滿;經(jīng)長期栽培，海桐雄蕊常表現(xiàn)退化而不育，結(jié)實(shí)率低，播種種源有限，且受生理休眠影響，海桐種子在自然條件下難以萌發(fā)，種子成苗率低(米銀法，宋乾江與李巍，不同濃度NAA和IBA處理對(duì)海桐扦插生根的影響，山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011(08):44-47;)，(唐安軍與柳建平，海桐種子的休眠解除與萌發(fā)，種子，2011 (05):46-49；)，(http://frps.eflora.cn/frps/Pittosporum:中國植物志第35 (2)卷，海桐花科海桐花屬3，海桐)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種海桐體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的方法，能夠解決海桐種子在自然條件下難以萌發(fā)，種子成苗率低的問題。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種海桐體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生的方法，包括以下步驟:
[0007](1)外植體的選擇與消毒:取海桐新鮮種子作為外植體，依次用2v/v%洗潔精水溶液浸泡5min，線狀自來水沖洗15-30min，添加了 2-3滴吐溫-20的0 ,lv/v%升汞100mL消毒8-lOmin，無菌水沖洗3-5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體，其中，無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水；
[0008](2)外植體誘導(dǎo)獲得無菌試管苗:將步驟(1)得到的外植體置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，接種到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，黑暗的條件下培養(yǎng)20d得到無菌試管苗，其中，MS培養(yǎng)基中添加GA30.1-0.5mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8;
[0009](3)胚性愈傷組織的誘導(dǎo):將步驟(2)中得到的無菌試管苗的子葉置于MS胚性傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8-10h/d的條件下培養(yǎng)30d，得到胚性愈傷組織，其中，MS胚性傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基添加2，4-D0.5-2.5mg/L、TDZ0.5-2.0、CH200mg/L、蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養(yǎng)基pH值5.8 ；
[0010](4)胚狀體誘導(dǎo)與萌發(fā):將步驟(3)中得到胚性愈傷組織置于MS萌發(fā)培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間8-10h/d的條件下培養(yǎng)30d，得到體細(xì)胞胚胎再生小植株，其中，MS萌發(fā)培養(yǎng)基中中添加蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8;
[0011](5)壯苗培養(yǎng):將步驟(4)中得到的體細(xì)胞胚胎再生小植株置于MS壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間8-10h/d的條件下培養(yǎng)30d，得到完整自根苗，其中，MS壯苗培養(yǎng)基中添加6-BA0.1-0.5mg/L、NAA0.05-0.lmg/L、蔗糖30g//L和瓊脂58/1，培養(yǎng)基?!1值5.8;
[0012](6)煉苗移栽:將所述完整自根苗在溫度為25°C的室內(nèi)煉苗4-7d，待培養(yǎng)基表面形成角質(zhì)后，取出幼苗，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到滅菌蛭石的基質(zhì)中，生長一個(gè)月后移栽到大田。
[0013]本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于:海桐體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生方法技術(shù)方法簡便，從外植體到植株再生，煉苗移栽整個(gè)培養(yǎng)周期打破傳統(tǒng)組培繁殖方式，將芽誘導(dǎo)和得根一步完成，縮短培養(yǎng)周期，提高繁殖系數(shù)，移栽成活率高，出苗整齊一致，便于管理。
[0014]實(shí)施例1
[0015]本發(fā)明所述的海桐體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生方法，包括以下步驟:
[0016](1)外植體的選擇與消毒:取海桐新鮮種子作為外植體，依次用2v/v%洗潔精水溶液浸泡5min，線狀自來水沖洗15-30min，添加了 2-3滴吐溫-20的0 ,lv/v%升汞100mL消毒8-lOmin，無菌水沖洗3-5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體。其中，無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0017](2)外植體誘導(dǎo)獲得無菌試管苗:將步驟(1)得到的外植體置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，接種到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，黑暗條件下培養(yǎng)20d得到無菌試管苗。其中，MS培養(yǎng)基中添加GA30.lmg/L、蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8。
[0018](3)胚性愈傷組織的誘導(dǎo):將步驟(2)中得到的無菌試管苗的子葉，在超凈臺(tái)內(nèi)用解剖刀劃傷子葉，平貼于MS胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8-10h/d的條件下培養(yǎng)30d，得到胚性愈傷組織，其中，MS胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2，4-D0.5mg/L、TDZ0.511^/1、0120011^/1、蔗糖3(^/1和瓊脂58/1，培養(yǎng)基pH值5.8;
[0019](4)胚狀體誘導(dǎo)與萌發(fā):將步驟(3)中得到胚性愈傷置于MS萌發(fā)培養(yǎng)基中在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001UX，光照時(shí)間8-10h/d的條件下培養(yǎng)30d，得到體細(xì)胞胚胎再生小植株。其中，MS萌發(fā)培養(yǎng)基中添加蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8。
[0020](5)壯苗培養(yǎng):將步驟(4)中得到的體細(xì)胞胚胎再生小植株置于MS壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間8-10h/d的條件下培養(yǎng)30d，得到完整自根苗。其中，MS壯苗培養(yǎng)基中添加6-BA0.5mg/L、ΝΑΑ 0.lmg/L、蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8。
[0021](6)煉苗移栽:將所述完整自根苗在室溫下煉苗4-7d，待培養(yǎng)基表面形成角質(zhì)后，取出幼苗，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到滅菌蛭石的基質(zhì)中，生長一個(gè)月后，移栽到大田。每天早晚各噴霧一次。
[0022]實(shí)施例2
[0023](1)外植體的選擇與消毒:取海桐新鮮種子作為外植體，依次用2v/v%洗潔精水溶液浸泡5min，線狀自來水沖洗15-30min，添加了 2-3滴吐溫-20的0 ,lv/v%升汞100mL消毒8-lOmin，無菌水沖洗3-5次，最后用消毒濾紙除去表面水分，得到外植體。其中，無菌水為經(jīng)高溫高壓滅菌的蒸餾水。
[0024](2)外植體誘導(dǎo)獲得無菌試管苗:將步驟(1)得到的外植體置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，接種到MS培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，黑暗條件下培養(yǎng)20d得到無菌試管苗。其中，MS培養(yǎng)基中添加GA30.lmg/L、蔗糖30g/L和瓊脂5g/L，培養(yǎng)基pH值為5.8。
[0025](3)胚性愈傷組織的誘導(dǎo):將步驟(2)中得到的無菌試管苗的子葉，在超凈臺(tái)內(nèi)用解剖刀劃傷子葉，平貼于MS胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間為8-10h/d的條件下培養(yǎng)30d，得到胚性愈傷組織，其中，MS胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2，4-01.011^/1、了022.011^/1、0120011^/1、蔗糖3(^/1和瓊脂58/1，培養(yǎng)基pH值5.8;
[0026](4)胚狀體誘導(dǎo)與萌發(fā):將步驟(3)中得到胚性愈傷置于MS萌發(fā)培養(yǎng)基中在培養(yǎng)溫度為23-27°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時(shí)間8-10h/d的條件下培養(yǎng)30d，