一種竹葉蘭組培快繁的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種竹葉蘭組培快繁的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 竹葉蘭（Alumina graminifolia化。虹）系蘭科竹葉蘭屬多年生草本植物，主要分 布于東南亞地區(qū)，在我國(guó)產(chǎn)于福建、江西、浙江、廣東、海南、廣西、四川、貴州、湖南、云南等 地。其花朵美麗清雅，有淡香味，花期長(zhǎng)，觀賞價(jià)值高，可盆栽，也可用于庭院綠化。竹葉蘭還 具有很高的藥用價(jià)值，全草入藥.具有調(diào)補(bǔ)氣血、清熱解毒、桂風(fēng)濕、消炎、利尿之功效?？?用于治療風(fēng)濕性腰腿痛、胃痛、尿路感染、毒蛇咬傷、食物中毒等。因此，充分開發(fā)和利用竹 葉蘭的觀賞和藥用價(jià)值具有廣闊的市場(chǎng)前景。
[0003] 竹葉蘭種子發(fā)育不全，無(wú)胚乳，直播不萌發(fā)，在野外需與共生菌共生才能萌發(fā)且發(fā) 芽率極低。因此，傳統(tǒng)的竹葉蘭人工繁殖手段只能采取分株繁殖、桿插繁殖和高位芽繁殖。 其中，高位芽繁殖可采用W下兩種方法：;D待開花結(jié)實(shí)的莖枝或受損的老枝上長(zhǎng)出高位芽 長(zhǎng)至10厘米左右時(shí)，將其摘下并插入育苗基質(zhì)的苗床中，待根長(zhǎng)出后便可移栽；也可讓 高位芽與母株一起生長(zhǎng)，待長(zhǎng)出氣生根后再摘下移栽。傳統(tǒng)的人工繁殖方法一年繁殖1-2 次且需要大量栽培2-3年的母株，故其繁殖成本高，效率低，無(wú)法滿足生產(chǎn)需要。當(dāng)前，已有 利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)繁育竹葉蘭種苗的報(bào)道。陳之林等（2006年)利用竹葉蘭種子進(jìn)行離 體培養(yǎng)，成功獲得竹葉蘭原球莖和試管苗。張文珠等（2011年)W竹葉蘭種子為外植體進(jìn)行 無(wú)菌播種，也成功誘導(dǎo)出原球莖并獲得再生植株，建立了 W種子為外植體的組培快繁體系。 但是，種子無(wú)菌播種獲得的試管苗是實(shí)生苗，其性狀易發(fā)生分離，不能獲得遺傳物質(zhì)一致的 種苗。且W原球莖發(fā)生方式組培快繁種苗，經(jīng)過(guò)脫分化和再分化過(guò)程，種苗易發(fā)生遺傳變 異，通常變異率為8%左右。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)W上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用竹葉蘭高位芽作為外植 體，采用叢生芽發(fā)生方式進(jìn)行一種竹葉蘭組培快繁的方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：其特征在于： 步驟1外植體材料選擇與表面消毒： W高位芽距離栽培基質(zhì)上表面10厘米W上且長(zhǎng)度3-5厘米飽滿的高位芽為選取材料， 切下高位芽作為外植體，先在自來(lái)水下沖洗干凈，之后在無(wú)菌條件下，用70-75%酒精消毒 30-60秒，無(wú)菌水沖洗一次，再用0. 1%升隸消毒8-12分鐘，最后無(wú)菌水沖洗3-5次，無(wú)菌濾 紙吸干備用； 步驟2不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)： 在無(wú)菌條件下，先將消毒好的高位芽頂部1-3厘米部位切除，再把剩下部分按照基部 朝下方式接種到含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA2. 0-3. Omg/L +NAAO. 1 mg/L組合或TDZO. 2-0. 3mg/ L +NAAO. I mg/L組合的MS不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)，保持光照強(qiáng)度 1500-2000LX，光照時(shí)間每天12小時(shí)，溫度24-26°C，45-60天后，切除頂部的高位芽基部誘 導(dǎo)出不定芽； 步驟3叢生芽的增殖培養(yǎng)： 在無(wú)菌條件下，將步驟2獲得的產(chǎn)物接種到含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA2. 0 mg/L +NAAO. 1 mg/L組合或TDZO. 2mg/L +NAAO. 1 mg/L組合的MS叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室內(nèi)光照培 養(yǎng)，保持光照強(qiáng)度2000-2500LX,光照時(shí)間每天12小時(shí)，溫度24-26°C，45-50天后，獲得 叢生芽；再將上述叢生芽接種到含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA0. 5-1. 0 mg/L +NAAO. 1 mg/L組合 或TDZ0.0 5-0.1 mg/L+NAAO. 1 mg/L組合的MS叢生芽增殖培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)， 保持光照強(qiáng)度2000-2500LX,光照時(shí)間每天12小時(shí)，溫度24-26°C，45-50天后，獲得大量 的叢生芽團(tuán)塊. 步驟4壯苗和生根培養(yǎng)： 在無(wú)菌條件下，先將步驟3獲得的苗4株W上的叢生芽大團(tuán)塊分切成苗2-4株的叢生 芽小團(tuán)塊，再與步驟3直接獲得的苗2-4株的叢生芽小團(tuán)塊一起接種到含IBAO. 