組培苗蔗糖利用率的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及組培苗蔗糖利用率的測定方法，屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 植物的組織培養(yǎng)是當(dāng)前生物技術(shù)中的最基本的技術(shù)和手段，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到園 藝、農(nóng)業(yè)和林業(yè)生產(chǎn)中。它是一種在人為提供的一定溫度、光照、濕度、營養(yǎng)、激素等條件下 快速繁育植物的技術(shù)。
[0003]在植物組織培養(yǎng)過程中，組培苗的生長方式有三種：一是小植株靠光合作用進(jìn)行 的自養(yǎng)生長;二是小植株靠培養(yǎng)基中的有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長;三是小植株既靠培養(yǎng)基中 的有機(jī)碳源又靠人工光照，同時(shí)進(jìn)行異養(yǎng)和自養(yǎng)的兼養(yǎng)生長?，F(xiàn)在常規(guī)的植物組織培養(yǎng)快 繁技術(shù)大多數(shù)是以第三種方式進(jìn)行。因此蔗糖成為組織培養(yǎng)過程中不可或缺的碳源和能 源，且在目前組織培養(yǎng)中用量最大。所以判斷組培過程中蔗糖的利用率為組培的培養(yǎng)基調(diào) 控提供了理論依據(jù)。同時(shí)組培苗的自養(yǎng)能力決定了組培苗生長的情況，僅異養(yǎng)生長的組培 苗，將會(huì)導(dǎo)致植株生理、形態(tài)上的紊亂，造成生長發(fā)育延緩或死亡，引起玻璃化、生根困難等 問題。由此可見，組培苗的自養(yǎng)作用是其良好地生長發(fā)育的基礎(chǔ)。
[0004] 因此，組培苗自養(yǎng)份額的測定和蔗糖利用率的測定就顯得特別重要，目前雖然有 用Li-840型C02/H 20分析儀建立的CO2交換速率測定系統(tǒng)來測定組培苗的自養(yǎng)能力，但是測 的只是瞬時(shí)的自養(yǎng)能力，不能代表一段時(shí)間內(nèi)組培苗自養(yǎng)能力的情況，更不能測定出一段 時(shí)間內(nèi)組培苗的自養(yǎng)份額和異養(yǎng)份額和來自組培苗呼吸所貢獻(xiàn)的份額。組培苗自養(yǎng)份額的 測定和蔗糖利用率的測定對培養(yǎng)基的優(yōu)化具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:提供一種組培苗在一個(gè)培養(yǎng)周期(例如增殖培養(yǎng)）中 各種份額的測定方法;結(jié)合組培苗的異養(yǎng)份額，計(jì)算出組培苗的蔗糖利用率。為組培過程中 各種環(huán)境因子的調(diào)控，培養(yǎng)基組成，激素配比等提供理論依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0007] 它包括以下步驟：
[0008] 第一，培養(yǎng)瓶采用完全透氣的封口膜封口，分別用C3植物蔗糖和C4植物蔗糖作為 有機(jī)碳源配制C3植物蔗糖培養(yǎng)基和C4植物蔗糖培養(yǎng)基；
[0009] 第二，測定上述C3植物蔗糖和C4植物蔗糖的S13C值，C3植物蔗糖的S13C值記為δ τ，〇4 植物蔗糖的S13C值記為Sc;
