相關(guān)申請的交叉引用本申請要求以下美國臨時申請?zhí)柕臋?quán)益：2013年9月25日提交的61/882,211、2013年9月25日提交的61/882,214、2013年9月25日提交的61/882,219、2013年9月25日提交的61/882,220、2013年9月25日提交的61/882,225、2013年9月25日提交的61/882,229、2013年9月25日提交的61/882,232、2013年9月25日提交的61/882,234、2013年9月25日提交的61/882,235、2013年9月25日提交的61/882,240、2013年9月25日提交的61/882,129、2013年9月25日提交的61/882,243、2013年9月25日提交的61/882,246、2013年9月25日提交的61/882,250、2013年9月25日提交的61/882,254、2013年9月25日提交的61/882,260、2013年9月25日提交的61/882,264、2013年9月25日提交的61/882,267、2013年9月25日提交的61/882,271、2013年9月25日提交的61/882,274、2013年9月25日提交的61/882,180、2013年9月25日提交的61/882,189、2013年9月25日提交的61/882,198、2013年9月25日提交的61/882,212、2013年9月25日提交的61/882,222、2013年9月25日提交的61/882,300、2013年9月25日提交的61/882,295和2013年9月25日提交的61/882,305；所述美國臨時申請的整個公開內(nèi)容據(jù)此出于所有目的以引用的方式整體并入本文。背景膳食性蛋白質(zhì)是為人類健康和生長所必需的營養(yǎng)物。世界衛(wèi)生組織建議當處于能量平衡和重量穩(wěn)定時，膳食性蛋白質(zhì)應(yīng)占能量攝取的約10至15％。各個國家的平均每日蛋白質(zhì)攝取量指示這些推薦與全世界消耗的蛋白質(zhì)的量一致。當在能量平衡下消耗時，平均20至30％的能量來自蛋白質(zhì)的餐食代表高蛋白質(zhì)膳食。身體不能合成為健康和生長所必需的某些氨基酸，并且代之以必須從食物獲得它們。稱為“必需氨基酸”的這些氨基酸是組氨酸(h)、異亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、賴氨酸(k)、甲硫氨酸(m)、苯丙氨酸(f)、蘇氨酸(t)、色氨酸(w)和纈氨酸(v)。提供所有必需氨基酸的膳食性蛋白質(zhì)來源被稱為“高品質(zhì)”蛋白質(zhì)。諸如肉、魚、家禽、蛋和乳制品的動物性食物通常被認為是提供必需氨基酸的良好平衡的高品質(zhì)蛋白質(zhì)來源。酪蛋白(casein)(一種通常見于哺乳動物奶中，占牛奶中的蛋白質(zhì)的80％的蛋白質(zhì))和乳清(在奶已凝固和應(yīng)變之后剩余的呈液體形式的蛋白質(zhì))是高品質(zhì)膳食性蛋白質(zhì)的主要來源。不提供必需氨基酸的良好平衡的食物被稱為“低品質(zhì)”蛋白質(zhì)來源。大多數(shù)水果和蔬菜是蛋白質(zhì)的不良來源。包括菜豆、豌豆、小扁豆、堅果和谷物(諸如小麥)的一些植物性食物是蛋白質(zhì)的較好來源，但可具有過敏原性問題。大豆，作為一種由黃豆制造的植物性蛋白質(zhì)，被一些人視為高品質(zhì)蛋白質(zhì)。關(guān)于重量減輕的高蛋白質(zhì)膳食研究已顯示蛋白質(zhì)積極影響能量消耗和瘦性身體質(zhì)量。進一步研究已顯示就含有的能量的至少5％來自蛋白質(zhì)的膳食而言，過度進食會產(chǎn)生顯著較小重量增加，并且高蛋白質(zhì)膳食會降低能量攝取。通常見于食物中的蛋白質(zhì)未必以高效方式提供滿足諸如人的哺乳動物的氨基酸需求的氨基酸組成。結(jié)果是為達到各必需氨基酸的最小需求，在膳食中消耗的總蛋白質(zhì)的量必須大于如果膳食性蛋白質(zhì)的品質(zhì)較高所將需要的量。通過提高膳食中的蛋白質(zhì)的品質(zhì)，有可能相較于包括品質(zhì)較低的蛋白質(zhì)的膳食，降低必須消耗的蛋白質(zhì)的總量。在傳統(tǒng)上，合乎需要的氨基酸混合物(諸如包含必需氨基酸的混合物)已通過水解必需氨基酸的水平相對較高的蛋白質(zhì)(諸如乳清蛋白質(zhì))和/或通過以任選也包括諸如乳清的水解蛋白質(zhì)的混合物形式組合游離氨基酸來提供。這個類型的混合物可具有苦味(即不合需要的口感)和不良可溶性，并且可被視為不適于某些用途或不合乎某些用途的需要。因此，所述混合物有時包括調(diào)味劑以掩蔽游離氨基酸和/或水解蛋白質(zhì)的味道。在一些情況下，發(fā)現(xiàn)其中一定比例的氨基酸內(nèi)含物由多肽或蛋白質(zhì)提供的組合物具有的味道好于總氨基酸的較高比例以游離氨基酸和/或某些水解蛋白質(zhì)形式提供的組合物。然而，所述組合物的可用性已受到限制，因為營養(yǎng)性制劑在傳統(tǒng)上已由從天然食物產(chǎn)品分離的蛋白質(zhì)(諸如從奶分離的乳清或從大豆分離的大豆蛋白質(zhì))制得。那些蛋白質(zhì)的氨基酸分布未必滿足哺乳動物的氨基酸需求。此外，商品蛋白質(zhì)通常由蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)水解物的混合物組成，所述混合物在它們的蛋白質(zhì)組成方面可變化，由此導(dǎo)致關(guān)于它們的營養(yǎng)價值的不可預(yù)測性。此外，所述高品質(zhì)蛋白質(zhì)的來源的數(shù)目有限已意味著僅某些氨基酸組合可以蛋白質(zhì)形式大規(guī)模用于攝取。為供給高品質(zhì)動物性蛋白質(zhì)來源(諸如酪蛋白和乳清、蛋以及肉)以及植物性蛋白質(zhì)(諸如大豆)所需的農(nóng)業(yè)方法也需要大量能量輸入，并且具有潛在有害環(huán)境影響。因此，在某些情況下，將適用的是具有供給供哺乳動物消耗的蛋白質(zhì)的替代性來源和方法?？稍鰪姞I養(yǎng)性蛋白質(zhì)的效用的一個特征是它的溶解度。溶解度較高的營養(yǎng)性蛋白質(zhì)可展現(xiàn)合乎需要的特征，諸如增加的穩(wěn)定性、抗聚集性和合乎需要的味道分布。舉例來說，展現(xiàn)溶解度增強的營養(yǎng)性蛋白質(zhì)可被配制成呈相對較低體積的溶液形式的包括高濃度營養(yǎng)性蛋白質(zhì)的飲料或液體制劑，由此遞送每單位體積較大劑量的蛋白質(zhì)營養(yǎng)?？扇苄誀I養(yǎng)性蛋白質(zhì)可適用于其中使用者(例如運動員)想要在身體活動之前、期間或之后攝取營養(yǎng)性蛋白質(zhì)的運動飲料或恢復(fù)飲料中。展現(xiàn)溶解度增強的營養(yǎng)性蛋白質(zhì)也可特別適用于其中受試者(例如患者或年長人士)需要蛋白質(zhì)營養(yǎng)，但不能消耗固體食物或大體積的液體的臨床環(huán)境中。發(fā)明概述在一個方面，本發(fā)明提供預(yù)防或降低人受試者的肌肉質(zhì)量和/或肌肉功能的損失的方法，其包括以下步驟：i)鑒定罹患與肌肉損耗相關(guān)的疾病、病癥或病狀或處于所述疾病、病癥或病狀的風(fēng)險下的人受試者，以及ii)以足以預(yù)防或降低肌肉質(zhì)量和/或肌肉功能的損失的量向所述人受試者施用營養(yǎng)性制劑，其中所述營養(yǎng)性制劑包括分離的營養(yǎng)性多肽，所述分離的營養(yǎng)性多肽包括在至少約50個氨基酸上與本文提供的多肽序列至少約90％同一的氨基酸序列；其中所述制劑包括至少1.0g所述營養(yǎng)性多肽；其中所述制劑以液體、半液體或凝膠形式以不大于約500ml的體積或以固體或半固體形式以不大于約200g的總質(zhì)量存在；并且其中所述制劑大致上不含非可食產(chǎn)品。