護(hù)的作用。
[0032]實(shí)施例4
[0033]溶菌酶二維納米薄膜作為抗菌材料的應(yīng)用，具體使用方法如下:
[0034]本實(shí)施例中溶菌酶二維納米薄膜的制備方法與實(shí)施例1相同，然后以瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)將溶菌酶二維納米薄膜轉(zhuǎn)移到紙的表面，起到抗菌保護(hù)的作用。
[0035]實(shí)施例5
[0036]溶菌酶二維納米薄膜作為抗菌材料的應(yīng)用，具體使用方法如下:
[0037]本實(shí)施例中溶菌酶二維納米薄膜的制備方法與實(shí)施例1相同，然后以瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)將溶菌酶二維納米薄膜轉(zhuǎn)移到彎曲塑料管的表面，起到抗菌保護(hù)的作用。
[0038]實(shí)施例6
[0039]溶菌酶二維納米薄膜作為抗菌材料的應(yīng)用，具體使用方法如下:
[0040]為了證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)室研究試驗(yàn)，具體試驗(yàn)情況如下:[0041 ] 1、抗菌性能試驗(yàn)
[0042]將0.1433g三(2-羧乙基)膦加到10mL 10mmol/L pH值為7.4的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至6.4，配制成50mmo 1 /L的三(2-羧乙基)膦的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液;將溶菌酶加入10mL 10mmol/L pH值為7.4的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液中，分別配制成2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL溶菌酶的4-輕乙基呢嘆乙磺酸緩沖溶液;取1 OmL50mmo 1/L三(2-羧乙基)膦的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液與1 OmL不同濃度溶菌酶的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液混合均勻，室溫靜置50分鐘，在混合液表面形成一層薄膜，即溶菌酶二維納米薄膜。以瓊脂糖凝膠作為介質(zhì)分別將溶菌酶二維納米薄膜轉(zhuǎn)移到玻璃片表面。
[0043]將金黃色葡萄球菌菌株、大腸桿菌菌株分別在LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)16小時(shí)，然后將細(xì)菌懸液接種到新鮮LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，待0D6Q() = 0.5時(shí)，將細(xì)菌培養(yǎng)液用pH值為7.4的PBS緩沖液稀釋至5X105CFU/mL，再將10.0yL稀釋后的細(xì)菌培養(yǎng)液接種在粘附溶菌酶二維納米薄膜的玻璃片上，在35mL無菌培養(yǎng)皿中37°C孵化2小時(shí)，接著添加2mL pH值為7.4的PBS緩沖液到35mL無菌培養(yǎng)皿中沖洗細(xì)菌，取10.0yL計(jì)算菌落數(shù)。結(jié)果見圖3和圖4。
[0044]將念珠菌菌株在含酵母麥芽培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng)18小時(shí)，待0D_= 1.0時(shí)，將念珠菌培養(yǎng)液用pH值為7.4的PBS緩沖液稀釋至5 X 105CFU/mL，再將10.0yL稀釋后的念珠菌培養(yǎng)液接種在粘附溶菌酶二維納米薄膜的玻璃片上，在35mL無菌培養(yǎng)皿中28°C孵化2小時(shí)，接著添加2mL pH值為7.4的PBS緩沖液到35mL無菌培養(yǎng)皿中沖洗念珠菌，取10.0yL計(jì)算菌落數(shù)。結(jié)果見圖5。
[0045]由圖3?5可見，溶菌酶二維納米薄膜具有廣譜和高效的抗菌性能，可以對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和念珠菌三種菌產(chǎn)生抗性，且對這三類菌呈現(xiàn)良好的抗菌效率，抗菌效率在2小時(shí)時(shí)基本可達(dá)到90%及以上。并且隨著溶菌酶濃度的增加制備的溶菌酶二維納米薄膜的抗菌性也在提高(均可達(dá)到95%及以上)。
[0046]發(fā)明人按照上述方法測試了4mg/mL溶菌酶的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液制備的溶菌酶二維納米薄膜粘附于玻璃片上對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抗菌效率隨時(shí)間的變化，結(jié)果見圖6。由圖可見，溶菌酶二維納米薄膜對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的殺害效率在2小時(shí)時(shí)均可達(dá)到90%以上。
[0047]2、細(xì)胞毒性試驗(yàn)
[0048]將新鮮人類紅細(xì)胞(hRBC)用pH值為7.4的tris緩沖液在1500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘洗滌三次，得到在tr i s緩沖液中懸浮的hRBC濃度為5.0%(ν/ν),然后將粘附實(shí)施例1中溶菌酶二維納米薄膜的玻璃片沉浸在2.0mL上述hRBC的tris緩沖液中，在100轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下37°C孵化1小時(shí)，之后將玻璃片在1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。采用激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果見圖7。由圖可見，人類紅細(xì)胞并沒有發(fā)生變形或者破裂，說明溶菌酶二維納米薄膜作為抗菌材料對細(xì)胞無毒性。
[0049]3、細(xì)胞吸附性試驗(yàn)
[0050]將0.1433g三(2-羧乙基)膦加入10mL 10mmol/L pH值為7.4的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至4.5，配制成50mmol/L的三(2-羧乙基)膦的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液;將20mg溶菌酶加入10mL 10mmol/L pH值為7.4的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液中，配制成2mg/mL的溶菌酶的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液;將10mL 50mmol/L的三(2-羧乙基)膦的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液與10mL2mg/mL的溶菌酶的三羥甲基氨基甲烷緩沖溶液混合均勾，將玻璃片貼于混合液體表面上，室溫靜置50分鐘，在玻璃片表面直接形成一層自組裝薄膜，即溶菌酶二維納米薄膜，起到抗菌保護(hù)的作用。
[0051]將健康兔新鮮血液在1000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，得到血小板血漿(PRP)。將空白玻璃片和粘附溶菌酶二維納米薄膜的玻璃片均沉浸在37°C的PBS緩沖液(pH值為7.4)中孵化1小時(shí)，然后注入lmL PRP，在37°C孵化30分鐘，用新鮮的PBS緩沖液沖洗空白玻璃片和粘附溶菌酶二維納米薄膜的玻璃片3?5次。最后，用2.5?1%戊二醛水溶液在4°C處理玻璃片和粘附溶菌酶二維納米薄膜的玻璃片，經(jīng)過一晚上后用新鮮的PBS緩沖液洗凈，再用25%、50%、75%、100%的梯度濃度的乙醇脫水。采用掃描電子顯微鏡觀察，結(jié)果見圖8。由圖可見，溶菌酶二維納米薄膜對細(xì)胞(血小板)無吸附性，因此對細(xì)胞具有良好的防污性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.溶菌酶二維納米薄膜作為抗菌材料的應(yīng)用，所述的菌為革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的溶菌酶二維納米薄膜作為抗菌材料的應(yīng)用，其特征在于:所述的革蘭氏陽性菌為金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌或破傷風(fēng)桿菌，革蘭氏陰性菌為大腸桿菌、痢疾桿菌或傷寒桿菌，真菌為念珠菌或賦格曲菌。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的溶菌酶二維納米薄膜作為抗菌材料的應(yīng)用，其特征在于:在制備溶菌酶二維納米薄膜的過程中直接將待保護(hù)的基材與溶液表面接觸，使溶菌酶相轉(zhuǎn)變生成的納米顆粒通過表界面誘導(dǎo)直接在液固表面自組裝形成二維納米薄膜，原位生長于待保護(hù)的基材表面，起抗菌保護(hù)的作用，其中所述的待保護(hù)的基材為對水具有耐抗性的基材。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶菌酶二維納米薄膜作為抗菌材料的應(yīng)用，其特征在于:所述的對水具有耐抗性的基材為硅片、玻璃、二氧化硅、聚對苯二甲酸乙二醇酯、纖維、頭發(fā)絲、聚酰亞胺、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯中的任意一種。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的溶菌酶二維納米薄膜作為抗菌材料的應(yīng)用，其特征在于:將制備好的溶菌酶二維納米薄膜直接粘附于待保護(hù)的基材表面，起抗菌保護(hù)的作用，其中所述的待保護(hù)的基材為對水具有敏感性的基材。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的溶菌酶二維納米薄膜作為抗菌材料的應(yīng)用，其特征在于:所述的對水具有敏感性的基材為紙、木材、布料、繪畫、銅網(wǎng)、鐵、鋁、鎳、鉑、金、銅、銀、電子器件中的任意一種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種溶菌酶二維納米薄膜作為抗菌材料的應(yīng)用。本發(fā)明以溶菌酶二維納米薄膜作為抗菌材料，只需在制備溶菌酶二維納米薄膜的過程中原位生長于基材表面或直接將制備好的溶菌酶二維納米薄膜粘附在基材表面，而且可以原位生長或粘附于各種形狀的基材表面。本發(fā)明以溶菌酶二維納米薄膜作為抗菌材料，其具有廣譜和高效的抗菌性能，可以把抗菌譜從古典革蘭氏陽性菌一類菌擴(kuò)大到革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌三類菌，且對這三類菌呈現(xiàn)良好的抗菌效率，抗菌效率在2小時(shí)時(shí)基本都可達(dá)到90％及以上，其對待保護(hù)的基材具有良好的粘附性，對細(xì)胞無毒性和吸附性，因此對細(xì)胞具有良好的防污性，還可作為一種理想的抗菌食品包裝材料和醫(yī)療應(yīng)用程序材料。
【IPC分類】A01P3/00, A01N25/34, A01N63/00, A01P1/00
【公開號】CN105475359
【申請?zhí)枴緾N201510822799
【發(fā)明人】楊鵬, 古金
【申請人】陜西師范大學(xué)
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2015年11月24日