一種紅花百里香無菌苗誘導(dǎo)再生植株的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于誘導(dǎo)再生技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種紅花百里香無菌苗誘導(dǎo)再生植株的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紅花百里香(Thymus serpyllum L.)屬于唇形科百里香屬，莖葉有香味，其莖株耐 干旱、免修剪，作為園林綠化植物，其應(yīng)用前景廣闊。用其植株提取的百里香精油，能夠有效 的抑制霉菌和微生物的生長，并且能夠緩解神經(jīng)緊張感，在食品、化工領(lǐng)域均有很大用途。 百里香精油是最強勁的抗菌劑之一，具有抗菌、消炎止痛、抗腫瘤、抗氧化、防止血栓形成及 減緩身體器官組織衰老等重要的藥用價值，可用于預(yù)防和治療人類的疾病，并具有強烈的 抗真菌活性和高效防腐性，對昆蟲包括蚊子也具有祛除的功效。另外，百里香提取物還具有 化感作用，有望成為新型的生物除草劑?？傊倮锵憔鸵恢笔蔷椭械木?，在醫(yī)藥、食 品加工、化妝品、精細化工及日常生活中被廣泛應(yīng)用。百里香精油潛在的應(yīng)用價值：百里香 精油對霉菌有良好的抑制作用，可以作為濕度較大地區(qū)人們家居之用。研究表明低濃度的 百里香精油和百里酚就能夠?qū)Πl(fā)霉的墻壁進行消毒，并能夠持久的抑制潮濕居所內(nèi)的真菌 生長(Klaric，K 〇salec et al.2007)。在地中海沿岸國家，尤其是希臘和埃及等國人民喜歡 使用百里香作為香辛調(diào)料。百里香精油可以刺激白細胞增殖，提升人體免疫系統(tǒng) (Elhabazi，Dicko et al.2006)，在治療人免疫缺陷如癌癥、白血病和AIDS方面有巨大的應(yīng) 用潛力。百里香加入香薰爐中使用，百里香可強化肺臟，對支氣管炎很有幫助對呼吸系統(tǒng)感 染者也特別有益，并可舒緩壓力，消除神經(jīng)性疼痛;百里香精油的主要成份一一百里酚具有 抗血小板凝集的功能，可以作為抗血栓和血管硬化的藥物（Okazaki，Kawazoe et al. 2002)。百里香還能強化神經(jīng)，活化腦細胞，能提高記憶力和注意力。也能提振低落的情 緒、筋疲力竭的感覺、以及挫敗的沮喪感。目前，雖然關(guān)于百里香屬植物的組織培養(yǎng)和快速 繁殖技術(shù)研究有一些，其種類主要集中于普通百里香、東北百里香，有關(guān)于紅花百里香 (Thymus serpyllum L.)的組培技術(shù)未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對上述技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供了一種紅花百里香無菌苗誘導(dǎo)再生植株的方法。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種紅花百里香無菌苗誘導(dǎo)再 生植株的方法，包括如下步驟：
[0005] S1.無菌苗的獲取:取紅花百里香種子包裹在紗布中，放入培育瓶，先用酒精浸泡 消毒，再用無菌水沖洗后放入次氯酸鈉溶液浸泡3±lmin，最后用無菌水再次沖洗，消毒后 的種子接種到1/2MS培養(yǎng)基得紅花百里香無菌苗；
[0006] S2.不定芽的誘導(dǎo)分化：選取培養(yǎng)30 ±2天的紅花百里香無菌苗，將其切成3 ± 0.5cm且?guī)в幸秆康那o段，接種到MS培養(yǎng)基中，進行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，28±2天后，莖段周圍 已經(jīng)生成不定芽；
[0007] S3.不定芽的增殖培養(yǎng):紅花百里香不定芽生長到2 ±0.2cm時，將不定芽切分為每 叢3-4個芽，轉(zhuǎn)接到調(diào)整的MS培養(yǎng)基進行不定芽增殖培養(yǎng)；
[0008] S4.不定芽的生根培養(yǎng)及幼苗移栽:在紅花百里香不定芽長到4cm以上時，將其切 成3 ± 0.2cm左右的莖段，接種到不定芽生根MS培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)生根，在第15 ±1天開始萌動 生長出小根，30±2天生根數(shù)達到8±1，當根長到3cm以上時進行移栽。
[0009] 進一步:在上述紅花百里香無菌苗誘導(dǎo)再生植株的方法，所述MS培養(yǎng)基分為大量 元素、微量元素、鐵鹽和有機溶液四種母液的組合，如表1所述。在S1中的1/2MS培養(yǎng)基，在表 1的基礎(chǔ)上，大量元素減半其余元素不變的MS培養(yǎng)基。所述MS培養(yǎng)基還包括在母液中增加3 ±0.3%蔗糖和0.8±0.05%瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH=5.8±0.5;MS培養(yǎng)基在121°C高壓滅菌鍋中滅 菌20 ± lmin，培養(yǎng)溫度為25 ± 2°C，光照度2000-25001x，光照周期12 ± lh/d。
[0010] 再進一步：在上述紅花百里香無菌苗誘導(dǎo)再生植株的方法，S1酒精濃度為70%-75%，次氯酸鈉溶液的活性氯含量為10% ± 1 %。
[0011] S2的MS培養(yǎng)基中，還加入細胞分裂激素6 - BA和植物生長素萘乙酸NAA，加入后細 胞分裂激素6 - BA濃度是0. lmg/L-0.6mg/L，植物生長素萘乙酸NAA濃度是0. lmg/L-0.3mg/ L，且細胞分裂激素6 - BA和萘乙酸NAA需要在MS培養(yǎng)基滅菌前加入;優(yōu)選的細胞分裂激素 6-BA濃度是O.lmg/L，植物激素生長素萘乙酸NAA濃度是0.3mg/L。
[0012] S3調(diào)整的MS培養(yǎng)基是指MS基本配方中大量元素（1、3/4、1/2、1/4、0)和微量元素 (1、3/4、1/2、1/4、0)配比如表2所示13培養(yǎng)基是一種基本培養(yǎng)基，為了配制和使用方便，本 領(lǐng)域技術(shù)人員把這種培養(yǎng)基的19中成分又分為4大類，即鐵鹽和有機溶液兩種母液取用量 不變，大量元素和微量元素取用量分別設(shè)置3/4、1/2、1/4、0，如表2的所示。優(yōu)選的53調(diào)整的 MS培養(yǎng)基，還加入細胞分裂激素6 - BA和植物生長素萘乙酸NAA，加入后細胞分裂激素6 - BA 濃度是0. lmg/L，植物生長素萘乙酸NAA濃度是0.3mg/L，且細胞分裂激素6-BA和萘乙酸NAA 需要在MS培養(yǎng)基滅菌前加入。
[0013] S4不定芽生根MS培養(yǎng)基，還加入植物生長素萘乙酸NAA，加入后萘乙酸NAA濃度小 于或等于1.5mg/L，且萘乙酸NAA需要在MS培養(yǎng)基滅菌前加入，優(yōu)選的植物生長素萘乙酸NAA 的濃度是l.〇mg/L。
[0014] S4移栽前先將培育瓶瓶蓋打開，保持濕潤放置2d，取出小苗，用自來水沖去附著在 根上的培養(yǎng)基，將小苗移栽到已滅菌的培養(yǎng)基質(zhì)中，浸透水后放入人工溫室培養(yǎng)。
[0015] 本發(fā)明中，6_BA:6_ 芐基腺噪呤6-Benzylaminopurine;NAA:萘乙酸 Naphthylacetic acid;MS:Murashige和Skoog培養(yǎng)基
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明紅花百里香(Thymus serpyllum L.)再生體系的建立，在 不定芽的誘導(dǎo)分化期，培養(yǎng)30 ±2天的紅花百里香無菌苗進行不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)，其誘導(dǎo)率最 高可達94%，并且不定芽的生長狀況良好。將紅花百里香不定芽接種到增殖培養(yǎng)基中，其增 殖系數(shù)最高達到39.90±1.72,不定芽的莖較粗、顏色泛綠。不定芽的生根培養(yǎng)及幼苗移栽， 在第15天開始萌動生長出小根，30天平均生根數(shù)達到8.0 ± 1，生根率為100 %，將小苗移栽 到已滅菌的培養(yǎng)基質(zhì)中，浸透水后放入人工溫室培養(yǎng)，成活率為90%。
【具體實施方式】
[0017]下面以具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形 式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和 設(shè)備。
[0018] 1.無菌苗的獲取
[0019] 取300粒飽滿的紅花百里香種子包裹在紗布中，放入三角瓶，先用75%酒精浸泡 30s消毒，