在一個實施方案中，人受試者罹患肌肉損耗疾病、病癥或病狀，并且已接受一個或多個劑量的藥物組合物，其中施用所述藥物組合物使肌肉質(zhì)量和/或肌肉功能的損失的風(fēng)險增加。在一個實施方案中，人受試者罹患肌肉損耗疾病、病癥或病狀，并且已接受一個或多個劑量的藥物組合物，其中i)所述疾病、病癥或病狀或ii)施用所述藥物組合物或i)與ii)兩者使肌肉質(zhì)量和/或肌肉功能的損失的風(fēng)險增加。在另一方面，本發(fā)明提供治療有需要的人受試者的肌肉損耗疾病、病癥或病狀的方法，其包括以足以治療所述疾病、病癥或病狀的量向所述人受試者施用營養(yǎng)性制劑的步驟，其中所述營養(yǎng)性制劑包括分離的營養(yǎng)性多肽，所述分離的營養(yǎng)性多肽包括在至少約50個氨基酸上與本文提供的多肽序列至少約90％同一的氨基酸序列；其中所述制劑包括至少1.0g所述營養(yǎng)性多肽。在一個實施方案中，按照足以在不存在由受試者消耗農(nóng)業(yè)源性食物產(chǎn)品下向人受試者提供實質(zhì)性蛋白質(zhì)營養(yǎng)的劑量時程施用制劑。在另一方面，本發(fā)明提供降低人受試者顯現(xiàn)特征在于蛋白質(zhì)營養(yǎng)失調(diào)或因蛋白質(zhì)營養(yǎng)失調(diào)而加劇的肌肉損耗疾病、病癥或病狀的風(fēng)險的方法，其包括以下步驟：(i)將所述人受試者鑒定為處于顯現(xiàn)所述疾病、病癥或病狀的風(fēng)險下；以及(ii)以一個或多個劑量施用包括分離的營養(yǎng)性多肽的營養(yǎng)性制劑，所述分離的營養(yǎng)性多肽包括在至少約50個氨基酸上與本文提供的多肽序列至少約90％同一的氨基酸序列；其中所述制劑包括至少1.0g所述營養(yǎng)性多肽。在一個實施方案中，人受試者處于顯現(xiàn)營養(yǎng)不良或蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良的風(fēng)險下。在一個實施方案中，人受試者展現(xiàn)肌肉減少癥和/或惡病質(zhì)。在一個實施方案中，人受試者患有炎癥性反應(yīng)或自體免疫病癥。在一個實施方案中，人受試者患有癌癥、慢性阻塞性肺病、肝衰竭、慢性腎病、充血性心臟衰竭、多發(fā)性硬化癥、慢性胰腺炎或線粒體疾病。在一個實施方案中，人受試者患有感染性疾病。在一個實施方案中，人受試者已經(jīng)受手術(shù)程序或已遭受創(chuàng)傷性損傷。在一個實施方案中，營養(yǎng)性制劑與運動方案聯(lián)合施用。在一個實施方案中，營養(yǎng)性制劑作為用以施用藥物制劑和/或手術(shù)程序的輔助物來施用。在一個實施方案中，受試者在手術(shù)程序之后被固定或活動性受損。在一個實施方案中，營養(yǎng)性制劑作為用以施用藥物組合物的輔助物來施用。在一個實施方案中，人受試者患有骨質(zhì)疏松或處于顯現(xiàn)骨質(zhì)疏松的風(fēng)險下。在另一方面，本發(fā)明提供增加罹患肌肉損耗疾病的人受試者的肌肉合成代謝的方法，其包括以一個或多個劑量向人受試者施用包括分離的營養(yǎng)性多肽的營養(yǎng)性制劑，所述分離的營養(yǎng)性多肽包括在至少約50個氨基酸上與本文提供的多肽序列至少約90％同一的氨基酸序列；其中所述制劑包括至少1.0g所述營養(yǎng)性多肽，其中所述營養(yǎng)性制劑在足以在其施用之后增加所述受試者的肌肉合成代謝的頻率下向所述人受試者施用。在另一方面，本發(fā)明提供配制用于治療人受試者的營養(yǎng)性產(chǎn)品的方法，其包括以下步驟：向罹患肌肉損耗疾病、病癥或病狀或處于肌肉損耗疾病、病癥或病狀的風(fēng)險下的人受試者提供包括分離的營養(yǎng)性多肽的營養(yǎng)性組合物，所述分離的營養(yǎng)性多肽包括在至少約50個氨基酸上與本文提供的多肽序列至少約90％同一的氨基酸序列；以及與可接受的賦形劑一起配制所述營養(yǎng)性多肽，其中所述分離的營養(yǎng)性多肽在ph7下具有至少12.5g/l的水溶解度，并且其中所述分離的營養(yǎng)性多肽具有小于30分鐘的模擬胃消化半衰期。在一個實施方案中，方法進一步包括組合營養(yǎng)性組合物與促味劑、營養(yǎng)性碳水化合物和營養(yǎng)性脂質(zhì)中的至少一種，其中產(chǎn)品以液體、半液體或凝膠形式以不大于約500ml的體積或以固體或半固體形式以不大于約200g的總質(zhì)量存在。在一個實施方案中，產(chǎn)品大致上不含非可食產(chǎn)品。在另一方面，本發(fā)明提供用于選擇營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列的方法，其中所述營養(yǎng)性多肽適用于治療罹患肌肉損耗疾病、病癥或病狀或處于肌肉損耗疾病、病癥或病狀的風(fēng)險下的人受試者，所述方法包括i)提供包括多種氨基酸序列的氨基酸序列文庫，ii)在所述文庫中鑒定一種或多種包括至少一種目標氨基酸的氨基酸序列，以及iii)選擇所述一種或多種鑒定的氨基酸序列，由此選擇營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供用于選擇營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列的方法，其中所述營養(yǎng)性多肽適用于治療罹患肌肉損耗疾病、病癥或病狀或處于肌肉損耗疾病、病癥或病狀的風(fēng)險下的人受試者，所述方法包括i)提供包括多種氨基酸序列的氨基酸序列文庫，ii)在所述文庫中鑒定一種或多種包括至少一種目標氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率大于或等于所選比率的氨基酸序列，以及iii)選擇所述一種或多種鑒定的氨基酸序列，由此選擇營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供用于選擇營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列的方法，其中所述營養(yǎng)性多肽適用于治療罹患肌肉損耗疾病、病癥或病狀或處于肌肉損耗疾病、病癥或病狀的風(fēng)險下的人受試者，所述方法包括i)提供包括多種氨基酸序列的氨基酸序列文庫，ii)在所述文庫中鑒定一種或多種包括至少一種目標氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率小于或等于所選比率的氨基酸序列，以及iii)選擇所述一種或多種鑒定的氨基酸序列，由此選擇營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列。在另一方面，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防人受試者的肌肉損耗疾病、病癥或病狀的營養(yǎng)性制劑，其包括分離的營養(yǎng)性多肽，所述分離的營養(yǎng)性多肽包括在至少約50個氨基酸上與本文提供的多肽序列至少約90％同一的氨基酸序列；其中所述營養(yǎng)性多肽以足以向蛋白質(zhì)吸收能力降低的人受試者提供營養(yǎng)性益處的量存在。在一個實施方案中，多肽序列包括必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率至少34％，并且其中多肽序列是營養(yǎng)全面的。在一個實施方案中，存在于營養(yǎng)性多肽中的必需氨基酸是實質(zhì)上生物可用的。在一個實施方案中，分離的營養(yǎng)性多肽在ph7下具有至少12.5g/l的水溶解度。在一個實施方案中，分離的營養(yǎng)性多肽具有小于30分鐘的模擬胃消化半衰期。在一個實施方案中，營養(yǎng)性多肽被配制在藥學(xué)上可接受的載體中。在一個實施方案中，營養(yǎng)性多肽被配制在食物或食物成分中或被配制成食物或食物成分。