馬鈴薯莖尖分化培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及馬鈴薯莖尖分化培養(yǎng)基及制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴薯病毒病是馬鈴薯生產(chǎn)中的重要病害，是引起馬鈴薯種性退化的主要原因。 感染病毒的馬鈴薯通過塊莖無性繁殖進(jìn)行世代積累和傳遞，致使塊莖種性變劣，產(chǎn)量不斷 下降。生產(chǎn)中一旦發(fā)生，沒有很好的防治辦法。帶毒種薯是唯一的初侵染來源，因此，控制種 薯帶毒率是控制該病害行之有效的辦法。
[0003] 病毒主要在植物體內(nèi)的維管束和細(xì)胞間移動，植物莖尖生長點(diǎn)尚未形成維管束、 且病毒在細(xì)胞間移動的較慢，不能趕上莖尖生長點(diǎn)生長的速度，且在莖尖分生組織中，病毒 不能進(jìn)行復(fù)制，因此，莖尖生長點(diǎn)沒有病毒。植物莖尖生長點(diǎn)細(xì)胞在離體情況下，在一定營 養(yǎng)的物質(zhì)，激素和其他適宜的外界條件下，可再生成一個完整植株。據(jù)此原理將馬鈴薯莖尖 生長點(diǎn)剝離，放入適宜的培養(yǎng)基和環(huán)境條件下培養(yǎng)，使其分化成苗，為組織培養(yǎng)技術(shù)，此技 術(shù)不僅能脫去病毒，也能脫去所有的真菌和細(xì)菌，能徹底控制馬鈴薯病毒病和其它所有病 害。
[0004] 國內(nèi)主要采用MS培養(yǎng)基進(jìn)行馬鈴薯莖尖培養(yǎng)。一些附加成分，植物生長調(diào)節(jié)劑的 種類和濃度對于莖尖生長發(fā)育的影響很大。細(xì)胞分裂素有利于離體莖尖成活和生長，生長 素用來控制莖尖成活和苗分化。因不同品種對激素反應(yīng)不同，所以使用的激素種類和濃度 不能一概而論。
[0005] 馬鈴薯組織培養(yǎng)技術(shù)在我國已經(jīng)很成熟，但是，分生組織成苗慢，成苗率低的問題 還需要進(jìn)一步的改進(jìn)。馬鈴薯組培過程中的褐變現(xiàn)象也是一項難以克服的技術(shù)問題。褐變 是指外植體在培養(yǎng)過程中體內(nèi)的多酚氧化酶被激活，使細(xì)胞里的酚類物質(zhì)氧化成褐色醌類 物質(zhì)，這種致死性的褐化物不但向外擴(kuò)散致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，而且還會抑制其它酶 的活性，嚴(yán)重影響外植體的脫分化和器官分化，最后致使變褐死亡。能否有效地控制褐變是 馬鈴薯組培成功的關(guān)鍵。
[0006] 抗氧劑（防褐劑)可能阻遏外植體切口處酚類物質(zhì)的合成、分泌及氧化，而保持組 織塊的生物活性，對馬鈴薯的褐化有不同程度的抑制作用，同時也受控于外植體材料種類 和培養(yǎng)基類型等其他因素。
[0007] L-半胱氨酸鹽酸鹽是一種重要的有機(jī)化工中間體，在生物化學(xué)、醫(yī)藥、食品、飼料 以及化妝品等行業(yè)具有廣泛的用途。具有鈍化多酚氧化酶的作用，有很強(qiáng)的抗氧化能力。它 有防止和推遲食品褐變，以及解毒、防曬、預(yù)防和治療放射線對人體損傷等作用。在組織培 養(yǎng)中未見有使用的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種馬鈴薯莖尖分化培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基能增加馬鈴薯莖尖 分生組織分化率。
[0009] 本發(fā)明所提供的馬鈴薯莖尖分化培養(yǎng)基的配方中含有L-半胱胺酸鹽酸鹽。
[0010] 以1L培養(yǎng)基計算，所述L-半胱胺酸鹽酸鹽的含量為O.lmg。
[0011] 所述馬鈴薯莖尖分化培養(yǎng)基的配方，為下述配方①或配方②：
[0012] 配方①:MS培養(yǎng)基+IAA O.lmg/L+6-BA 0.1mg/L+GA30.1mg/L+L-半胱胺酸鹽酸鹽 0 · lmg/L+30g/L鹿糖+5-7g/L瓊脂粉；