[0010] 第三，選取長勢一致的組培苗，記錄它們的鮮重Μ〇,分別接種到C4植物鹿糖培養(yǎng)基 和C3植物蔗糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)至鮮重增重超20倍后，結(jié)束培養(yǎng)；
[0011] 第四，同期，一方面將待測植物的組培苗分別培養(yǎng)在無〇)2的03植物蔗糖培養(yǎng)基和 C4植物蔗糖培養(yǎng)基中；另一方面利用pH為5.5的營養(yǎng)液在待測環(huán)境中對長有2片展開葉的待 測植物進(jìn)行溶液培養(yǎng)；
[0012] 第五，分別獲取培養(yǎng)前C4植物蔗糖和C3植物蔗糖培養(yǎng)基的蔗糖濃度CO和體積Vo，培 養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基的C4植物蔗糖和C3植物蔗糖濃度c和體積V，根據(jù)蔗糖濃度和體積的變化的 計(jì)算出鹿糖的消耗。鹿糖的消耗C = CO X VQ-C X V ;
[0013] 第六，測定培養(yǎng)結(jié)束后的組培苗鮮重M。計(jì)算出組培苗的增重為B=M-M0;
[0014]第七，獲取培養(yǎng)結(jié)束后的用C4植物蔗糖培養(yǎng)基和C3植物蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的組培苗 新生葉片的S13C值Sgi和δτ1;
[0015] 第八，獲取培養(yǎng)結(jié)束后的在無〇)2的03植物蔗糖培養(yǎng)基和C4植物蔗糖培養(yǎng)基中培 養(yǎng)的組培苗新生葉片的S 13C值δ?和δτο;
[0016] 第九，獲取培養(yǎng)結(jié)束后在溶液培養(yǎng)中的待測植物新生葉片S13C值Sair;
[0017] 第十，測定培養(yǎng)期間的待測培養(yǎng)環(huán)境中空氣中的二氧化碳S13C值
[0018] 第^^一，依據(jù)δ?和δτ〇以及δτ和6(；計(jì)算出待測植物的組培苗利用C4植物蔗糖和C3植 物鹿糖產(chǎn)生碳同位素分餾值Δ G和Δ τ，Δ G = 5G -δ?，Δ τ=δτ-δτο。
[0019] 第十二，依據(jù)Sair和33計(jì)算出待測植物利用空氣二氧化碳的分餾值A(chǔ)air; Aair = Sa 5air;
[0020] 第十三，將上述所得數(shù)據(jù)，δτ、δ(；、Δ G、Δ T、Δ air、δα、δτ1、代入方程：
H十算出異養(yǎng)份額fb;
[0021] 第十四，根據(jù)上述計(jì)算得到的fb，結(jié)合組培苗的增重B和蔗糖消耗C，計(jì)算組培苗蔗 糖利用率A。鹿糖利用率A的計(jì)算公式為:f bXB = AXC，即A=fbXB/C。
[0022] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
[0023] 在植物組織培養(yǎng)過程中，組培苗通常是進(jìn)行兼養(yǎng)生長，因此，就得額外提供蔗糖作 為有機(jī)碳源。蔗糖是培養(yǎng)過程中用量最大的營養(yǎng)物質(zhì)，所以監(jiān)測組培苗蔗糖利用率對節(jié)約 生產(chǎn)成本具有重要意義。穩(wěn)定碳同位素可以示蹤營養(yǎng)源。因此，通過穩(wěn)定碳同位素技術(shù)，就 可以計(jì)算出組培苗的自養(yǎng)和異養(yǎng)份額和來自組培苗呼吸所貢獻(xiàn)的份額;根據(jù)計(jì)算得到的組 培苗異養(yǎng)份額，結(jié)合組培苗的增重和蔗糖消耗，就可以計(jì)算出組培苗的蔗糖利用率。