在一個實施方案中，營養(yǎng)性多肽被配制在飲料或飲料成分中或被配制成飲料或飲料成分。在一個實施方案中，氨基酸序列編碼具有主要活性的酶，并且其中營養(yǎng)性多肽實質(zhì)上缺乏所述主要活性。在一個實施方案中，制劑以液體、半液體或凝膠形式以不大于約500ml的體積或以固體或半固體形式以不大于約200g的總質(zhì)量存在。在一個實施方案中，營養(yǎng)性多肽包括與長度是至少50個氨基酸的可食用物種多肽或其片段至少約90％同一的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在至少25個氨基酸上與已知過敏原具有小于約50％同一性。在一個實施方案中，制劑進一步包括選自以下的組分：促味劑、蛋白質(zhì)混合物、多肽、肽、游離氨基酸、碳水化合物、脂質(zhì)、礦物質(zhì)或礦物質(zhì)來源、維生素、補充劑、生物體、藥物和賦形劑。在一個實施方案中，人受試者罹患胃腸蛋白質(zhì)吸收不良疾病、病癥或病狀。在一個實施方案中，氨基酸序列含有的必需氨基酸的密度約等于或大于存在于全長參照營養(yǎng)性多肽或含有參照多肽的混合物中的必需鏈氨基酸的密度。在一個實施方案中，氨基酸序列含有的至少一種選自由亮氨酸、精氨酸和谷氨酰胺組成的組的氨基酸的密度約等于或大于存在于全長參照營養(yǎng)性多肽或含有參照多肽的混合物中的所選氨基酸的密度。在另一方面，本發(fā)明提供包括至少一種營養(yǎng)性多肽的制劑，所述營養(yǎng)性多肽包括與能夠從微生物分泌的可食用物種多肽至少約99％同一的氨基酸序列，其中所述營養(yǎng)性多肽以足以提供等于或大于參照每日蛋白質(zhì)攝取值的至少約2％的營養(yǎng)性益處的量存在于制劑中。在另一方面，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防人受試者的肌肉損耗疾病、病癥或病狀的營養(yǎng)性制劑，包括營養(yǎng)性氨基酸組合物，所述營養(yǎng)性氨基酸組合物包括多種游離氨基酸，所述多種游離氨基酸包括的氨基酸比率與本文提供的多肽序列的氨基酸比率至少約90％同一，其中所述營養(yǎng)性氨基酸組合物是營養(yǎng)全面的；其中所述營養(yǎng)性氨基酸組合物以足以向蛋白質(zhì)吸收能力降低的人受試者提供營養(yǎng)性益處的量存在。在一個實施方案中，制劑以液體、半液體或凝膠形式以不大于約500ml的體積或以固體或半固體形式以不大于約200g的總質(zhì)量存在。附圖簡述本發(fā)明的這些和其它特征、方面和優(yōu)勢將關(guān)于以下描述和附圖而變得被更充分理解，其中：圖1是說明對通過imac進行的seqid-00105純化的sds-page分析的圖像。圖2是說明被預(yù)測會結(jié)合陰離子或陽離子交換樹脂的營養(yǎng)性多肽的隨ph而變的每個氨基酸凈電荷的圖。(1)seqid-00105、(2)seqid-00008、(3)seqid-00009、(4)seqid-00475、(5)seqid-00472、(6)seqid-00640、(7)seqid-00019。圖3是說明示例性營養(yǎng)性多肽的在一定ph范圍內(nèi)的每個氨基酸總電荷的圖。(1)seqid-00475、(2)seqid-00009、(3)seqid-00478、(4)seqid-00433、(5)seqid-00472。圖4是說明seqid-00009的純度隨硫酸銨濃度而變的圖。圖5是說明sds-page分析的圖像，所述分析說明相較于天然信號肽，在新信號肽下，seqid-00409(左)和seqid-00420(右)的分泌。圖6是說明在刺激之后在上清液中檢測的glp-1(7-36)的上清液濃度的圖，誤差棒是技術(shù)平行測定的標準偏差。圖7是說明在媒介物、seqid-00105、精氨酸和seqid-00338的ogtt期間隨時間的平均血糖值的圖。顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖8是說明在急性seqid-00105、精氨酸和seqid-00338給藥之后，從0至120分鐘(左)以及從0至60分鐘(右)積分的血糖的曲線下面積的圖。圖9是說明每個處理組n＝6只大鼠隨時間的平均血漿胰島素濃度的圖。誤差棒顯示平均值標準誤差。圖10是說明所有處理組的在0-240和0-60分鐘之間積分的血漿胰島素曲線下面積的圖。誤差棒顯示平均值標準誤差。圖11是說明每個處理組n＝6只大鼠隨時間的平均血漿glp-1濃度的圖。此處顯示的誤差棒對應(yīng)于平均值標準誤差。圖12是說明隨時間的平均血糖值的圖。顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖13是說明各治療組在葡萄糖激發(fā)時間(0分鐘)與60分鐘之間以及在時間0與120分鐘之間的積分auc的圖。顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖14是說明在媒介物和seqid-00105的情況下每個治療組n＝6只大鼠以及在seqid-00338的情況下每個治療組n＝5只大鼠在實驗過程中的平均血漿胰島素濃度的圖。顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖15是說明媒介物、seqid-00105和seqid-00338在0與90分鐘之間以及在0與60分鐘之間的積分曲線下面積的圖。此處顯示的誤差棒對應(yīng)于平均值標準誤差。圖16是說明對于媒介物和seqid-00105而言每個治療組n＝6只大鼠以及對于seqid-00338而言n＝5只大鼠在實驗過程中的平均血漿glp-1濃度的圖。此處顯示的誤差棒對應(yīng)于平均值標準誤差。圖17是說明各治療組的對于0-90和0-60分鐘積分的glp-1(7-36)曲線下面積的圖。此處顯示的誤差棒對應(yīng)于平均值標準誤差。圖18是說明在媒介物、seqid-00105、阿格列汀和組合的ogtt期間的每個治療組n＝6只大鼠的平均血糖值的圖。此處顯示的誤差棒對應(yīng)于平均值標準誤差。圖19是說明媒介物和在3種不同劑量下施用的seqid-00105的隨時間的alphalisa血漿胰島素的圖。此處顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖20是說明媒介物以及seqid-00426、seqid-00338、seqid-00341的隨時間的alphalisa血漿胰島素的圖。此處顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖21是說明seqid-00105在3種劑量下在0與240分鐘之間以及在0與60分鐘之間的血漿胰島素濃度的積分曲線下面積的圖。此處顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖22是說明媒介物、seqid-00426、seqid-00338和seqid-00341的在0與240分鐘之間以及在0與60分鐘之間的血漿胰島素濃度的積分曲線下面積的圖。此處顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖23是說明seqid-00423、seqid-00587、seqid-00105的隨時間的alphalisa血漿胰島素的圖。此處顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖24是說明媒介物、seqid-00424、seqid-00425和seqid-00429的隨時間的alphalisa血漿胰島素的圖。此處顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖25是說明媒介物、seqid-00423、seqid-00587和seqid-00105的在0與240分鐘之間以及在0與60分鐘之間的血漿胰島素濃度的積分曲線下面積的圖。