4-松油醇型互葉白千層組培繼代芽的開放式生根培養(yǎng)方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明屬于植物無性快繁技術領域，涉及組培苗的生根方法，尤其是涉及一種4-松油醇型互葉白千層組培苗的開放式生根培養(yǎng)方法。
【背景技術】
[0002]互葉白千層(Melaleuca ahemifolia)是桃金娘科白千層屬的一種香料植物，90年代初從澳大利亞引種至我國南方，目前在廣西、廣東、云南和福建等省份都有種植?；ト~白千層的莖和葉經(jīng)過水蒸氣蒸餾而得的精油也稱茶樹油，既是天然香料，又具有強力殺菌作用，經(jīng)濟價值較高。
[0003]互葉白千層的種子多為敗育，發(fā)芽率低，且種間差異大，所以目前互葉白千層的繁育主要采用扦插和組培兩種，其中組培繁育的高效、快速及穩(wěn)定性使其更具備市場競爭力。
[0004]互葉白千層精油成分中，最主要的有效成份為4-松油醇，經(jīng)研究人員多年選育，已選育出多個松油醇含量較高的4-松油醇型互葉白千層優(yōu)良品種，但較高的松油醇成分在組培繁育時表現(xiàn)出對根系萌發(fā)的負面影響，使現(xiàn)有的組培技術生根率有限。本發(fā)明摒棄了現(xiàn)有的互葉白千層組培技術中廣泛采用的MS及其系列改良培養(yǎng)基，而是在WPM和B5培養(yǎng)基的基礎上，通過優(yōu)化調(diào)整培養(yǎng)基成分，有效降低了松油醇對生根率的影響，并且通過添加適宜的抑菌劑，建立的穩(wěn)定、高效的4-松油醇型互葉白千層組培繼代芽的開放式生根培養(yǎng)方法，為4-松油醇型互葉白千層良種組培快繁助力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的旨在提供一種4-松油醇型互葉白千層組培繼代芽的開放式生根培養(yǎng)方法，從而為其商業(yè)化快速繁育提供技術條件。
[0006]本發(fā)明的技術方案是:
通過優(yōu)化調(diào)整培養(yǎng)基的成分及比例，篩選得到可以促進4-松油醇型互葉白千層組培繼代芽生根的培養(yǎng)基配方，添加適宜的抑菌劑，再輔以適宜的溫度和光照，建立4-松油醇型互葉白千層組培繼代芽的開放式生根培養(yǎng)方法。
[0007]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的:
一種4-松油醇型互葉白千層組培繼代芽的開放式生根培養(yǎng)方法，包括繼代芽壯苗培養(yǎng)、生根培養(yǎng)基配制、生根培養(yǎng)、煉苗、移栽5個工序，其操作步驟如下:
(1)繼代芽壯苗培養(yǎng):采用常規(guī)繼代培養(yǎng)基進行繼代芽的增殖培養(yǎng);當繼代芽單芽長度達到1.0cm時，增加光照促使單芽老練；
(2)生根培養(yǎng)基配制:培養(yǎng)基配方采用2/5?4/5改良WPM培養(yǎng)基或1/5?3/5改良B5培養(yǎng)基附加IBA0.05?I.5mg/L、ABT6號0.05?I.5mg/L、蔗糖 15000mg/L、瓊脂6.0g/L，在潔凈的環(huán)境中，將培養(yǎng)基按照配方配制好后，持續(xù)煮沸20分鐘，調(diào)節(jié)pH值至5.8?6.0，加入抑菌劑后混勻，分裝在一次性聚乙烯塑料杯中，每杯用保鮮膜覆蓋并用橡膠圈固定，待降溫凝結后使用； (3)生根培養(yǎng):將步驟(I)繼代芽繼續(xù)培養(yǎng)使芽伸長，選擇長度1.0cm以上，并且綠色明顯加深，稍木質(zhì)化的單芽在超凈臺中剪下，并接種于步驟(2)中配制好的生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)；
(4)煉苗:當步驟(3)單芽生根培養(yǎng)至根系長度達到1.5cm后，將瓶苗移至室外具有遮陰裝置的大棚中進行煉苗，遮陰度要求為75?85 %，煉苗1?15天；
(5)移栽:將步驟(4)煉苗后的小苗從杯中取出，清水洗去根系附著的培養(yǎng)基，移栽至消毒處理后淋透清水的紅心土或輕基質(zhì)營養(yǎng)杯中，用塑料薄膜和遮陰網(wǎng)進行保濕遮陰2?3天后，按常規(guī)方法管護，當苗高30cm以上、無病蟲害的4-松油醇型互葉白千層組培苗木可出圃造林。