[0024] 自然界中碳元素有兩種穩(wěn)定同位素：12C和13C，它們的天然平均豐度分別為 98.89%和1.11 %。穩(wěn)定碳同位素組成通常用δ13(Χ%。)表示，自然界中S13C的變化為_90%〇~ +20%〇 〇
[0025] 分別選用C3植物和C4植物的蔗糖作為有機(jī)碳源。C3植物S13C的變化范圍為-20%。~-35%。，C 4植物S13C的變化范圍為-9%。~-17%。X3植物的代表性蔗糖是甜菜蔗糖，C 4植物的代 表性蔗糖是甘蔗蔗糖。
[0026] 組培苗在生長過程中會(huì)利用有機(jī)碳源和無機(jī)碳源來生長，因此就會(huì)造成新生葉片 的S13C值既有來自有機(jī)碳源的組分(異養(yǎng)來源），又有來自無機(jī)碳源的組分（自養(yǎng)來源），其 中，自養(yǎng)份額包括組培苗自身呼吸作用的份額fc和來自利用空氣的份額fa，即fa= 1-fb- fCo
[0027] 因此，利用三端元的同位素混合模型就可獲取組培苗利用有機(jī)碳源的份額。
[0028]三端元的同位素混合模型可以表示為：
[0029] 6Gl = fb(5G- Δ G)+fc(SGl- Δ air) + ( l_fb_fc)5air ( I )
[0030] 5xi = fb(5x- Δ τ)+?〇(δτι- Δ air) + ( l_fb_fc)5air (2)
[0031] 這里的δα為甘蔗蔗糖作為碳源培養(yǎng)的新生組培苗葉片的S13C值;δη為甜菜蔗糖作 為碳源培養(yǎng)的新生組培苗葉片的S 13C值;Sair為待測植物以空氣二氧化碳為碳源培養(yǎng)的新生 葉片的S13C值;S g為甘蔗蔗糖的S13C值;δτ為甜菜蔗糖的S13C值；Ag為組培苗利用甘蔗蔗糖產(chǎn) 生的同位素分餾值。A τ為組培苗利用甜菜蔗糖產(chǎn)生的同位素分餾值。Aair為待測植物以空 氣二氧化碳為碳源培養(yǎng)產(chǎn)生的同位素分餾值。
[0032]聯(lián)立方程(1)和方程(2)，求解得到：
[0033]
[0034]
[0035] 根據(jù)計(jì)算得到的fb，結(jié)合組培苗的增重和蔗糖消耗，就可以計(jì)算出組培苗蔗糖利 用率A。鹿糖利用率的計(jì)算公式為:f bXB = AXC，即A=fbXB/C。
[0036] 本方法采用的步驟少，計(jì)算簡單，準(zhǔn)確，能定量測定組培苗一個(gè)生長周期內(nèi)的各種 份額，如自養(yǎng)份額、異養(yǎng)份額等，同時(shí)能計(jì)算出組培苗在一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)蔗糖利用率，對組 培環(huán)境因子的調(diào)控具有重要的指導(dǎo)價(jià)值，為后期組培苗的馴化和移栽提供技術(shù)參數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0037]本發(fā)明的實(shí)施例：
[0038] 第一步驟，選用兩種S13C值差較大的C3植物的代表性蔗糖甜菜蔗糖和C4植物的代 表性蔗糖甘蔗蔗糖作為有機(jī)碳源，分別測定其S 13C值，甜菜蔗糖的S13C值記為δτ，甘蔗蔗糖的 S13C值記為Sc;用這兩種蔗糖同時(shí)培養(yǎng)被考察組培苗，培養(yǎng)條件完全一樣，區(qū)別在于一個(gè)是 以甜菜蔗糖為有機(jī)碳源，另一個(gè)是以甘蔗蔗糖為有機(jī)碳源。分別計(jì)算出培養(yǎng)前甘蔗蔗糖和 甜菜蔗糖培養(yǎng)基的蔗糖濃度(Co)和體積(Vo)，培養(yǎng)結(jié)束后測定培養(yǎng)基的甘蔗蔗糖和甜菜蔗 糖濃度(c)和體積(V)，根據(jù)蔗糖濃度和體積的變化的計(jì)算出蔗糖的消耗。蔗糖的消耗C = C0 Xv〇-c XV；