此處顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖26是說明媒介物、seqid-00424、seqid-00425和seqid-00429的在0與240分鐘之間以及在0與60分鐘之間的血漿胰島素濃度的積分曲線下面積的圖。此處顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖27是說明媒介物以及seqid-00105、seqid-00240和seqid-00559的隨時間的elisa血漿胰島素的圖。此處顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖28是說明媒介物、seqid-00105、seqid-00240和seqid-00559的在0與240分鐘之間以及在0與60分鐘之間的血漿胰島素濃度的積分曲線下面積的圖。此處顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖29是說明媒介物和seqid-00240(分別n＝4和n＝5只大鼠)的在4小時時間過程中的glp-2濃度的圖。顯示的誤差棒是平均值標準誤差。圖30是說明在第一小時和全部4小時中的積分glp-2曲線下面積的圖。顯示的誤差棒是95％置信區(qū)間。圖31是說明所有受試者隨時間對seqid-00105的平均血漿胰島素應(yīng)答的圖。圖32是說明超過基線的對seqid-00105的平均血漿胰島素倍數(shù)應(yīng)答的圖。圖33是說明所有受試者隨時間對seqid-00426的平均血漿胰島素應(yīng)答的圖。圖34是說明超過基線的對seqid-00426的平均血漿胰島素倍數(shù)應(yīng)答的圖。圖35是說明所有患者對seqid-00426的平均總胃抑制性多肽(gip)應(yīng)答的圖。圖36是說明所有患者對seqid-00426的胃抑制性多肽(gip)倍數(shù)應(yīng)答的圖。圖37是說明在不同亮氨酸濃度下測量的alphascreen信號(y軸)的圖。顯示的誤差棒是平行測定的標準偏差。圖38是說明原代rskmc中最低氨基酸培養(yǎng)基中的亮氨酸劑量應(yīng)答的圖。顯示的誤差棒是標準偏差。圖39是說明分離的比目魚肌中rps6磷酸化的體外亮氨酸劑量應(yīng)答的圖。顯示的誤差棒是標準偏差。圖40是說明分離的腓腸肌中rps6磷酸化的體外亮氨酸劑量應(yīng)答的圖。顯示的誤差棒是標準偏差。圖41是說明分離的趾長伸肌中rps6磷酸化的體外亮氨酸劑量應(yīng)答的圖。顯示的誤差棒是標準偏差。圖42是說明leu/tyr/arg對rps6磷酸化的組合活性的圖。顯示的誤差棒是標準偏差。圖43是說明在leu/tyr背景中精氨酸刺激rps6的圖。顯示的誤差棒是標準偏差。圖44是說明在arg/tyr背景中亮氨酸刺激rps6的圖。顯示的誤差棒是標準偏差。圖45是說明在arg/leu背景中酪氨酸刺激rps6的圖。顯示的誤差棒是標準偏差。圖46是說明在胰酶消化seqid-00105期間，游離leu釋放的時間過程的圖。圖47是說明seqid-00105在4c(閉合圓圈)和25c(空心圓圈)下以及乳清在4c(閉合方塊)和25c(空心方塊)下在一定范圍的蛋白質(zhì)濃度內(nèi)以厘泊計量的粘度的圖。圖48是說明seqid-00105的初始和最終(在加熱至90℃，接著冷卻至20℃之后)蛋白質(zhì)圓二色性光譜(左)以及那個seqid-00105在給定波長下在溫度范圍內(nèi)的橢圓率變化(右)的圖。圖49是說明對含有甘露糖的聚糖的蛋白質(zhì)印跡分析的圖像。a)coomassie染色凝膠。b)gna印跡膜。在兩個圖版中，泳道如下：1)預(yù)染色蛋白質(zhì)階梯，2)來自黑曲霉的seqid-00363(5μg)，3)來自用編碼seqid-00363的表達載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的全細胞提取物(5μg)，4)gna陽性對照羧肽酶(5μg)，5)來自用編碼seqid-00363的表達載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的可溶性溶解產(chǎn)物(5μg)。圖50是說明對neu5gc的蛋白質(zhì)印跡分析的圖像。a)coomassie染色凝膠。b)抗neu5gc探測膜。在兩個圖版中，泳道如下：1和10)預(yù)染色蛋白質(zhì)階梯(newenglandbiolab)，2和11)牛肉提取物(30μg)，3)豬肉提取物(30μg)，4)鹿肉提取物(30μg)，5)羊羔肉提取物(30μg)，6)火雞肉提取物(30μg)，7)雞肉提取物(30μg)，8)鱈魚提取物(30μg)，9)蛋白質(zhì)混合物1(10μg)，12-15)在12)大腸桿菌(imac純化的溶解產(chǎn)物)、13)枯草芽孢桿菌(上清液)、14)枯草芽孢桿菌(溶解產(chǎn)物)、15)枯草芽孢桿菌(imac純化的溶解產(chǎn)物)中表達的168種營養(yǎng)性多肽文庫(30μg)，16-20)在16)枯草芽孢桿菌(ph951grac溶解產(chǎn)物)、17)大腸桿菌(rosetta可溶性溶解產(chǎn)物)、18)大腸桿菌(rosetta全細胞)、19)大腸桿菌(gamib溶解產(chǎn)物)和20)大腸桿菌(gami2溶解產(chǎn)物)中表達的cdna文庫(30μg)。圖51是說明對木糖和海藻糖的蛋白質(zhì)印跡分析的圖像。a)coomassie染色凝膠。b)抗neu5gc探測膜。在蛋白質(zhì)印跡分析中，蛋白質(zhì)的樣品從植物和真菌提取或由大腸桿菌和黑曲霉重組表達。含有木糖和含有海藻糖的聚糖于a)coomassie染色凝膠，b)抗neu5gc印跡膜中。在兩個圖版中，泳道如下：1和11)預(yù)染色蛋白質(zhì)階梯(newenglandbiolab)，2)酵母提取物(30μg)，3)亞麻籽提取物(30μg)，4)雞肉提取物(30μg)，5)玉米提取物(30μg)，6)馬鈴薯提取物(30μg)，7)蘑菇提取物(30μg)，8)蛋白質(zhì)混合物2(30μg)，9)hrp(2μg)，10)胎球蛋白(2μg)，12)大豆提取物(30μg)，13)稻米提取物(30μg)，14)花椰菜提取物(30μg)，15)番茄提取物(30μg)，16)藍莓提取物(30μg)，17)葡萄提取物(30μg)，18)蛋白質(zhì)混合物2(30μg)，19)hrp(2μg)，20)胎球蛋白(2μg)。圖52是一系列圖，其說明在表e33a中所列的劑量下口服施用指示的營養(yǎng)性多肽之后，在4小時內(nèi)從大鼠(n＝2-4)收集的血液樣品中測量的血漿氨基酸濃度的平均曲線下面積(auc)(±sd)(μm·h)的變化。bcaa：支鏈氨基酸，eaa：必需氨基酸。圖53是一系列圖，其說明在2.85g/kg下口服施用seqid-00105的大鼠(n＝4)的平均血漿氨基酸濃度(±sd)-時間曲線。bcaa：支鏈氨基酸，eaa：必需氨基酸。圖54是一系列圖，其說明seqid-00105的劑量-應(yīng)答效應(yīng)。在表e33a中所列的劑量下口服施用seqid-00105之后，在4小時內(nèi)從大鼠(n＝4)收集的血液樣品中測量的(左)平均血漿leu濃度(±sd)-時間曲線(右)血漿氨基酸濃度的平均曲線下面積(auc)(±sd)(μm·h)。圖55是一系列圖，其說明在seqid-00363的天然和修飾形式的大鼠藥物動力學(xué)研究期間的血漿氨基酸濃度。在口服施用鹽水(圓圈(●)，實線)(n＝4)、天然seqid-00363(方塊(■)，實線)(n＝4)、去糖基化seqid-00363(空心圓圈(○)，虛線)(n＝2)和水解的seqid-00363(空心方塊(□)，虛線)(n＝4)之后，必需氨基酸(eaa)(a)、亮氨酸(b)、絲氨酸(c)和蘇氨酸(d)的血漿氨基酸分布。