[0008]以上步驟(2)中所述的潔凈環(huán)境，是指配制培養(yǎng)基專用實驗室，實驗室內(nèi)的實驗臺面及周圍操作空間，用75%酒精噴霧消毒;分裝過程中的其他用具均用0.3%的新潔爾滅浸泡消毒15分鐘，聚乙烯塑料杯為一次性使用。
[0009]以上步驟(2)中所述的抑菌劑成分為:頭孢霉素50?150mg/L，50%的可濕性粉劑多菌靈4?10%，4_松油醇型互葉白千層枝葉浸出液I?5%。
[0010]以上所述的4-松油醇型互葉白千層枝葉浸出液的制備方法為:取一年生4-松油醇型互葉白千層枝葉250g，剪短至5cm小段后加入試劑瓶中，再加入75%的酒精IL并密封，置于4 0C冰箱中浸泡48小時，過濾獲得浸出液。
[0011]以上步驟(2 )所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為:NH4NO3 33Omg/L、CaCl2.2H20 96mg/L、MgS04.7H20370mg/L、KH2P04l70mg/L、Ca(N03)2.4H20180mg/L、K10.83mg/L、MnS04.H2022.4mg/L、ZnSO4.7H208.6mg/L^Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuS04.5H200.025 mg/L^Na2.EDTA37.3mg/L、FeSO4.7H2027.8mg/L、肌醇200mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸卩比卩多醇0.5mg/L、鹽酸硫胺素1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L。
[0012]以上步驟(2)所述改良B5培養(yǎng)基的組分和體積重量比為:KNOdSOOmg/UCaCh-SfeO 150mg/L、MgS04.7H20250mg/L、(NH4)2S04l34mg/L、NaH2P04.H20150mg/L、Ca(N03)2.4H20200mg/L、K10.83mg/L、H3B033.0mg/L、MnS04.H2O1mg/L、ZnSCU.7出0 2.0mg/L、Na2Mo04.2H2O0.25 mg/L^CuSO4.5H200.025mg/L、Na2.EDTA37.3mg/L、FeS04.7H20 27.8mg/L、肌醇200mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸卩比卩多醇0.5mg/L、鹽酸硫胺素1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L。
[0013]以上步驟(3)所述生根培養(yǎng)的條件為:溫度28±2?30±2°C，光照1500?30001x，每日光照12?16小時。
[0014]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比的有益效果和顯著進步:
1、本方法配制的生根培養(yǎng)基不需要經(jīng)過高溫高壓滅菌，節(jié)省能源降低成本，采用一次性聚乙烯塑料杯作為容器，省去了傳統(tǒng)生根玻璃瓶的購置費用和清洗的人工費用，大幅降低了生產(chǎn)成本。
[0015]2、本方法在WPM和B5培養(yǎng)基的基礎上，通過優(yōu)化調(diào)整培養(yǎng)基成分，有效降低了松油醇對生根率的影響，并通過添加抑菌劑，能有效的將開放式生根培養(yǎng)中的污染率控制在10%以下，已達到組培污染率的可接受范圍，組培繼代芽生根達到穩(wěn)定、高效。
[0016]3、本方法通過增加光照促使繼代芽老練壯苗，生根培養(yǎng)周期短，生根培養(yǎng)6?8天開始萌發(fā)出根系，生根率達到97.8?99.5 %，繼續(xù)培養(yǎng)至15天后統(tǒng)計，生根率可達到100 %。