[0039] 第二步驟，選取長勢一致(鮮重為Mo)的組培苗分別培養(yǎng)在甜菜蔗糖和甘蔗蔗糖培 養(yǎng)基上，培養(yǎng)一個(gè)月后（增重20倍以上），測定其鮮重M。計(jì)算增重B = M-Mo。同時(shí)取一定量的 組培苗新生葉片，測定其穩(wěn)定碳同位素組成S13C值。用甜菜蔗糖培養(yǎng)的組培苗新生葉片的 S13C值記為δτ1，用甘蔗蔗糖培養(yǎng)的組培苗新生葉片的S13C值記為S ci;
[0040] 第三步驟，同期將油菜組培苗分別培養(yǎng)在無 CO2氣體培養(yǎng)瓶內(nèi)（用堿石灰吸收空氣 中的CO2和植物自身呼吸產(chǎn)生的CO 2)，分別用甜菜蔗糖和甘蔗蔗糖培養(yǎng)一個(gè)月，然后測定新 生葉片的S13C值。計(jì)算出油菜組培苗利用有機(jī)碳產(chǎn)生碳同位素分餾Δ (；和Δ τ，Δ G = SG - SG0， Δ T= δτ-δΤ()。在進(jìn)行組培苗各份額計(jì)算時(shí)，扣除分餾值；
[0041] 第四步驟，在培養(yǎng)室萌發(fā)種子(種子與組培苗所用種子相同），待幼苗長出兩片子 葉后用PH為5.5霍格藍(lán)培養(yǎng)液培養(yǎng)植物，同期培養(yǎng)一個(gè)月后，取新生葉片，烘干，磨成粉末后 測定其S 13C值，記為Sair;同時(shí)測定培養(yǎng)室空氣中二氧化碳的S13C值，記為計(jì)算得到A air， A air - 5a-5air ;
[0042] 第五步驟，計(jì)算被考察組培苗在各培養(yǎng)條件下的有機(jī)碳利用份額，將甜菜蔗糖的 S13C值記為δτ，由甜菜蔗糖做為有機(jī)碳源的組培苗新生葉片的S13C值記為δη;將甘蔗蔗糖的 S13C值記為Sc，由甘蔗蔗糖做為有機(jī)碳源的組培苗新生葉片的S13C值記為S ci;用霍格藍(lán)培養(yǎng) 液培養(yǎng)植物的葉片的S13C值記為Sair和霍格藍(lán)培養(yǎng)液培養(yǎng)植物利用空氣二氧化碳產(chǎn)生的分 餾Δ air;油菜組培苗利用有機(jī)碳產(chǎn)生碳同位素分餾△ G和△ τ;帶入方程(3)和方程(4)，計(jì)算 出各個(gè)培養(yǎng)條件下組培苗利用有機(jī)碳源的份額，即異養(yǎng)份額。還可以計(jì)算得到組培苗利用 呼吸作用產(chǎn)生的二氧化碳的份額f。，同時(shí)還可得到組培苗利用空氣二氧化碳的份額f a;
[0043] 第六步驟，根據(jù)計(jì)算得到的fb，結(jié)合組培苗的增重和蔗糖消耗計(jì)算組培苗蔗糖利 用率(表征為字母A)。蔗糖利用率的計(jì)算公式為:f bXB = AXC，即A=fbXB/C。
[0044] 本發(fā)明的實(shí)施效果如下：
[0045] 培養(yǎng)材料:甘藍(lán)型油菜組培苗
[0046] 培養(yǎng)基配方為:13+6-8六2.〇11^/1+祖4 0.111^/1，其中進(jìn)行不同氮源及氮濃度配比 實(shí)驗(yàn)，其它實(shí)驗(yàn)條件完全一致。pH值:5.8，瓊脂:7.5g/L，培養(yǎng)溫度:25 ± 2 °C。光周期：12h/d， 光照強(qiáng)度:30001x。
[0047] 分別用甘蔗蔗糖和甜菜蔗糖作為有機(jī)碳源，其穩(wěn)定碳同位素值為：甘蔗蔗糖-12.00%〇(PDB)，甜菜蔗糖-24.64%q(PDB)。測定的待測植物新生葉片的S 13C值（Sair)為-35.97%。，培養(yǎng)室空氣CO2的S13C值隊(duì))為-15.75%。，因此待測植物利用