數(shù)據(jù)代表如上指示的n＝2-4只大鼠的平均值±平均值標準偏差。圖56是一系列圖，其說明wpi、seqid-00105和seqid-363的平均fsr的變化。圖57是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00105的測量氨基酸的人血漿時間過程。圖58是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00105的測量氨基酸的人血漿時間過程。圖59是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00105的測量氨基酸的人血漿時間過程。圖60是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00105的測量氨基酸以及各聚集組，即必需氨基酸(eaa)、支鏈氨基酸(bcaa)和總氨基酸(taa)的人血漿時間過程。圖61是說明關(guān)于wpi和seqid-00105的測量氨基酸的積分曲線下面積(auc)的圖。圖62是說明關(guān)于wpi和seqid-00105的測量氨基酸的積分曲線下面積(auc)的圖。圖63是說明關(guān)于wpi和seqid-00105的各聚集組，即必需氨基酸(eaa)、支鏈氨基酸(bcaa)和總氨基酸(taa)的積分曲線下面積(auc)的圖。圖64是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00105的測量氨基酸的人血漿時間過程。圖65是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00105的測量氨基酸的人血漿時間過程。圖66是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00105的測量氨基酸的人血漿時間過程。圖67是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00105的測量氨基酸以及各聚集組，即必需氨基酸(eaa)、支鏈氨基酸(bcaa)和總氨基酸(taa)的人血漿時間過程。圖68是說明關(guān)于wpi和seqid-00105的測量氨基酸的積分曲線下面積(auc)的圖。圖69是說明關(guān)于wpi和seqid-00105的測量氨基酸的積分曲線下面積(auc)的圖。圖70是說明關(guān)于wpi和seqid-00105的各聚集組，即必需氨基酸(eaa)、支鏈氨基酸(bcaa)和總氨基酸(taa)的積分曲線下面積(auc)的圖。圖71是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00363的測量氨基酸的人血漿時間過程。圖72是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00363的測量氨基酸的人血漿時間過程。圖73是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00363的測量氨基酸的人血漿時間過程。圖74是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-363的測量氨基酸以及各聚集組，即必需氨基酸(eaa)、支鏈氨基酸(bcaa)和總氨基酸(taa)的人血漿時間過程。圖75是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00426的測量氨基酸的人血漿時間過程。圖76是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00426的測量氨基酸的人血漿時間過程。圖77是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00426的測量氨基酸的人血漿時間過程。圖78是一系列圖，其說明關(guān)于wpi和seqid-00426的測量氨基酸以及各聚集組，即必需氨基酸(eaa)、支鏈氨基酸(bcaa)和總氨基酸(taa)的人血漿時間過程。詳細描述除非另外規(guī)定，否則如以下闡述來定義用于權(quán)利要求和說明書中的術(shù)語。必須注意的是，除非上下文另外明確規(guī)定，否則如說明書和隨附權(quán)利要求中所用，單數(shù)形式“一(a,an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)個指示物。定義?！稗r(nóng)業(yè)源性食物產(chǎn)品”是由土壤栽培或飼養(yǎng)動物產(chǎn)生的食物產(chǎn)品。術(shù)語“改善”是指在治療疾病狀態(tài)方面的任何治療有益結(jié)果，例如包括其防治、減輕嚴重性或進展、緩解或治愈。如本文所用，術(shù)語“自養(yǎng)性”是指生物體使用來自光(通過光合作用)或無機化學(xué)反應(yīng)(化學(xué)合成)的能量從簡單無機分子產(chǎn)生復(fù)雜有機化合物(諸如碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì))。如本文所用，“身體質(zhì)量指數(shù)”或“bmi”或“克托萊指數(shù)(queteletindex)”是以千克計的受試者的重量除以以米計的受試者的身高的平方(kg/m2)。對于成人，常使用bmi來評估個體的體重偏離具有他的或她的身高的人士的正?；蚝虾跣枰w重的程度。重量過度或不足可部分地用身體脂肪來解釋，但諸如肌肉發(fā)達性的其它因素也顯著影響bmi。世界衛(wèi)生組織將bmi小于18.5視為重量不足，并且可指示營養(yǎng)不良、進食病癥或其它健康問題，而bmi大于25被視為超重，并且高于30被視為肥胖。(世界衛(wèi)生組織bmi分類)。如本文所用，“支鏈氨基酸”是選自亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的氨基酸。如本文所用，“惡病質(zhì)”是指導(dǎo)致肌肉損耗和重量減輕的多層面臨床綜合征。它是一種復(fù)雜病狀，其中蛋白質(zhì)分解代謝超過蛋白質(zhì)合成代謝，此使得肌肉損耗成為所述病狀的主要特征。除在蛋白質(zhì)代謝方面的代謝紊亂之外，它的特征也在于厭食和炎癥。這些紊亂加上蛋白質(zhì)代謝受損在不同程度上對營養(yǎng)療法起應(yīng)答。如本文所用，“卡路里控制”和“卡路里限制”是指相對于受試者的先前卡路里攝取或相對于適當卡路里攝取標準，降低受試者從食物產(chǎn)品攝取卡路里的過程。通常，術(shù)語“癌癥”和“癌性”是指或描述哺乳動物的特征通常在于細胞生長不受調(diào)控的生理病狀。更具體來說，使用任何一種或多種酪氨酸激酶抑制劑、阻斷受體或它們的配體的其它藥物或其變體以及與本文提供的方法關(guān)聯(lián)加以治療的癌癥包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤、白血病、間皮瘤、鱗狀細胞癌、肺癌(包括小細胞肺癌和非小細胞肺癌(其包括大細胞癌、肺腺癌和肺鱗狀癌))、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastric/stomachcancer)(包括胃腸癌和胃腸基質(zhì)癌)、胰腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney/renalcancer)、前列腺癌、子宮頸癌、陰門癌、甲狀腺癌、頭頸部癌、黑素瘤、淺表擴散性黑素瘤、惡性小痣黑素瘤、肢端雀斑性黑素瘤、結(jié)節(jié)性黑素瘤、t細胞淋巴瘤、b細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-hodgkin'slymphoma，nhl)；小淋巴細胞性(sl)nhl；中級/濾泡性nhl；中級彌漫性nhl；高級成免疫細胞性nhl；高級成淋巴細胞性nhl；高級小非分裂細胞nhl；巨大腫塊疾病nhl；套膜細胞淋巴瘤；aids相關(guān)的淋巴瘤；和瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(waldenstrom'smacroglobulinemia))；慢性淋巴細胞性白血病(cll)；急性骨髓性白血病(aml)；慢性骨髓性白血病(cml)；急性成淋巴細胞性白血病(all)；毛細胞白血??