一種利用連續(xù)培養(yǎng)過程生產(chǎn)牛樟芝菌體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用連續(xù)培養(yǎng)過程大量生產(chǎn)牛樟芝菌體的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]樟芝，別名牛樟芝和牛樟菇，主要產(chǎn)于中國臺(tái)灣地區(qū)海拔450-2000米之間的山地，生于牛樟樹的心材內(nèi)壁。牛樟芝含有多種生理活性物質(zhì)，包括三萜類物質(zhì)、雜多糖、S0D、腺苷、麥角固醇、維生素、煙堿酸、核酸凝集素、幾丁質(zhì)、木質(zhì)素等，這些物質(zhì)都具有極高的藥用價(jià)值，具有保肝、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、解毒、抗炎等功效，有很好的藥用價(jià)值，是一種極具開發(fā)潛力和應(yīng)用前景的藥用真菌，近年來成為國內(nèi)外研究和開發(fā)的熱點(diǎn)。
[0003]然而，野生牛樟芝寄主專一，牛樟樹是樟芝的唯一寄主，由于牛樟樹是臺(tái)灣地區(qū)的特有樹種且數(shù)量稀少，加上野生樟芝子實(shí)體生長極其緩慢，盜伐者更是有增無減，使得野生牛樟芝子實(shí)體市場供應(yīng)嚴(yán)重失衡，臺(tái)灣已經(jīng)立法將牛樟樹列為國家一級保護(hù)樹種，不能隨意砍伐，因此野生樟芝子實(shí)體更難取得。
[0004]許多學(xué)者以人工培養(yǎng)方式來改善這種狀況。液體培養(yǎng)法能縮短牛樟芝的培養(yǎng)周期，已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)利用液體深層培養(yǎng)法培養(yǎng)牛樟芝，研究發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)的菌體中含有5種三萜類物質(zhì)，夏永軍等發(fā)現(xiàn)牛樟芝固態(tài)培養(yǎng)的菌體中活性產(chǎn)物的種類較液態(tài)培養(yǎng)的要豐富許多，但是由于培養(yǎng)方式的改變，也帶來不同的合成代謝途徑，使得樟芝液態(tài)培養(yǎng)中產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)同樣具有良好的生理活性，因此牛樟芝的液態(tài)培養(yǎng)同樣具有較大的研究意義。
[0005]由于液態(tài)培養(yǎng)中大量的活性物質(zhì)集中于牛樟芝菌體中，因此液態(tài)培養(yǎng)的研究熱點(diǎn)也在于獲得牛樟芝的菌體。目前已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了通過液態(tài)培養(yǎng)來獲得牛樟芝菌體的方法，F(xiàn)an-Chiang Yang等液體培養(yǎng)牛樟芝，利用牛樟芝絲狀真菌的特性使其長成小球形態(tài)，最終通過優(yōu)化培養(yǎng)條件最終使得液態(tài)培養(yǎng)牛樟芝7天，菌體干重達(dá)21.64g/L，此結(jié)果為目前實(shí)驗(yàn)室水平獲得菌體干重最高的。目前所報(bào)導(dǎo)的文獻(xiàn)中都是以此方法來實(shí)現(xiàn)牛樟芝的液態(tài)培養(yǎng)，而將牛樟芝菌體附著在載體上上生長的液態(tài)培養(yǎng)方法目前還沒有報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)培養(yǎng)牛樟芝菌體的生產(chǎn)方法，在傳統(tǒng)液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，利用牛樟芝絲狀真菌的特性，通過加入特定載體，牛樟芝菌體能夠生長其上，待菌體生長到一定程度后，無菌條件下刮下載體上的菌體，并加入新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以此繼續(xù)獲得新的菌體，實(shí)現(xiàn)牛樟芝菌體的連續(xù)培養(yǎng)，大大縮短了牛樟芝的培養(yǎng)時(shí)間，獲取了更多的牛樟芝菌體。本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的采取的技術(shù)方案如下:
[0007]—種通過連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn)牛樟芝菌體的方法，包括如下步驟:
[0008](I)擴(kuò)大培養(yǎng):利用挖塊接種法，將牛樟芝菌種接種至新的固體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)；
[0009](2)制備孢子懸液:無菌水洗下經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后的新菌落上的孢子，制備孢子懸液；
[0010](3)制備載體:載體由菌體生長層和支撐層組成，以化纖類大孔材質(zhì)為菌體生長層，以剛性網(wǎng)狀材質(zhì)為支撐層，將菌體生長層固定在支撐層上，放入液體培養(yǎng)基中作為培養(yǎng)牛樟芝菌的載體；
[0011](4)單次培養(yǎng):向放置了載體的液體培養(yǎng)基中接種孢子懸液，為使菌絲體均勻分布于載體上，置于180-220rpm，25-35°C的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)2-4天，大量菌體均勻附著于載體上生長，無菌條件下，倒掉殘留培養(yǎng)基，加入去離子水沖洗菌體3-4次，抽濾除去去離子水，獲取菌體；
[0012](5)連續(xù)培養(yǎng):按上述步驟(4)方法培養(yǎng)2-4天后，無菌條件下倒掉殘留培養(yǎng)基，刮下菌體，加入無菌水沖洗菌體3-4次，倒干無菌水，加入新的滅菌后的液體培養(yǎng)基，為減小培養(yǎng)中的離心力，加速菌體生長，連續(xù)培養(yǎng)過程置于110-160rpm，25-35°C的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)2-4天，重復(fù)此步驟即可實(shí)現(xiàn)牛樟芝菌的連續(xù)培養(yǎng)；
[0013](6)完成單次培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)后，獲取牛樟芝菌體，烘干，測定菌體干重。
[0014]為了更好地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明還進(jìn)一步提供以下技術(shù)方案:
[0015]進(jìn)一步地，所述步驟(I)中固體培養(yǎng)基組成為:葡萄糖10_30g/L，蛋白胨2_5g/L，麥芽浸粉10_30g/L，瓊脂10-30g/L，避光培養(yǎng)20-25天。
[0016]進(jìn)一步地，所述步驟(2)中孢子懸液中的孢子數(shù)為16-1O8個(gè)/mL。
[0017]進(jìn)一步地，所述步驟(4)中孢子懸液的接種量為2%-6%。
[0018]進(jìn)一步地，所述液體培養(yǎng)基的組成為:葡萄糖15-25g/L，蛋白胨5-15g/L，KH2P040.5-1.5g/L，MgS04.7H20 0.l_0.8g/L，116°C滅菌25min。
[0019 ]進(jìn)一步地，所述步驟(3)中菌體生長層為化纖類大孔材質(zhì)，支撐層為無毒性的剛性網(wǎng)狀材質(zhì)。
[0020]更進(jìn)一步地，所述菌體生長層裁剪成(10-30Cm)X(3-15Cm)大小的條狀，所述支撐層裁剪成(15_25cm) X (3_8cm)大小的條狀。
[0021]更進(jìn)一步地，所述化纖類大孔材質(zhì)優(yōu)選滌綸大孔、錦綸大孔、腈綸大孔或丙綸大孔等材質(zhì)中的至少一種。
[0022]更進(jìn)一步地，所述剛性網(wǎng)狀材質(zhì)優(yōu)選不銹鋼、鋁合金或鋅合金。
[0023]更進(jìn)一步地，所述化纖類大孔材質(zhì)的孔徑優(yōu)選為2_8mm，所述剛性網(wǎng)狀材質(zhì)的孔徑優(yōu)選為2_8mm。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0025](I)與其他培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明所使用的方法將牛樟芝單次培養(yǎng)的培養(yǎng)周期縮短至2-4天；
[0026](2)與其他培養(yǎng)方法相比，本發(fā)明所使用的方法更加快速有效的獲得牛樟芝菌體；單次培養(yǎng)獲得菌體干重達(dá)9_12g/L，連續(xù)培養(yǎng)5批最終獲得菌體干重達(dá)42-50g/L。
