00%，所誘導(dǎo)的愈傷組織絕大多數(shù)為質(zhì)地疏松的淡黃色或淡綠色愈傷組織。3周后將誘導(dǎo)出的具有穩(wěn)定形態(tài)特征和生長(zhǎng)速率的愈傷組織轉(zhuǎn)到新鮮培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每2周繼代一次;所述的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的組成為:在常規(guī)的MS培養(yǎng)基中加入30g/L的蔗糖，0.7%的瓊脂，2mg/L 的谷氨酰胺，0.05-0.15mg/L 的NAA，0.1-0.3mg/L的2，4-D，0.5-2.0mg/L的6-BA，10mg/U9AgN03，pH 調(diào)為5.8-6.2;
在誘導(dǎo)愈傷組織的步驟中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類(lèi)和使用濃度是影響百蕊草愈傷組織誘導(dǎo)與分化頻率的關(guān)鍵因素。2，4-D對(duì)百蕊草愈傷組織有強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，以0.1- 0.3mg/L的2，4-D誘導(dǎo)的出愈率較高，且生長(zhǎng)狀況好。0.05-0.15mg/L的NAA誘導(dǎo)的愈傷組織生長(zhǎng)好，有光澤。培養(yǎng)基中6-BA的濃度為0.5-2.0mg/L時(shí)出愈率高，愈傷組織生長(zhǎng)好。如果濃度過(guò)低，容易形成多核體阻止細(xì)胞分化，加速細(xì)胞衰老，逐漸死亡。高濃度的6-BA使細(xì)胞體積因強(qiáng)烈的分裂活動(dòng)而急劇縮小，已形成的愈傷組織不能正常生長(zhǎng)，逐漸褐化。
[0016](3)無(wú)根苗誘導(dǎo)及快速繁殖
繼代培養(yǎng)所獲愈傷組織經(jīng)光培養(yǎng)分化增殖至30d時(shí)，用附加6-BA的MS固體培養(yǎng)基于溫度23-25°C、光照時(shí)間 12-16h/d、光照強(qiáng)度2000-3000LX
誘導(dǎo)15-20d后，可在愈傷組織表層或稍深層形成并分化出百蕊草無(wú)根苗。將誘導(dǎo)出的無(wú)根苗切成單苗，接種于增殖培養(yǎng)基于溫度23-25°C、光照時(shí)間12-16h/d、光照強(qiáng)度2000-3000Lx進(jìn)行增殖培養(yǎng)，經(jīng)26天培養(yǎng)增殖系數(shù)為8.5。所述MS固體培養(yǎng)基由0.5-1.5mg/L的NAA,0.5-1.5mg/L的6-BA ；增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加0.8-1.7mg/L的ΝΑΑ、0.4-1.0mg/L的6-BA，兩種培養(yǎng)基均附加0.7%的瓊脂，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖，pH調(diào)至5.8_6.2。
[0017]為避免激素累積造成的負(fù)面影響，采取逐代降低培養(yǎng)基中激素濃度的辦法，尤其在百蕊草無(wú)根苗大規(guī)?？旆彪A段，酌情不加或者少加激素，能有效防止百蕊草無(wú)根苗的異常生長(zhǎng)，增加有效苗數(shù)量。本發(fā)明是采用愈傷組織途徑建立無(wú)性系，為防止產(chǎn)生變異增殖7-8代后需重新誘導(dǎo)建立無(wú)性系。
[0018](4)壯苗培養(yǎng)
快繁獲得的百蕊草無(wú)根苗較纖細(xì)，以MS + 0.5-1.5mg/LNAA + 0.7%瓊脂+ 3%蔗糖，pH調(diào)至5.8-6.2的壯苗培養(yǎng)基作壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23-25°C、光照時(shí)間為12-16h/d、光照強(qiáng)度為2000-3000LX。壯苗培養(yǎng)15天后，葉片增厚、增寬，莖干增粗，幼苗健壯，色澤正常，洗去附著莖基部附著培養(yǎng)基，攤涼3天即可作為原料提取百蕊草素。
[0019]
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，任何未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種百蕊草組培瓶苗的育苗方法，包括以下步驟: (1)外植體的獲得 取春季野生百蕊草植株幼嫩健壯枝條在自來(lái)水下沖洗干凈，作表面消毒后，在無(wú)菌條件下將葉片表面劃傷，剪成長(zhǎng)度約為Icm小段； (2)愈傷組織的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng) 將剪切好的葉片接種于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上，在溫度為24±1°C、光照培養(yǎng)條件為1500-2000LX的條件下培養(yǎng)誘導(dǎo)，葉片周?chē)杆倥蛎?，誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)率可達(dá)100%，所誘導(dǎo)的愈傷組織絕大多數(shù)為質(zhì)地疏松的淡黃色或淡綠色愈傷組織;3周后將誘導(dǎo)出的具有穩(wěn)定形態(tài)特征和生長(zhǎng)速率的愈傷組織轉(zhuǎn)到新鮮培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，每2周繼代一次； (3)無(wú)根苗誘導(dǎo)及快速繁殖 繼代培養(yǎng)所獲愈傷組織經(jīng)光培養(yǎng)分化增殖至30d時(shí)，用MS固體培養(yǎng)基于溫度23-25 °C、光照時(shí)間12-16h/d、光照強(qiáng)度2000-3000Lx 誘導(dǎo)培養(yǎng)15-20d后，可在愈傷組織表層或稍深層分化出百蕊草無(wú)根苗；將誘導(dǎo)出的無(wú)根苗切下，接種于增殖培養(yǎng)基于溫度23-25°C、光照時(shí)間12-16h/d、光照強(qiáng)度2000-3000LX進(jìn)行增殖培養(yǎng)，經(jīng)26天培養(yǎng)增殖系數(shù)為8.5; (4)壯苗培養(yǎng) 快繁獲得的百蕊草無(wú)根苗較纖細(xì)，需經(jīng)壯苗培養(yǎng)基作壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23-25Γ、光照時(shí)間為12-16h/d、光照強(qiáng)度為2000-3000LX;壯苗培養(yǎng)15天后，葉片增厚、增寬，莖干增粗，幼苗健壯，色澤正常，洗去附著莖基部附著培養(yǎng)基，攤涼3天即可作為原料提取百蕊草素。2.如權(quán)利要求1所述的一種百蕊草組培瓶苗的育苗方法，其中:所述的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基的組成為:在常規(guī)的MS培養(yǎng)基中加入30g/L的蔗糖，0.7%的瓊脂，2mg/L的谷氨酰胺，0.05-0.15mg/L 的NAA，0.1-0.3mg/L的 2，4-D，0.5-2.0mg/L的6-BA，10mg/L的AgN03，pH調(diào)為 5.8-6.2。3.如權(quán)利要求1所述的一種百蕊草組培瓶苗的育苗方法，其中:所述MS固體培養(yǎng)基附加0.5-1.5mg/L的NAA,0.5-1.5mg/L的6-BA。4.如權(quán)利要求1所述的一種百蕊草組培瓶苗的育苗方法，其中:增殖培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加0.8-1.7mg/L的ΝΑΑ、0.4-1.0mg/L的6-BA，兩種培養(yǎng)基均附加0.7%的瓊脂，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的蔗糖，pH調(diào)至5.8-6.2。5.如權(quán)利要求1所述的一種百蕊草組培瓶苗的育苗方法，其中:壯苗養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加 0.5-1.5mg/LNAA + 0.7% 瓊脂 + 3% 鹿糖，pH調(diào)至5.8-6.2。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種百蕊草組培瓶苗的育苗方法，包括：取春季野生百蕊草植株幼嫩健壯枝條葉片作為外植體，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，3周后將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織轉(zhuǎn)到新鮮培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)所獲愈傷組織經(jīng)光培養(yǎng)分化增殖至30d時(shí)，用MS固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)15-20d后，分化出百蕊草無(wú)根苗。將誘導(dǎo)出的無(wú)根苗切成單苗，接種于增殖培養(yǎng)進(jìn)行增殖培養(yǎng)，經(jīng)26天培養(yǎng)增殖系數(shù)為8.5?？旆鲍@得的百蕊草無(wú)根苗較纖細(xì)，需要作壯苗培養(yǎng)，壯苗培養(yǎng)15天后，葉片增厚、增寬，莖干增粗，幼苗健壯，色澤正常，洗去附著莖基部附著培養(yǎng)基，攤涼3天即可作為百蕊草素提取原料。本發(fā)明具有增殖速度快，生產(chǎn)周期短，不受季節(jié)限制，連續(xù)生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)，不占用耕地，能實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
【IPC分類(lèi)】A01H4/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105580737
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610157666
【發(fā)明人】黃燕芬, 何軍, 王自布, 劉向陽(yáng), 曹永高
【申請(qǐng)人】貴州師范學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年5月18日
【申請(qǐng)日】2016年3月21日