；慢性成髓細胞性白血??；或移植后淋巴組織增生性病癥(ptld)以及與瘢痣病、水腫(諸如與腦腫瘤相關(guān)的水腫)和梅格斯綜合征(meigs'syndrome)相關(guān)的異常血管增生?！翱墒钞a(chǎn)品”包括可食用產(chǎn)品，而“非可食產(chǎn)品”通常是不可食用產(chǎn)品或含有不可食用產(chǎn)品。就“大致上不含非可食產(chǎn)品”來說，其意指組合物不具有足以致使所述組合物不可食用、危險或另外不適于由它的預(yù)期消耗者消耗的量或水平的非可食產(chǎn)品?；蛘?，多肽可大致上不含非可食產(chǎn)品，此意味著所述多肽不含有或具有與此相關(guān)的足以致使含有所述多肽的組合物不可由它的預(yù)期消耗者食用或?qū)λ念A(yù)期消耗者不安全或有害的量或水平的非可食產(chǎn)品。在優(yōu)選實施方案中，大致上不含非可食產(chǎn)品的組合物可以營養(yǎng)量由預(yù)期消耗者消耗，所述消耗者未遭受由所述消耗引起的有害事件或不處于遭受所述有害事件的風(fēng)險增加下。舉例來說，各種水平的鉛和其它金屬被充分記載為當存在于食物，特別是含有在被鉛和/或其它金屬污染的土壤中生長的農(nóng)業(yè)源性產(chǎn)品的食物中時對人具有重大風(fēng)險(包括毒性)。因此，金屬含量高于某一百萬分率(ppm)的含有工業(yè)生產(chǎn)多肽的產(chǎn)品(諸如食物、飲料和化合物)被視為非可食產(chǎn)品，所述金屬含量取決于如本領(lǐng)域中所認定的金屬。舉例來說，鉛或鎘在使得當由哺乳動物消耗時鉛將具有有害生物作用的水平下包括在工業(yè)生產(chǎn)多肽中將通常致使含有所述工業(yè)生產(chǎn)多肽的組合物是非可食的。盡管存在以上描述，但一些多肽具有絡(luò)合或并入其中的某些量的金屬(諸如鐵、鋅、鈣和鎂)，并且所述金屬將未必致使多肽是非可食的。術(shù)語“控制序列”意圖至少涵蓋其存在為表達所必需的任何組分，并且也可涵蓋其存在是有利的其它組分，例如前導(dǎo)序列和融合配偶體序列。如本文所用，如果患者由于醫(yī)學(xué)疾病而經(jīng)歷身體質(zhì)量指數(shù)和肌肉質(zhì)量中的至少一個的變化(例如肌肉減少癥)，那么所述患者患有“醫(yī)學(xué)上危急疾病”。在一些實施方案中，患者持續(xù)他們的醒來時間的至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％被限制臥床。在一些實施方案中，患者是無意識的。在一些實施方案中，患者已如這個段落中所述被限制臥床至少1天、2天、3天、4天、5天、10天、2周、3周、4周、5周、10周或長于10周。如本文所用，短語參照核酸序列的“簡并變體”涵蓋可根據(jù)標準遺傳密碼翻譯以提供與從所述參照核酸序列翻譯的氨基酸序列同一的氨基酸序列的核酸序列。術(shù)語“簡并寡核苷酸”或“簡并引物”用于表示能夠與在序列方面未必同一，但在一個或多個特定區(qū)段內(nèi)彼此同源的靶標核酸序列雜交的寡核苷酸。如本文所用，“合乎需要的身體質(zhì)量指數(shù)”是約18.5至約25的身體質(zhì)量指數(shù)。因此，如果受試者的bmi低于約18.5，那么所述受試者的bmi增加就是所述受試者的bmi的合乎需要性得以增加。如果相反，受試者的bmi高于約25，那么所述受試者的bmi降低就是所述受試者的bmi的合乎需要性得以增加。如本文所用，術(shù)語“糖尿病”包括其中受試者不能產(chǎn)生任何量或足量胰島素或另外不能調(diào)控血糖水平的任何代謝疾病。術(shù)語“糖尿病前期”也稱為“空腹葡萄糖受損”，包括其中空腹葡萄糖高于接受的正常限度的病狀。如本文所用，“年長”哺乳動物是經(jīng)歷身體質(zhì)量指數(shù)和肌肉質(zhì)量中的至少一個的年齡相關(guān)變化(例如年齡相關(guān)的肌肉減少癥)的哺乳動物。在一些實施方案中，“年長”人是至少50歲、至少60歲、至少65歲、至少70歲、至少75歲、至少80歲、至少85歲、至少90歲、至少95歲或至少100歲。在一些實施方案中，年長動物、哺乳動物或人是已經(jīng)歷肌肉質(zhì)量從峰值壽命肌肉質(zhì)量損失至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％或至少60％的人。因為已知身體質(zhì)量指數(shù)和肌肉質(zhì)量中的至少一個的年齡相關(guān)變化與年齡增加相關(guān)，所以在一些實施方案中，僅基于年齡鑒定或確定年長哺乳動物。因此，在一些實施方案中，“年長”人是僅通過他們的年齡是至少60歲、至少65歲、至少70歲、至少75歲、至少80歲、至少85歲、至少90歲、至少95歲或至少100歲的事實，而不依靠測量身體質(zhì)量指數(shù)和肌肉質(zhì)量中的至少一個來鑒定或確定。如本文所用，“必需氨基酸”是選自組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸的氨基酸。然而，應(yīng)了解“必需氨基酸”可貫穿典型壽命而變化，例如半胱氨酸、酪氨酸和精氨酸被視為人在嬰兒期的必需氨基酸。imurak,okadaa(1998)."aminoacidmetabolisminpediatricpatients".nutrition14(1):143–8。此外，氨基酸精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸在成人中被視為是“條件性必需的”，此意味著通常不需要它們處于膳食中，但必須以外源性方式向不以足量合成它們的特定群體供給。fürstp,stehlep(2004年6月1日)."whataretheessentialelementsneededforthedeterminationofaminoacidrequirementsinhumans？".journalofnutrition134(6增刊):1558s–1565s；以及reedspj(2000年7月1日)."dispensableandindispensableaminoacidsforhumans".j.nutr.130(7):1835s–40s。如本文所用，最廣泛來說，“運動”是增強或維持身體康健以及總體健康和安康的任何身體活動。運動是出于各種原因來進行，包括強化肌肉和心血管系統(tǒng)、磨練運動技能、減輕或維持重量以及出于享樂的目的。如本文所用，“運動方案”包括用于促進健康或用于治療或預(yù)防疾病的任何運動過程。如本文所用，“表達控制序列”是指為實現(xiàn)它們所操作性地連接的編碼序列的表達所必需的多核苷酸序列。表達控制序列是控制核酸序列的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后事件和翻譯的序列。表達控制序列包括適當轉(zhuǎn)錄起始、終止、啟動子和增強子序列；高效rna加工信號，諸如剪接和聚腺苷酸化信號；使細胞質(zhì)mrna穩(wěn)定的序列；增強翻譯效率的序列(例如核糖體結(jié)合位點)；增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；和當需要時，增強蛋白質(zhì)分泌的序列。所述控制序列的性質(zhì)視宿主生物體而不同；在原核生物中，所述控制序列通常包括啟動子、核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。