[0013] 配方②:MS培養(yǎng)基+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.1mg/L+GA30.1mg/L+L-半胱胺酸鹽酸鹽 0 · lmg/L+30g/L鹿糖+5-7g/L瓊脂粉。
[0014] 其中，IAA為吲哚-3-乙酸，NAA為萘乙酸，6-BA為細(xì)胞分裂素，GA3為赤霉素，
[0015] MS培養(yǎng)基的配方單為:mg/L工作液濃度，
[0016] 大量元素：
[0017] 硝酸鉀1900、硝酸銨1650、磷酸二氫鉀170、硫酸鎂(7H20)370、無水氯化鈣332.2;
[0018]微量元素：
[0019]碘化鉀〇 · 83、硼酸6 · 2、硫酸錳（1H20) 16 · 9、硫酸鋅（7H20)8 · 6、鉬酸鈉（7H20)0 · 25、 硫酸銅（5Η20)0·025、氯化鈷(6Η20)0·025;
[0020]鐵鹽：
[0021] 乙二胺四乙酸二鈉37.3、硫酸亞鐵27.8;
[0022]有機(jī)成分：
[0023] 肌醇100、甘氨酸2、鹽酸硫胺素(VBl)O.l、鹽酸吡哆醇(VB6)0.5、煙酸(VB5)0.5。
[0024] 所述馬鈴薯莖尖分化培養(yǎng)基的pH為5.8。
[0025] 本發(fā)明所提供的馬鈴薯莖尖分化培養(yǎng)基是按照包括下述步驟的方法制備得到的：
[0026] 按照上述配方配置培養(yǎng)基，分裝，于115°C滅菌20min，即可。
[0027] 所述分裝采用試管進(jìn)行，所述試管的規(guī)格為1.8cmX 18cm，每個試管中分裝有培養(yǎng) 基15ml〇
[0028] 具體地，所述馬鈴薯莖尖分化培養(yǎng)基的制備方法為：
[0029]按照表1的用量，每種藥品分別單獨(dú)稱量溶解后，如果藥品溶解較慢，可以用水浴 加熱溶解，制成大量元素的20倍濃縮液500ml，微量元素、有機(jī)成分、鐵鹽的200倍濃縮液 500ml，生長調(diào)節(jié)劑200倍濃縮液100ml。其中NAA必須用酒精預(yù)溶，再加水配成溶液。6-BA必 須用NaOH預(yù)溶，再加水配成溶液。
[0030]以1L培養(yǎng)基計算，先加入5-7g瓊脂粉，用700ml左右的蒸餾水加熱至瓊脂粉融化， 稍冷涼后，再分別緩慢加入取大量元素50ml、微量元素、有機(jī)成分、鐵鹽和生長調(diào)節(jié)劑各 5ml，再加入蔗糖30g，期間不斷攪拌至蔗糖溶解，然后定容至1000ml，調(diào)節(jié)pH為5.8。分裝至 1.8cmX18cm的試管中，每個試管15ml，于115°C滅菌20min，滅完后立即從滅菌鍋中取出。 [0031]表1培養(yǎng)基的成分(MS+生長調(diào)節(jié)劑）
[0032]
[0033] 所述馬鈴薯莖尖分化培養(yǎng)基在馬鈴薯莖尖分化成苗中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0034] 本發(fā)明在馬鈴薯組培用培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基）中添加 L-半胱氨酸鹽酸鹽，作為抗氧 劑，減少褐化現(xiàn)象，以增加馬鈴薯莖尖分生組織的成苗率。尤其是含有NAA的培養(yǎng)基，在加入 了 L-半胱氨酸鹽酸鹽后，增加了愈傷組織成苗的速度，對于2種培養(yǎng)基(含有NAA的培養(yǎng)基和 含有IAA的培養(yǎng)基)都增加了馬鈴薯莖尖生長點(diǎn)分化成苗率。
[0035] 另外，培養(yǎng)基制作過程中溫度太高，會造成碳水化合物的水解，糖轉(zhuǎn)化為酮糖，美 拉德反應(yīng)，糖碳化等現(xiàn)象，也會形成一些物質(zhì)影響馬鈴薯莖尖分生組織分化成苗。因此，培 養(yǎng)基制作過程中的操作技巧也是莖尖組織分化成苗的關(guān)鍵。本發(fā)明在培養(yǎng)基的制作和滅菌 過程都避免了高溫，盡量避免了培養(yǎng)基的變質(zhì)。
【附圖說明】
[0036]圖1為隴薯5號在含NAA和L-半胱氨酸鹽酸鹽（左）和含IAA和L-半胱氨酸鹽酸鹽 (右)培養(yǎng)