5mg/L或 NAAO. Img/L的MS+香蕉泥50g/L+活性碳1. Og/L壯苗和生根培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室內(nèi)光照培 養(yǎng)，保持光照強(qiáng)度2000-2500LX,光照時(shí)間每天16小時(shí)，溫度24-26°C，45-60天后，苗 2-4株的叢生芽小團(tuán)塊生長(zhǎng)粗壯并長(zhǎng)出新根； 步驟5組培苗的煉苗與馴化移栽： 當(dāng)步驟4獲得的苗2-4株的叢生芽小團(tuán)塊中苗長(zhǎng)至株高4-8厘米，根1-3條時(shí)即可移 入煉苗室進(jìn)行7-14天煉苗培養(yǎng)，W提高其環(huán)境適應(yīng)能力。煉苗結(jié)束后，先從培養(yǎng)瓶中取出 上述叢生芽團(tuán)塊，洗凈根部培養(yǎng)基，再浸泡在稀釋800倍的甲基托布津藥液中15-20分鐘， 最后用苔薛基質(zhì)進(jìn)行移栽。
[000引本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于： 由于本專利采用高位芽作為外植體，能夠確保外植體材料遺傳物質(zhì)均一性，從而保證 了竹葉蘭組培快繁種苗的遺傳穩(wěn)定性。且高位芽再生能力強(qiáng)，受栽培基質(zhì)中微生物影響小， 表面消毒效果好，容易建立無(wú)菌系；由于本專利采用叢生芽發(fā)生方式組培快繁竹葉蘭種苗， 不經(jīng)過(guò)脫分化和再分化過(guò)程，從而降低了竹葉蘭繼代增殖培養(yǎng)中發(fā)生變異的幾率。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)W高位芽為外植體、采用叢生芽發(fā)生方式、縮短誘導(dǎo)時(shí)間、簡(jiǎn)化培養(yǎng)過(guò) 程等技術(shù)措施，可降低組培苗變異率，節(jié)約組培苗生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率和利潤(rùn)，因此本 發(fā)明的竹葉蘭組培快繁的方法繁殖速度快，種苗變異率低，生產(chǎn)成本低。
【具體實(shí)施方式】 [000引實(shí)施例一： 本發(fā)明竹葉蘭組培快繁的方法包括W下步驟： 步驟1外植體材料選擇與表面消毒： W高位芽距離栽培基質(zhì)上表面10厘米W上且長(zhǎng)度3-5厘米飽滿的高位芽為選取材料， 切下高位芽作為外植體，先在自來(lái)水下沖洗干凈，之后在無(wú)菌條件下，用70-75%酒精消毒 30-60秒，無(wú)菌水沖洗一次，再用0. 1%升隸消毒8-12分鐘，最后無(wú)菌水沖洗3-5次，無(wú)菌濾 紙吸干備用。
[0009] 步驟2不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)： 在無(wú)菌條件下，先將消毒好的高位芽頂部1-3厘米部位切除，再把剩下部分按照基部 朝下方式接種到含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA3.0 mg/L +NAAO. 1 mg/L組合的MS培養(yǎng)基上，在培 養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)，保持光照強(qiáng)度1500-2000L)(，光照時(shí)間每天12小時(shí)，溫度24-26°C，45-60 天后，切除頂部的高位芽基部可誘導(dǎo)出不定芽。
[0010] 步驟3叢生芽的增殖培養(yǎng)： 在無(wú)菌條件下，將步驟2獲得的產(chǎn)物接種到含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA2. 0 mg/L +NAAO. 1 mg/L組合的MS培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)，保持光照強(qiáng)度2000-2500LX,光照時(shí)間每 天12小時(shí)，溫度24-26°C，45-50天后，獲得叢生芽；再將上述叢生芽接種到到含植物生長(zhǎng) 調(diào)節(jié)劑6-BA1.0 mg/L +NAAO. 1 mg/L組合的MS培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)，保持光照 強(qiáng)度2000-2500LX,光照時(shí)間每天12小時(shí)，溫度24-26°C，45-50天后，平均增殖系數(shù)可達(dá) 3. 2左右。
[0011] 步驟4壯苗和生根培養(yǎng)： 在無(wú)菌條件下，先將步驟3獲得的苗4株W上的叢生芽大團(tuán)塊分切成苗2-4株的叢生 芽小團(tuán)塊，再與步驟3直接獲得的苗2-4株的叢生芽小團(tuán)塊一起接種到含IBAO. 5mg/L或 NAAO. Img/L的MS+香蕉泥50g/L+活性碳1. Og/L培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)，保持光 照強(qiáng)度2000-2500LX,光照時(shí)間每天16小時(shí)，溫度24-26°C，45-60天后，2-4株的叢生芽 團(tuán)塊生長(zhǎng)粗壯并長(zhǎng)出新根。
[0012] 步驟5組培苗的煉苗與馴化移栽： 當(dāng)步驟4獲得的苗2-4株的叢生芽團(tuán)塊中苗長(zhǎng)至株高4-8厘米，根1-3條時(shí)即可移入 煉苗室進(jìn)行7-14天煉苗培養(yǎng)，W提高其環(huán)境適應(yīng)能力。煉苗結(jié)束后，先從培養(yǎng)瓶中取出上 述叢生芽團(tuán)塊，洗凈根部培養(yǎng)基，再浸泡在稀釋800