如本文所用，“功能”和“功能性能”是指模擬每日活動的功能性測試。“肌肉功能”或“功能性能”通過任何適合接受測試來測量，所述測試包括定時舉步測試(從4英寸臺階盡可能快速地上下舉步5次)、定時平臺傳送測試(在平臺上盡可能快速地從立位變?yōu)檠雠P位，并且此后再次向上變?yōu)榱⑽唬貜?fù)一次)和身體性能連串測試(靜態(tài)平衡測試、坐椅測試和行走測試)(borsheim等,“effectofaminoacidsupplementationonmusclemass,strengthandphysicalfunctioninelderly,”clinnutr2008；27:189-195)。如本文所用，諸如組織損傷或組織損害的“行為相關(guān)的”損傷或損害由諸如身體或運動行為的機能活動所致。術(shù)語“融合蛋白”是指包含偶聯(lián)于異源性氨基酸序列的多肽或片段的多肽。融合蛋白是適用的，因為它們可被構(gòu)建來含有兩個或更多個可來自兩種或更多種不同蛋白質(zhì)的所需功能性元件。融合蛋白包含至少10個來自目標多肽的連續(xù)氨基酸、或至少20或30個氨基酸、或至少40、50或60個氨基酸、或至少75、100或125個氨基酸。融合蛋白內(nèi)包括的異源性多肽的長度通常是至少6個氨基酸、或至少8個氨基酸、或至少15、20或25個氨基酸。包括較大多肽(諸如iggfc區(qū))以及甚至整個蛋白質(zhì)(諸如含有綠色熒光蛋白(“gfp”)發(fā)色團的蛋白質(zhì))的融合物具有特定效用。融合蛋白可通過與編碼不同蛋白質(zhì)或肽的核酸序列同框構(gòu)建編碼多肽或其片段的核酸序列，接著表達融合蛋白來重組產(chǎn)生?；蛘?，可通過使多肽或其片段交聯(lián)于另一蛋白質(zhì)來化學(xué)產(chǎn)生融合蛋白。也被稱為序列同一性百分比的多肽序列同源性通常使用序列分析軟件測量。參見例如威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心的遺傳學(xué)計算機組(gcg)的序列分析軟件包(910universityavenue,madison,wis.53705)。蛋白質(zhì)分析軟件使用對各種取代、缺失和其它修飾(包括保守性氨基酸取代)指定的同源性量度匹配類似序列。舉例來說，gcg含有可以缺省參數(shù)用于確定密切相關(guān)多肽(諸如來自不同物種的生物體的同源性多肽)之間或野生型多肽與其突變蛋白之間的序列同源性或序列同一性的程序，諸如“gap”和“bestfit”。參見例如gcg第6版。當將特定多肽序列與含有來自不同生物體的許多序列的數(shù)據(jù)庫進行比較時，一示例性算法是計算機程序blast(altschul等,j.mol.biol.215:403-410(1990)；gish和states,naturegenet.3:266-272(1993)；madden等,meth.enzymol.266:131-141(1996)；altschul等,nucleicacidsres.25:3389-3402(1997)；zhang和madden,genomeres.7:649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(altschul等,nucleicacidsres.25:3389-3402(1997))。如本文所用，“胃腸病癥”或“胃腸疾病”包括涉及胃腸道或其區(qū)域(即食道、胃、小腸、大腸或直腸)以及與消化相關(guān)的器官和組織(例如胰腺、膽囊和肝)的任何病癥或疾病。如本文所用，術(shù)語“異養(yǎng)性”是指生物體不能固定碳，并且使用有機碳來生長。如本文所用，如果編碼多肽的核酸序列與編碼第二多肽的核酸序列具有類似序列，那么所述多肽與所述第二多肽具有“同源性”或與所述第二多肽“同源”。或者，如果兩個多肽具有類似氨基酸序列，那么某一多肽與第二多肽具有同源性。(因此，術(shù)語“同源性多肽”被定義來意指兩個多肽具有類似氨基酸序列。)當“同源”關(guān)于多肽或肽使用時，應(yīng)認識到不同一的殘基位置常因保守性氨基酸取代而不同。“保守性氨基酸取代”是其中某一氨基酸殘基被具有化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或疏水性)類似的側(cè)鏈(r基團)的另一氨基酸殘基取代的取代。一般來說，保守性氨基酸取代將不實質(zhì)上改變多肽的功能性質(zhì)。在兩個或更多個氨基酸序列因保守性取代而不同于彼此的情況下，序列同一性百分比或同源性程度可向上調(diào)整以修正取代的保守性性質(zhì)。用于進行這個調(diào)整的手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。參見例如pearson,1994,methodsmol.biol.24:307-31以及25:365-89。以下六組各自含有是彼此的保守性取代的氨基酸：1)絲氨酸、蘇氨酸；2)天冬氨酸、谷氨酸；3)天冬酰胺、谷氨酰胺；4)精氨酸、賴氨酸；5)異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。在一些實施方案中，如果聚合分子(例如多肽序列或核酸序列)的序列至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一，那么它們被視為彼此同源。在一些實施方案中，如果聚合分子的序列至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％類似，那么它們被視為彼此“同源”。術(shù)語“同源”必須是指至少兩個序列(核苷酸序列或氨基酸序列)之間的比較。在一些實施方案中，如果兩個核苷酸序列編碼的多肽關(guān)于至少一個具有至少約10、15、20、25、30、35、40、45、50個或超過50個氨基酸的鏈段是至少約50％同一的，至少約60％同一的，至少約70％同一的，至少約80％同一的或至少約90％同一的，那么所述兩個核苷酸序列被視為同源。在一些實施方案中，同源性核苷酸序列的特征在于能夠編碼具有至少4-5個獨特指定的氨基酸的鏈段。這些氨基酸相對于彼此的同一性與大致間隔兩者均必須為將核苷酸序列考慮為同源時所考慮。在長度小于60個核苷酸的核苷酸序列的一些實施方案中，通過編碼具有至少4-5個獨特指定的氨基酸的鏈段的能力來確定同源性。在一些實施方案中，如果兩個多肽序列關(guān)于至少一個具有至少約20個氨基酸的鏈段是至少約50％同一的，至少約60％同一的，至少約70％同一的，至少約80％同一的或至少約90％同一的，那么所述多肽被視為同源。在其它實施方案中，如果兩個多肽序列關(guān)于至少一個具有至少約20個氨基酸的鏈段是類似的，諸如是至少約50％類似的，至少約60％類似的，至少約70％類似的，至少約80％類似的或至少約95％類似的，那么所述多肽被視為同源。在一些實施方案中，通過導(dǎo)致某一氨基酸變化的較少核苷酸變化來說明類似性(例如具有單一核苷酸變化的核酸序列比具有兩個核苷酸變化的核酸序列更類似于參照核酸序列，即使兩種變化均導(dǎo)致相同氨基酸取代)。術(shù)語“原位”是指過程發(fā)生在與活生物體分開生長，例如在組織培養(yǎng)中生長的活細胞中。如本文所用，術(shù)語“體外”是指事件發(fā)生在人工環(huán)境中，例如在試管或反應(yīng)容器中，在細胞培養(yǎng)中，在皮氏培養(yǎng)皿(petridish)中等，而非在生物體(例如動物、植物或微生物)內(nèi)。如本文所用，術(shù)語“離體”是指在生物體外部的環(huán)境中在組織中或組織上進行實驗。術(shù)語“體內(nèi)”是指過程發(fā)生在活生物體中。