[0027](3)本發(fā)明所使用的連續(xù)培養(yǎng)的方法減少了牛樟芝培養(yǎng)中孢子懸液制備過程，縮減了培養(yǎng)工藝。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。下述實(shí)施例中的方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。本發(fā)明的范圍僅由權(quán)利要求書限定。
[0029]實(shí)施例1
[0030]以250mL的三角瓶發(fā)酵為例，利用本發(fā)明中所述方法，制備牛樟芝孢子懸液。
[0031]1、牛樟芝擴(kuò)大培養(yǎng)
[0032]利用挖塊接種法，將牛樟芝菌接種至新的固體培養(yǎng)基中，固體培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/L，蛋白胨2.5g/L，麥芽浸粉20g/L，瓊脂25g/L，避光培養(yǎng)20-25天后，新的圓形菌落形成，直徑約5cm，菌落中心呈橙色，邊緣呈白色，保存于4°C備用。
[0033]2、牛樟芝孢子懸液的制備
[0034]經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后的新菌落可用于制備孢子懸液。4°C保存的菌種于室溫中放置l_2h后，無菌條件下加入1mL無菌水，用玻璃棒輕輕刮下菌落表面的孢子，最終菌懸液呈渾濁的橙色，其中孢子數(shù)為16-1O8個(gè)/mL。
[0035]實(shí)施例2
[0036]以裝液量250mL的三角瓶發(fā)酵為例，利用本發(fā)明中所述方法，單次培養(yǎng)牛樟芝的操作工藝如下。
[0037]1、載體制備
[0038]加入培養(yǎng)基的載體由兩部分構(gòu)成，分別是菌體生長層和支撐層。菌體生長層的材質(zhì)為大孔滌綸材質(zhì)，其孔徑為2mm，裁剪成20cmX5cm大小的條狀;支撐層為不銹鋼網(wǎng)狀材質(zhì)，其孔徑為2mm大小，裁剪成15cmX 5cm大小的條狀;將菌體生長層固定在支撐層上，放入250mL三角瓶中作為培養(yǎng)牛樟芝菌的載體。
[0039 ] 2、本發(fā)明所述方法單次培養(yǎng)牛樟芝
[0040]將培養(yǎng)基加入帶有載體的三角瓶中，裝液量為100mL/250mL，培養(yǎng)基組成為:葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，KH2P04 0.8g/L,MgS04.7H20 0.5g/L，116°C滅菌25min。
[OO41 ] 加入2mL按實(shí)施例1中方法制備好的牛樟芝孢子懸液，置于180rpm，25 °C的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4天，菌體附著于滌綸材質(zhì)的載體上生長，菌體較多，分布均勻，倒掉殘留培養(yǎng)基，加入去離子水沖洗菌體3-4次，抽濾除去去離子水，置于一定溫度下烘干菌體至恒重，測得菌體干重為12g/L。
[0042]實(shí)施例3
[0043]1、載體制備
[0044]以250mL的三角瓶發(fā)酵為例，利用本發(fā)明中所述方法，連續(xù)培養(yǎng)3批次牛樟芝的操作工藝如下:
[0045]加入培養(yǎng)基的載體中，菌體生長層的材質(zhì)為大孔錦綸材質(zhì)，其孔徑為4mm，裁剪成1cmX 3cm大小的條狀;支撐層為招合金網(wǎng)狀材質(zhì)，其孔徑為5mm大小，裁剪成15cm X 3cm大小的條狀;將菌體生長層固定在支撐層上，放入250mL三角瓶中作為培養(yǎng)牛樟芝菌的載體。
[0046]2、本發(fā)明所述方法連續(xù)培養(yǎng)牛樟芝
[0047]將培養(yǎng)基加入帶有載體的三角瓶中，裝液量為100mL/250mL，培養(yǎng)基組成為:葡萄糖 15g/L，蛋白胨5g/L，KH2P04 0.5g/L,MgS04.7H20 0.lg/L，116°C滅菌25min。
[0048]加入2mL按實(shí)施例1中方法制備好的牛樟芝孢子懸液，置于185rpm，35 °C的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)2天，菌體附著于滌綸材質(zhì)的載體上生長，菌體較多，分布均勻，倒掉殘留培養(yǎng)基，加入去離子水沖洗菌體3-4次，倒干無菌水，加入新的滅菌后的培養(yǎng)基，繼續(xù)置于I lOrpm，35°C的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)2d，重復(fù)此操作2次即可實(shí)現(xiàn)牛樟芝菌的3批次連續(xù)培養(yǎng)。
[0049]收集從載體上刮下的牛樟芝菌體，去離子水沖洗3-