[0017]4、本方法培育的苗木根系質(zhì)量尚，獲得的生根苗，每株根系數(shù)量4?8條根，單條根粗0.5?1.5mm，當單芽生根培養(yǎng)至根系長度達到1.5cm后，在室外10?15天的煉苗培養(yǎng)后，根系可伸長至2?3cm，且每條根上萌發(fā)出須狀側根，這種根系健壯、發(fā)達的苗木移栽成活率高，達到97.4?98.8%，具有較好的經(jīng)濟效益、社會效益和生態(tài)效益。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實施例，對本發(fā)明的一種4-松油醇型互葉白千層組培繼代芽的開放式生根培養(yǎng)方法進一步描述。
[0019]實施例1:
在南寧3月份按照本發(fā)明的方法進行生根培養(yǎng)，具體步驟如下:
(1)繼代芽壯苗培養(yǎng):采用常規(guī)繼代培養(yǎng)基進行繼代芽的增殖培養(yǎng);當繼代芽單芽長度達到1.0cm時，增加光照促使單芽老練；
(2)生根培養(yǎng)基配制:培養(yǎng)基配方采用1/2改良WPM培養(yǎng)基附加IBA0.5mg/L、ABT6號
0.6mg/L、鹿糖 15000mg/L、瓊脂 6.0g/L；
在配制培養(yǎng)基專用實驗室內(nèi)，將實驗臺面及周圍操作空間，用75%酒精噴霧消毒;分裝過程中的其他用具均用0.3%的新潔爾滅浸泡消毒15分鐘，聚乙烯塑料杯為一次性使用；
取250g—年生4-松油醇型互葉白千層枝葉，剪短至5cm小段后加入試劑瓶中，再加入
1L75%酒精并密封，置于4 0C冰箱中浸泡48小時，過濾獲得浸出液。
[0020]抑菌劑按照頭孢霉素50mg/L，多菌靈(50 %可濕性粉劑)4%，4-松油醇型互葉白千層枝葉浸出液2%比例配制。
[0021]將培養(yǎng)基按照配方配制好后持續(xù)煮沸20分鐘，調(diào)節(jié)pH值至5.8，加入抑菌劑后混勻，分裝在一次性聚乙烯塑料杯中，每杯用保鮮膜覆蓋并用橡膠圈固定，待降溫凝結后使用。
[0022](3)生根培養(yǎng):將步驟(I)繼代芽繼續(xù)培養(yǎng)使芽伸長，選擇長度1.0cm以上，并且綠色明顯加深，稍木質(zhì)化的單芽在超凈臺中剪下，接種于步驟(2)中配制好的生根培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度28 土 2°C，光照1500?25001x，每日光照12小時。
[0023]培養(yǎng)5天后根部膨大，7天后有根長出，每株4?8條，生根率98.6%，繼續(xù)培養(yǎng)至15天后統(tǒng)計，生根率100%，污染率2.3%。
[0024](4)煉苗:當步驟(3)單芽生根培養(yǎng)至根系長度達到1.5cm后，將瓶苗移至室外具有遮陰裝置的大棚中進行煉苗，遮陰度要求為75 %，煉苗10天。
[0025](5 )移栽:將步驟(4)煉苗后的小苗從杯中取出，清水洗去根系附著的培養(yǎng)基，移栽至消毒處理后淋透清水的紅心土或輕基質(zhì)營養(yǎng)杯中，用塑料薄膜和遮陰網(wǎng)進行保濕遮陰2天后，按常規(guī)方法管護，移栽成活率97.3%。
[0026]以上步驟(2)所述改良WPM培養(yǎng)基的組分和體積重量比為:NH4N03330mg/L,CaCl2.2H20 96mg/L、MgS04.7H20370mg/L^KH2PO4170mg/L^Ca(NO3)2.4H20180mg/L、K10.83mg/L、MnSO4.H2O 22.4mg/L、ZnS04.7H208.6mg/L^Na2MoO4.2H200.25mg/L、CuS04.5H200.025mg/UNa2.EDTA37.3mg/L、FeS04.7H2027.8mg/L、肌醇200mg/L、煙酸0.5mg/L、鹽酸吡哆醇0.5mg/L、鹽酸硫胺素1.0mg/L、甘氨酸2.0mg/L。
[0027]實施例2:
在南寧9月份按照本發(fā)明的方法進行生根培養(yǎng)，具體步驟如下: (1)繼代芽壯苗培養(yǎng):采用常規(guī)繼代培養(yǎng)基進行繼代芽的增殖培養(yǎng);當繼代芽單芽長度達到1.0cm時，增加光照促使單芽老練；
(2)生根培養(yǎng)基配制:培養(yǎng)基配方采用4/5改良WPM培養(yǎng)基附加IBA0.7mg/L、ABT6號
0.2mg/L、鹿糖 15000mg/L、瓊脂 6.0g/L。
[0028]在配制培養(yǎng)基專用實驗室內(nèi)，將實驗臺面及周圍操作空間，用75%酒精噴霧消毒；分裝過程中的其他用