如本文所用，“修飾的衍生物”是指在一級結(jié)構(gòu)序列方面與參照多肽序列大致上同源，但包括例如體內(nèi)或體外化學(xué)和生物化學(xué)修飾或并有不見于參照多肽中的氨基酸的多肽或其片段。所述修飾包括例如乙?；Ⅳ然?、磷酸化、糖基化、泛素化、標記(例如用放射性核素標記)和各種酶修飾，如將易于為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。多種用于標記多肽的方法和適用于所述目的的取代基或標記在本領(lǐng)域中是熟知的，并且包括放射性同位素(諸如125i、32p、35s和3h)、結(jié)合標記的抗配體(例如抗體)的配體、熒光團、化學(xué)發(fā)光劑、酶和可充當標記的配體的特異性結(jié)合對成員的抗配體。對標記的選擇取決于所需靈敏性、與引物綴合的簡易性、穩(wěn)定性需求和可用儀器。用于標記多肽的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。參見例如ausubel等,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociates(1992以及直至2002的補編)。如本文所用，“肌肉強度”是指在單次最大出力下，肌肉可產(chǎn)生的力量。存在兩種類型的肌肉強度，即靜態(tài)強度和動態(tài)強度。靜態(tài)強度是指肌肉的等長收縮，其中肌肉產(chǎn)生力量，而肌肉長度保持恒定和/或此時不存在關(guān)節(jié)運動。實例包括固持或攜帶物件或相對于墻壁推進。動態(tài)強度是指肌肉產(chǎn)生導(dǎo)致運動的力量。動態(tài)強度可為等張收縮，其中肌肉在恒定負荷或等動力收縮下縮短，其中肌肉在恒定速度下收縮并縮短。動態(tài)強度也可包括等慣性強度。此外，術(shù)語“肌肉強度”是指最大動態(tài)肌肉強度，如由術(shù)語“一次重復(fù)最大值”(1rm)所描述。這是可在不失敗或損傷下完全移動(提升、推進或牽拉)最大負荷(以千克計)一次的測量結(jié)果。這個值可直接測量，但這樣做需要增加重量直至受試者未能將活動進行完畢?；蛘?，通過使用小于受試者可移動的最大量的負荷，對受試者可達成的最大運動重復(fù)次數(shù)進行計數(shù)來估計1rm。常在臨床試驗中測量腿部伸展和腿部彎曲(borsheim等,“effectofaminoacidsupplementationonmusclemass,strengthandphysicalfunctioninelderly,”clinnutr2008；27:189-195；paddon-jones等,“essentialaminoacidandcarbohydratesupplementationamelioratesmuscleproteinlossinhumansduring28daysbedrest,”jclinendocrinolmetab2004；89:4351-4358)。如本文所用，“肌肉質(zhì)量”是指受試者的身體中的肌肉重量。類似地，“肌肉合成代謝”包括合成肌肉蛋白質(zhì)，并且是獲得肌肉質(zhì)量所依的過程的組成部分。肌肉質(zhì)量包括骨骼肌、平滑肌(諸如心臟和消化道肌肉)和這些肌肉中含有的水。特定肌肉的肌肉質(zhì)量可使用雙能x射線吸光測定術(shù)(dexa)來測定(padden-jones等,2004)?？偸菪陨眢w質(zhì)量(減去脂肪)、總身體質(zhì)量和骨礦物質(zhì)含量也可通過dexa來測量。在一些實施方案中，受試者的特定肌肉的肌肉質(zhì)量的變化是例如通過dexa來測定，并且所述變化用作所述受試者的肌肉質(zhì)量的總變化的代表。因此，舉例來說，如果受試者消耗如本文公開的營養(yǎng)性蛋白質(zhì)，并且在一段時期內(nèi)經(jīng)歷特定肌肉或肌肉群中的肌肉質(zhì)量增加，那么可推斷所述受試者已經(jīng)歷肌肉質(zhì)量增加。可以多種方式測量肌肉質(zhì)量的變化，所述方式包括蛋白質(zhì)合成、分數(shù)合成速率和某些關(guān)鍵活性，諸如mtor/mtorc。一般來說，“瘦性肌肉質(zhì)量”是指在不存在諸如脂肪的其它組織下的肌肉組織的質(zhì)量。如本文所用的術(shù)語“核酸片段”是指相較于全長參照核苷酸序列，具有缺失(例如5’末端或3’末端缺失)的核酸序列。在一實施方案中，核酸片段是連續(xù)序列，其中所述片段的核苷酸序列與天然存在的序列中的相應(yīng)位置同一。在一些實施方案中，片段的長度是至少10、15、20或25個核苷酸、或至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150個核苷酸。在一些實施方案中，核酸序列的片段是開放閱讀框序列的片段。在一些實施方案中，這種片段編碼由開放閱讀框核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的多肽片段(如本文所定義)。如果組合物、制劑或產(chǎn)品向它的預(yù)期消耗者提供可觀營養(yǎng)量，此意味著消耗者將所述組合物或制劑的全部或一部分吸收至細胞、器官和/或組織中，那么它是“營養(yǎng)性的(nutritional/nutritive)”。通常，所述向細胞、器官和/或組織中的吸收例如通過維持或改進所述細胞、器官和/或組織的健康和/或天然功能來向消耗者提供益處或效用。如本文所述加以吸收的營養(yǎng)性組合物或制劑稱為“營養(yǎng)”。非限制性地舉例來說，如果多肽向它的預(yù)期消耗者提供可觀多肽營養(yǎng)量，此意味著消耗者將通常呈單一氨基酸或小肽形式的蛋白質(zhì)的全部或一部分吸收至細胞、器官和/或組織中，那么它是營養(yǎng)性的。“營養(yǎng)”也意指向諸如人或其它哺乳動物的受試者提供營養(yǎng)性組合物、制劑、產(chǎn)品或其它物質(zhì)的過程。營養(yǎng)性產(chǎn)品無需是“營養(yǎng)全面的”，此意味著如果以足量消耗，那么產(chǎn)品提供為消耗者的健康所需的所有碳水化合物、脂質(zhì)、必需脂肪酸、必需氨基酸、條件性必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)。另外，“營養(yǎng)全面的蛋白質(zhì)”含有所有需要的蛋白質(zhì)營養(yǎng)(此意味著量為生物體達成生理常態(tài)所需)，但未必含有微量營養(yǎng)物，諸如維生素和礦物質(zhì)、碳水化合物或脂質(zhì)。在優(yōu)選實施方案中，組合物或制劑在它以足以提供“營養(yǎng)性益處”的量提供能夠分解(即破壞肽鍵，常稱為蛋白質(zhì)消化)成單一氨基酸和/或小肽(例如兩個氨基酸、三個氨基酸或四個氨基酸，有可能多達十個氨基酸)的多肽方面是營養(yǎng)性的。此外，在某些實施方案中，提供跨越胃腸壁轉(zhuǎn)送，并且以小肽(例如大于單一氨基酸，但小于約十個氨基酸)或較大肽、寡肽或多肽(例如>11個氨基酸)形式被吸收至血流中的營養(yǎng)性多肽。含有多肽的組合物的營養(yǎng)性益處可通過許多量度來說明以及任選定量。舉例來說，營養(yǎng)性益處是對于消耗性生物體的等于或大于參照每日蛋白質(zhì)攝取值的至少約0.5％，諸如參照每日攝取值的約1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或大于約100％的益處。或者，營養(yǎng)性益處通過由消耗者感覺到和/或認識到飽腹感來說明。在其它實施方案中，營養(yǎng)性益處通過將組合物或制劑的大量多肽組分并入消耗者的細胞、器官和/或組織中來說明，所述并入通常意味著單一氨基酸或短肽用于在細胞內(nèi)重新產(chǎn)生多肽?！跋恼摺被颉跋男陨矬w”意指能夠攝取具有營養(yǎng)性益處的產(chǎn)品的任何動物。通常，消耗者將為哺乳動物，諸如健康人，例如健康嬰兒、兒童、成人或年長成人。或者，消耗者將為處于顯現(xiàn)或罹患特征在于(i)缺乏足夠營養(yