一種人脂肪干細(xì)胞用的細(xì)胞凍存液的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種人脂肪干細(xì)胞凍存液及其制備 方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells,ADSCs)是近年來從脂肪組織中分離 得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，具有可迅速擴(kuò)增、不易衰老等一般干細(xì)胞的特點(diǎn)。 人脂肪干細(xì)胞即人體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞是目前廣泛應(yīng)用于組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一 種成體干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一樣具有多向分化潛能。ADSCs呈成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)，胞 漿和核仁豐富，呈平行或縱滿樣排列。細(xì)胞周期分析顯示G0/G1期的細(xì)胞占69%，S期占 24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在條件下傳代培養(yǎng)2-3天細(xì)胞增殖I倍。多次傳代（10-20代)后，細(xì)胞增殖速度無明顯減慢，在傳代6次后細(xì)胞群體中出現(xiàn)衰老細(xì)胞，第15代細(xì)胞群 體中衰老細(xì)胞約占15%。
[0003] 由于人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，原代細(xì)胞鋪滿的時(shí)間約2周W上，達(dá) 到一定的數(shù)量需要3周左右。人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)傳代容易發(fā)生自發(fā)分化，失 去其多向分化的潛能。所W為保證實(shí)驗(yàn)的連續(xù)性，必須隨時(shí)提供大量的實(shí)驗(yàn)或組織工程用 的種子細(xì)胞。因此，對(duì)于細(xì)胞的需求非常強(qiáng)烈。現(xiàn)在，將生產(chǎn)好的細(xì)胞進(jìn)行冷凍保存，使用時(shí) 再幾種解凍使用也是常規(guī)的使用模式。然而現(xiàn)有技術(shù)中干細(xì)胞凍存使用的凍存液有含血清 和無血清的兩類，由于血清具有成分復(fù)雜、質(zhì)量不穩(wěn)定、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，無血清凍存和復(fù) 蘇技術(shù)成為發(fā)展趨勢(shì)。低溫保存干細(xì)胞主要依靠抗凍液二甲基亞諷(DMSO)和血清的保護(hù)。 常用到的細(xì)胞保護(hù)劑還有徑乙基淀粉0ES)、聚乙二醇(PEG)等。但是，DMSO會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒 性作用，對(duì)凍存的干細(xì)胞造成不可逆的損傷。為獲得來源方便的神經(jīng)干細(xì)胞，開展有效的神 經(jīng)干細(xì)胞凍存方法是本領(lǐng)域迫切的需求，建立一種長(zhǎng)期低溫保存人脂肪干細(xì)胞的方法對(duì)于 促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞的研巧和應(yīng)用具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種人脂肪干細(xì)胞冷凍保存液W及相應(yīng)的制備 方法及使用方法。
[000引紅果黃肉楠是一種小喬木，申請(qǐng)人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，該植物中具有能夠耐寒冷的物 質(zhì)存在，因此，申請(qǐng)人通過高通量篩選獲得了相應(yīng)的具有耐寒的多膚，因此，申請(qǐng)人嘗試將 其加入到冷凍保存液中，用于保存細(xì)胞。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] -種人脂肪干細(xì)胞冷凍保存液，其特征在于由如下各組分組成：其特征是冷凍存 液中含有:0.5%w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 %w/v卵憐脂，多膚0.1 %w/ v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMEM培養(yǎng)基定容至 100ml，所述多膚的序列如SEQ ID NO: 1-32任一所示。所述多膚有申請(qǐng)人通過前期的大量的 基因庫篩選得到，所述多膚具有保護(hù)細(xì)胞免受損傷的功能。其名稱分別為KATS-UKATS-2、 KATS-3、KATS-4、KATS-5、KATS-6、KATS-7、KATS-8、KATS-9、KATS-10、KATS-11、KATS-12、 KATS-13、KATS-14、KATS-15、KATS-16、KATS-17、KATS-18、KATS-19、KATS-20、KATS-21、KATS-22、KATS-23、KATS-24、KATS-25、KATS-26、KATS-27、KATS-28、KATS-29、KATS-30、KATS-31、 KATS-32,其依次對(duì)應(yīng)于沈Q ID N0:l-32。
[0008] 在本發(fā)明的細(xì)胞的凍存液中，海藻糖W及維生素 E和多膚具有明確的抵御外來傷 害對(duì)細(xì)胞的損傷，特別是多膚，還具有保護(hù)細(xì)胞免受凍存時(shí)冰結(jié)晶對(duì)細(xì)胞的損傷。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種人脂肪干細(xì)胞的凍存液的制備方法，即將所述各組分混合搖 勻即成。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種人脂肪干細(xì)胞凍存方法，包括W下步驟：
[0011] A.凍存液制備：制備所述的細(xì)胞凍存液，將各組分按照常規(guī)的操作方法將各組分 按照相應(yīng)的比例混合即可獲得；
[0012] B.細(xì)胞懸液制備:培養(yǎng)生長(zhǎng)成單層的人脂肪細(xì)胞一瓶，0.20 %膜蛋白酶液消化4分 鐘，棄膜酶液，加入DMEM培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，離屯、4000轉(zhuǎn)/分，棄上清， 加入步驟A凍存液2ml，混均，置入無菌的凍存管內(nèi)；
[0013] C.冷凍:先將凍存管在4°C下凍存30min，然后放入-30°c凍存化，再放入-80°c凍存 3h，最后移入液氮中保存；
[0014] D.細(xì)胞復(fù)蘇:取出凍存管快速置于37°C水浴，震蕩直至細(xì)胞懸液完全融化，然后用 5倍DMEM液稀釋，100化/min離屯、5min,離屯、去除上清液，再重復(fù)3次。所述細(xì)胞懸浮濃度為 IO8 細(xì)胞 Aa-IO^ 細(xì)胞/ml。
[001引本發(fā)明的有益效果：
[0016] 本發(fā)明的人脂肪干細(xì)胞凍存液，復(fù)蘇細(xì)胞存活率可達(dá)97% W上，較使用常規(guī)細(xì)胞 凍存液的復(fù)蘇存活率有了顯著提高，基本上沒有細(xì)胞的損耗。
[0017] 本發(fā)明的干細(xì)胞凍存液可W長(zhǎng)期保存干細(xì)胞，細(xì)胞活性不發(fā)生變化，保證了細(xì)胞 生物學(xué)活性。
[0018] 本發(fā)明神經(jīng)細(xì)胞凍存方法，操作簡(jiǎn)單可行，價(jià)格適宜，具有較好的實(shí)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1多膚的制備
[0020] 取紅果黃肉楠葉片5g，清洗干凈，絞碎，棒汁，加入木瓜蛋白酶和膜蛋白酶，加酶量 8000 lU/g葉片，酶解溫度47°C，pH值7.5，酶解時(shí)間1.化，酶解完成后90°C滅酶IOmin;滅酶后 的物料過濾除去不溶物，得到溶液，所得多膚溶液加入4%活性炭吸附脫色，用葡聚糖G-50 (Sephadex G-50)進(jìn)行多膚分離，20mmol/L肥1溶液洗脫，流速1.3mL/分鐘，分別收集不同 時(shí)間段的洗脫產(chǎn)物，調(diào)節(jié)溶液至pH7.0，10000轉(zhuǎn)/分鐘離屯、15分鐘，經(jīng)大孔樹脂DA201-C脫鹽 處理后，真空濃縮，上清液冷凍干燥備用；經(jīng)十二烷基硫酸鋼-聚丙締酷胺凝膠電泳（SDS-PAGE)，回收小分子量的條帶，其中經(jīng)過功能驗(yàn)證，共得到32個(gè)小膚的序列具有穩(wěn)定人脂肪 干細(xì)胞，促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)，保持干細(xì)胞正常生長(zhǎng)狀態(tài)的功效。根據(jù)色譜柱中不同的峰值分離 時(shí)間，可W批量獲得相應(yīng)的小膚，也可人工合成所述的多膚。所述多膚的序列如SEQ ID NO: 1-32所示。分別命名為KATS-I~32。
[0021] 實(shí)施例2人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[0022] 將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 %w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0023] 實(shí)施例3人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[0024] 將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0025] 實(shí)施例4人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[0026] 將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID N0:3所示。
[0027] 實(shí)施例5人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[0028] 將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID N0:4所示。
[0029] 實(shí)施例6人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[0030] 將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID N0:5所示。
[0031] 實(shí)施例7人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[0032] 將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID N0:6所示。
[0033] 實(shí)施例8人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[0034] 將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID N0:7所示。
[0035] 實(shí)施例9人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[0036] 將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID N0:8所示。
[0037] 實(shí)施例10人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[003引將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID N0:9所示。
[0039] 實(shí)施例11人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[0040] 將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID NO: 10所示。
[0041] 實(shí)施例12人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[0042] 將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 %w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID NO: 11所示。
[0043] 實(shí)施例13人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[0044] 將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID NO: 12所示。
[004引實(shí)施例14人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[0046] 將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0047] 實(shí)施例15人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[004引將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v卵憐脂，多膚0.1 % w/v，bFGF l%w/v，維生素 E l%w/v，還原性谷脫甘膚0.5%w/v最后用DMM培養(yǎng)基定容至 100ml，其中所述多膚的序列如SEQ ID NO: 14所示。
[0049] 實(shí)施例16人脂肪干細(xì)胞凍存液的制備
[0050] 將0.5 %w/v低密度脂蛋白，1 %w/v的海藻糖，1 %甘油，1 % w/v