銅皮石斛的組織培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及栽培方法，更具體地說，本發(fā)明涉及一種銅皮石斛的組織培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 銅皮石斛，又名：細(xì)莖石斛，細(xì)黃草，屬蘭科石斛屬，多年生附生草本，是一種名貴 的中草藥，具有極高的藥用保健價(jià)值。近年來石斛的研究引起人們的廣泛興趣，銅皮石斛中 含有較高的多糖、總生物堿等多種化學(xué)成份，現(xiàn)代藥理研究更證明銅皮石斛具有益胃生津、 滋陰清熱、養(yǎng)清音明目、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等功效，因此銅皮石斛 逐漸引起人們的關(guān)注。
[0003] 然而由于蘭科種子自然繁殖主要靠分株繁殖，在野外本就很難發(fā)芽，而隨著社會 的發(fā)展，人們過度的采摘使得野生的銅皮石斛資源大多遭到破壞，幾近滅絕，因此尋找一種 組織培養(yǎng)的方法培養(yǎng)銅皮石斛使銅皮石斛快速繁殖，實(shí)現(xiàn)銅皮石斛優(yōu)質(zhì)種苗的工廠化育 苗，滿足人們的需求，成為亟待人們解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明還有一個目的是提供一種銅皮石斛的組織培養(yǎng)方法，能保持原有品種的優(yōu) 良性狀，在短時間內(nèi)培育出大量適合栽培種植的銅皮石斛幼苗，單芽增殖系數(shù)達(dá)20~30倍 以上，且試管苗叢生芽健壯，在生根培養(yǎng)基中容易生根，移栽基質(zhì)后成活率在90%以上。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種銅皮石斛的組織培養(yǎng)方 法，包括以下步驟：
[0007] 步驟一、取銅皮石斛的果莢進(jìn)行消毒和預(yù)處理，用體積分?jǐn)?shù)為2%的洗潔精水溶液 浸泡5min后，用流水沖洗15~30min，然后將銅皮石斛的果莢灼燒2次，每次灼燒5~IOs后， 得到外植體；
[0008] 步驟二、將所述外植體切開，取出種子后接種到第一培養(yǎng)基中，在所述第一培養(yǎng)基 中培養(yǎng)50~70天后得到無菌試管苗；
[0009] 所述第一培養(yǎng)基中包括:MS、0.5mg/L赤霉素和2. Og/L活性炭；
[0010]步驟三、將所述無菌試管苗置于第二培養(yǎng)基中，在所述第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)50~70 天后得到試管苗叢生芽；
[0011 ] 所述第二培養(yǎng)基中包括:MS、0 · 5~2 · Omg/L的甲巰達(dá)嗪、0 · 2~1 · 5mg/L的2，4-二氯 苯氧乙酸和0.2~0.5mg/L的激動素；
[0012]步驟四、將所述試管苗叢生芽置于壯苗培養(yǎng)基中，在所述壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)20~ 40天后得到試管苗；
[0013]所述壯苗培養(yǎng)基中包括:花寶2號培養(yǎng)基、1.0~4. Omg/L的6-節(jié)氨基腺嘌呤和1.0 ~4.0mg/L的萘乙酸；
[0014]步驟五、將所述試管苗置于生根培養(yǎng)基中，在所述生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30~50天后 得到組培苗；
[0015] 所述生根培養(yǎng)基中包括：1/2MS和20g//L的香蕉泥，所述香蕉泥為將香蕉攪碎后得 到。
[0016] 優(yōu)選的是，將銅皮石斛的果莢灼燒2次的具體方法為:在無菌超凈臺內(nèi)將銅皮石斛 的果莢用無菌鑷夾住，在整個果莢表面沾染體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精，然后灼燒，將酒精燒盡 后再重復(fù)灼燒1次。
[0017] 優(yōu)選的是，所述第一培養(yǎng)基、所述第二培養(yǎng)基、所述壯苗培養(yǎng)基以及所述生根培養(yǎng) 基中均含有5g/L的瓊脂和30g/L蔗糖，且所述第一培養(yǎng)基、所述第二培養(yǎng)基、所述壯苗培養(yǎng) 基以及所述生根培養(yǎng)基的初始pH值均調(diào)節(jié)為5.8。
[0018] 優(yōu)選的是，步驟二到步驟五中的培養(yǎng)均為控制光照培養(yǎng)，均為：培養(yǎng)溫度23~27 °C，光照強(qiáng)度15001UX，光照時間為8~I Oh/d。
[0019]優(yōu)選的是，還包括：
[0020] 步驟六、煉苗，煉苗的具體方法為:將所述組培苗和培養(yǎng)所述組培苗的培養(yǎng)瓶一起 移出培養(yǎng)室，打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，向培養(yǎng)瓶中加入30ml的自來水后，自然光照3~5d。
[0021] 優(yōu)選的是，還包括：
[0022] 步驟七、煉苗結(jié)束后，從培養(yǎng)瓶中取出所述組培苗，將所述組培苗的根部洗凈后移 栽至基質(zhì)中，所述基質(zhì)中樹皮、腐殖質(zhì)土與蛭石的體積比為1:1: 1。
[0023] 優(yōu)選的是，步驟四中控制光照培養(yǎng)以外，培養(yǎng)期間，每天早上6~7點(diǎn)，用紅藍(lán)LED光 照射所述試管苗叢生芽0.2~0.5h，步驟五中控制光照培養(yǎng)以外，培養(yǎng)期間，每天早上6~7 點(diǎn)和每天晚上7~8點(diǎn)各用紅藍(lán)LED光照射1次所述試管苗，每次0.5~I h。
[0024]優(yōu)選的是，所述第一培養(yǎng)基中含有5g/L果莢碎；
[0025]所述果莢碎的制備方法為:收集取出種子后的銅皮石斛的果莢，刮去灼燒痕跡后， 用丙酮浸泡10~20min后，用無菌水沖洗，粉碎后，與燕麥片均勻混合得到混合物，將所述混 合物在所述滅菌液中浸泡5~IOmin后，用無菌水沖洗，得到所述果莢碎，其中，所述燕麥片 與銅皮石斛的果莢的質(zhì)量比為1: 3。
[0026]本發(fā)明至少包括以下有益效果：
[0027] 1、采用生物技術(shù)對銅皮石斛進(jìn)行組織培養(yǎng)快速繁殖，保持了原有品種的優(yōu)良性 狀，能夠在短時間內(nèi)培育出大量適合栽培種植的銅皮石斛幼苗，且培養(yǎng)的銅皮石斛種苗質(zhì) 量好，能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，滿足生產(chǎn)上的需要。本發(fā)明中單芽增殖系數(shù)達(dá)20~30倍以上， 且試管苗叢生芽健壯，接種到生根培養(yǎng)基后容易生根，移栽基質(zhì)后成活率在90%以上。
[0028] 2、本發(fā)明中以灼燒的方式對外植體進(jìn)行滅菌，與傳統(tǒng)的采用升汞滅菌方式相比， 既避免了二次污染，又無毒害更環(huán)保。
[0029] 3、其中萌發(fā)實(shí)驗(yàn)的第一培養(yǎng)基中添加活性炭，使得第一培養(yǎng)基中的環(huán)境模仿黑暗 培養(yǎng)，更有利于種胚發(fā)芽。生根培養(yǎng)基中加入打碎的香蕉泥，香蕉泥中含有豐富的碳水化合 物、蛋白質(zhì)，還有豐富的鉀、鈣、磷、鐵及維生素 A，B和C等，既能提供生根所需的營養(yǎng)物質(zhì)，且 B12維生素能促進(jìn)生根，有利于組培苗生根。
[0030] 4、早上6~7點(diǎn)，自然光較弱，用紅藍(lán)LED光照射試管苗叢生芽或試管苗能補(bǔ)充光 照，喚醒植物細(xì)胞，同時紅藍(lán)LED光獨(dú)特的作用能促進(jìn)試管苗叢生芽的發(fā)育和苗的生長，且 使培養(yǎng)期間的植物細(xì)胞更活躍，積累更多的生物量，晚上7~8點(diǎn)用紅藍(lán)LED光照射試管苗， 既是延長光照時間，使植物細(xì)胞保持活躍，同時能促進(jìn)生根。
[0031] 5、銅皮石斛的果莢中含有豐富的碳水化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)，還有豐富的鉀、鈣、 磷、鐵、鎂等以及多種微量元素，在第一培養(yǎng)基中添加果莢碎，銅皮石斛果莢粉碎后和燕麥 中的氨基酸種類相互互補(bǔ)，協(xié)同作用更好的提供胚乳中的營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)種子發(fā)芽。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書 文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 步驟一、取銅皮石斛的果莢進(jìn)行消毒和預(yù)處理，用體積分?jǐn)?shù)為2%的洗潔精水溶液 浸泡5min后，用流水沖洗15min，然后在無菌超凈臺內(nèi)將銅皮石斛的果莢用無菌鑷夾住，在 整個果莢表面沾染體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精，然后灼燒，將酒精燒盡后再重復(fù)灼燒1次，每次 灼燒5s，得到外植體。
[0035] 步驟二、將所述外植體切開，取出種子后接種到第一培養(yǎng)基中，在所述第一培養(yǎng)基 中培養(yǎng)50天，培養(yǎng)溫度23°C，光照強(qiáng)度15001UX，光照時間為8h/d，得到無菌試管苗。
[0036]所述第一培養(yǎng)基中包括:MS、0 · 5mg//L赤霉素，2 · Og/1活性炭，5g//L的瓊脂和30g/L 蔗糖，所述第一培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)節(jié)為5.8。
[0037]步驟三、將所述無菌試管苗置于第二培養(yǎng)基中，在所述第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)50天，培 養(yǎng)溫度23°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時間為8h/d，得到試管苗叢生芽。
[0038]所述第二培養(yǎng)基中包括:MS、0 · 5mg/L的甲巰達(dá)嗪、0 · 2mg/L的2，4-二氯苯氧乙酸、 0.2mg/L的激動素、5g/L的瓊脂和30g/L蔗糖，所述第二培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)節(jié)為5.8。
[0039]步驟四、將所述試管苗叢生芽置于壯苗培養(yǎng)基中，在所述壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天， 培養(yǎng)溫度23°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時間為8h/d，得到試管苗。
[0040]所述壯苗培養(yǎng)基中包括:花寶2號培養(yǎng)基、1.0 mg/L的6-芐氨基腺嘌呤、1.0 mg/L的 萘乙酸、5g/L的瓊脂和30g/L蔗糖，所述壯苗培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)節(jié)為5.8。
[0041 ]步驟五、將所述試管苗置于生根培養(yǎng)基中，在所述生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天，培養(yǎng)溫 度23°C，光照強(qiáng)度15001ux，光照時間為8h/d，得到組培苗。
[0042]所述生根培養(yǎng)基中包括：l/2MS、20g/L的香蕉泥、5g//L的瓊脂和30g//L蔗糖，所述生 根培養(yǎng)基的初始PH值調(diào)節(jié)為5.8，其中，所述香蕉泥為將香蕉攪碎后得到。
[0043] 步驟六、煉苗，煉苗的具體方法為:將所述組培苗和培養(yǎng)所述組培苗的培養(yǎng)瓶一起 移出培養(yǎng)室，打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，向培養(yǎng)瓶中加入30ml的自來水后，自然光照3d。
[0044] 步驟七、煉苗結(jié)束后，從培養(yǎng)瓶中取出所述組培苗，將所述組培苗的根部洗凈后移 栽至基質(zhì)中，所述基質(zhì)中樹皮、腐殖質(zhì)土與蛭石的體積比為1:1: 1。
[0045] 實(shí)施例2
[0046] 步驟一、取銅皮石斛的果莢進(jìn)行消毒和預(yù)處理，用體積分?jǐn)?shù)為2%的洗潔精水溶液 浸泡5min后，用流水沖洗30min，然后在無菌超凈臺內(nèi)將銅皮石斛的果莢用無菌鑷夾住，在 整個果莢表面沾染體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精，然后灼燒