境中，去除清洗后的金釵石斛植株的葉片，并用75%的酒 精浸泡20s，用無菌水清洗2次，再用濃度0.1%的升汞浸泡15min，最后再用無菌水清洗6次； 第三步:將完成了第二步的金釵石斛植株切成若干莖段，每個莖段含有一個腋芽，將莖 段接種到MS固體培養(yǎng)基中，3~5d后取出，制得制得金釵石斛腋芽； 步驟五、接種:將MS培養(yǎng)液倒入間歇浸沒式生物反應器中，然后將步驟四得到的金釵石 斛腋芽接種到間歇浸沒式生物反應器中，每升MS培養(yǎng)液中接種50個金釵石斛腋芽； 步驟六、培養(yǎng):設定間歇浸沒式生物反應器的相關參數，即：浸沒頻率為20min/12h，培 養(yǎng)時間為150d;設定培養(yǎng)環(huán)境條件為:光照強度1500~1800Lx，光照12h/d，溫度為25 ± 1°C。 [0018]此實施例：金釵石斛培養(yǎng)增殖系數為29.4,將種苗移栽3個月后，植株成活率 98.2%，且植株生長健康。
[0019]實施例3: -種金釵石斛種苗的組培方法，建立間歇式浸沒液體培養(yǎng)系統(tǒng)，包括以 下步驟： 步驟一、制備馬鈴薯汁液:選擇完好無腐爛的馬鈴薯塊莖，研磨或壓碎榨汁，過濾取汁 液，備用； 步驟二、MS培養(yǎng)液的配置與滅菌消毒： MS培養(yǎng)液的組分及組分用量為:MS、NAA0 · 5mg/L、6-BAl · Omg/L、馬鈴薯汁液100g/L、蔗 糖30g/L，調節(jié)pH值在5.70~6.00范圍內，配置完成后，將MS培養(yǎng)液倒入試劑瓶中，采用濕熱 滅菌法，在121°C、0.5MPa條件下滅菌20min后備用； 步驟三、間歇浸沒式生物反應器的滅菌:利用濕熱滅菌法，在121°C、0.5MPa條件下對間 歇浸沒式生物反應器進行滅菌20min后備用； 步驟四、金釵石斛腋芽的制備： 第一步：制備MS固體培養(yǎng)基:MS、NAA0 · 5mg/L、6-BAl · 0mg/L、馬鈴薯汁液100g/L、蔗糖 30g/L、瓊脂 7g/L; 第二步:采用金釵石斛植株，用濃度為0.5%的新潔爾滅溶液浸泡金釵石斛植株20min， 然后用流動的水清洗30min;在無菌環(huán)境中，去除清洗后的金釵石斛植株的葉片，并用75%的 酒精浸泡15s，用無菌水清洗2次，再用濃度0.1%的升汞浸泡10min，最后再用無菌水清洗5 次； 第三步:將完成了第二步的金釵石斛植株切成若干莖段，每個莖段含有一個腋芽，將莖 段接種到MS固體培養(yǎng)基中，3~5d后取出，制得制得金釵石斛腋芽； 步驟五、接種:將MS培養(yǎng)液倒入間歇浸沒式生物反應器中，然后將步驟四得到的金釵石 斛腋芽接種到間歇浸沒式生物反應器中，每升MS培養(yǎng)液中接種35個金釵石斛腋芽； 步驟六、培養(yǎng):設定間歇浸沒式生物反應器的相關參數，即：浸沒頻率為5min/8h，培養(yǎng) 時間為60d;設定培養(yǎng)環(huán)境條件為:光照強度1500~1800Lx，光照12h/d，溫度為25 ± 1°C。
[0020]此實施例:金釵石斛培養(yǎng)增殖系數為30.0,將種苗移栽3個月后，植株成活率100%， 且植株生長健康。
[0021 ]實施例4: 一種金釵石斛種苗的組培方法，建立間歇式浸沒液體培養(yǎng)系統(tǒng)，包括以 下步驟： 步驟一、制備馬鈴薯汁液:選擇完好無腐爛的馬鈴薯塊莖，研磨或壓碎榨汁，過濾取汁 液，備用； 步驟二、MS培養(yǎng)液的配置與滅菌消毒： MS培養(yǎng)液的組分及組分用量為:MS、NAA5 · 0mg/L、6-BAl · Omg/L、馬鈴薯汁液200g/L、蔗 糖30g/L，調節(jié)pH值在5.70~6.00范圍內，配置完成后，將MS培養(yǎng)液倒入試劑瓶中， 采用濕熱滅菌法，在121°C、0.5MPa條件下滅菌20min后備用； 步驟三、間歇浸沒式生物反應器的滅菌:利用濕熱滅菌法，在121°C、0.5MPa條件下對間 歇浸沒式生物反應器進行滅菌20min后備用； 步驟四、金釵石斛腋芽的制備： 第一步：制備MS固體培養(yǎng)基:MS、NAA5 · 0mg/L、6-BAl · Omg/L、馬鈴薯汁液200g/L、蔗糖 30g/L、瓊脂 7g/L; 第二步:采用金釵石斛植株，用新潔爾滅溶液浸泡金釵石斛植株25min，然后用流動的 水清洗45min;在無菌環(huán)境中，去除清洗后的金釵石斛植株的葉片，并用75%的酒精浸泡20s， 用無菌水清洗2次，再用濃度為0.1%的升汞浸泡15min，最后再用無菌水清洗5次； 第三步:將完成了第二步的金釵石斛植株切成若干莖段，每個莖段含有一個腋芽，將莖 段接種到MS固體培養(yǎng)基中，3~5d后取出，制得制得金釵石斛腋芽； 步驟五、接種:將MS培養(yǎng)液倒入間歇浸沒式生物反應器中，然后將步驟四得到的金釵石 斛腋芽接種到間歇浸沒式生物反應器中，每升MS培養(yǎng)液中接種50個金釵石斛腋芽； 步驟六、培養(yǎng):設定間歇浸沒式生物反應器的相關參數，即：浸沒頻率為3min/4h，培養(yǎng) 時間為180d;設定培養(yǎng)環(huán)境條件為:光照強度1500~1800Lx，光照12h/d，溫度為25 ± 1°C。 [0022]此實施例：金釵石斛培養(yǎng)增殖系數為27.0,將種苗移栽3個月后，植株成活率97%， 且植株生長健康。
[0023] 實施例5: 與實施例3的區(qū)別在于:使用金釵石斛原球莖為外植體，并刪除步驟四。
[0024] 實施例6: 與實施例3的區(qū)別在于:使用金釵石斛組培苗為外植體，并刪除步驟四。
[0025] 對比例1: 與實施例3的區(qū)別在于:MS培養(yǎng)液和MS固體培養(yǎng)基中均不加入馬鈴薯汁液;但MS固體培 養(yǎng)基中加入瓊脂7g/mL。
[0026]實施例3與對比例1均培養(yǎng)滿30天后，比較兩組得到的金釵石斛種苗的長勢情況， 結果見表1。
[0027] 表 1
由表1可知:本發(fā)明技術方案的MS培養(yǎng)液中加入馬鈴薯汁液后，MS培養(yǎng)液中含的微量元 素豐富，含有金釵石斛生長過程中不可缺少的微量元素成分，營養(yǎng)價值增高，與對比例1得 到的金釵石斛種苗相比，本發(fā)明方案的金釵石斛種苗更健壯。
[0028] 對于本領域的技術人員來說，在不脫離本發(fā)明結構的前提下，還可以作出若干變 形和改進，這些也應該視為本發(fā)明的保護范圍，這些都不會影響本發(fā)明實施的效果和專利 的實用性。
【主權項】
1. 一種金釵石斛種苗的組培方法，其特征在于:建立間歇浸沒液體培養(yǎng)系統(tǒng)，包括以下 步驟： 步驟一、MS培養(yǎng)液的配置與滅菌消毒： MS培養(yǎng)液的組分及組分用量為:MS、NAAO . 5~5. Omg/L、馬鈴薯汁液50~200g/L和蔗糖 30g/L，調節(jié)pH值為5.70~6.00，MS培養(yǎng)液配置完成后，放入試劑瓶中，然后將試劑瓶轉移至 濕熱高壓滅菌鍋內，進行加熱加壓滅菌，加熱溫度為121°C，壓力為0.1~l.OMPa，滅菌20min 后備用；間歇浸沒式生物反應器的滅菌：取間歇浸沒式生物反應器在濕熱高壓滅菌鍋內進 行加熱加壓滅菌，加熱溫度為121°C，壓力為0.1~l.OMPa，滅菌20min后備用； 步驟二、制備金釵石斛外植體； 步驟三、接種:在無菌環(huán)境下將步驟一制得的MS培養(yǎng)液倒入間歇浸沒式生物反應器中， 然后將金釵石斛外植體接種到間歇浸沒式生物反應器中； 步驟四、培養(yǎng):設定間歇浸沒式生物反應器的相關參數，即：浸沒頻率為3~20min/4~ 12h，培養(yǎng)時間為60~180d;設定培養(yǎng)環(huán)境條件為:光照強度1500~1800Lx，光照12h/d，溫度 為 25±1。(3。2. 如權利要求1所述的金釵石斛種苗的組培方法，其特征在于:步驟二所述金釵石斛外 植體為金釵石斛原球莖或金釵石斛組培苗中的一種。3. 如權利要求1所述的金釵石斛種苗的組培方法，其特征在于:步驟二金釵石斛外植體 為金釵石斛腋芽，所述金釵石斛腋芽的制備方法為： 第一步：制備MS固體培養(yǎng)基:MS、NAA0.5~5 · Omg/L、馬鈴薯汁液50~200g/L、蔗糖30g/L 和瓊脂7g/L;混合配置后備用； 第二步:采用金釵石斛植株，用濃度為0.1~1.0%的新潔爾滅溶液浸泡金釵石斛植株5 ~30min，然后用流動的水清洗30~60min;在無菌環(huán)境中，去除清洗后的金釵石斛植株的葉 片，并用75%的酒精浸泡15~30s，用無菌水清洗2次，再用濃度0.1%的升汞浸泡10~20min， 最后再用無菌水清洗3~7次； 第三步:將完成了第二步的金釵石斛植株切成若干莖段，每個莖段含有一個腋芽，將莖 段接種到MS固體培養(yǎng)基中，3~5d后取出，制得腋芽并接種到步驟三的間歇浸沒式生物反應 器中。4. 如權利要求1至3中任一項所述的金釵石斛種苗的組培方法，其特征在于：步驟三中 外植體的接種密度為:每升MS培養(yǎng)液中接種35~80個外植體。5. 如權利要求4所述的金釵石斛種苗的組培方法，其特征在于:步驟一中馬鈴薯汁液為 馬鈴薯研磨或榨汁方式制得。6. 如權利要求5所述的金釵石斛種苗的組培方法，其特征在于:步驟四中所述浸沒頻率 為5~12min/8~10h。
【專利摘要】本專利公開了一種金釵石斛種苗的組培方法，建立間歇浸沒液體培養(yǎng)系統(tǒng)的系列步驟：步驟一MS培養(yǎng)液的配置與滅菌消毒：MS培養(yǎng)液的組分及組分用量為：MS、NAA0.5～5.0mg/L、馬鈴薯汁液50～200g/L、蔗糖30g/L，調節(jié)pH值為5.70～6.00，配置完成后，放入試劑瓶中，然后將試劑瓶轉移至濕熱高壓滅菌鍋內，采用濕熱滅菌法進行滅菌后備用；步驟二利用濕熱滅菌法對間歇浸沒式生物反應器進行滅菌；步驟三、將外植體接種到含有MS培養(yǎng)液的間歇浸沒式生物反應器中；步驟四、設定間歇浸沒式生物反應器的相關參數。使用該發(fā)明技術方案繁殖金釵石斛種苗，具有增殖率高、自動化程度高、勞動量小、組培苗質量好、適應性強的有益技術效果。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105532473
【申請?zhí)枴緾N201610058649
【發(fā)明人】徐德林, 李林, 陳集雙, 李曉飛, 張本厚, 儲士潤
【申請人】遵義醫(yī)學院
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2016年1月28日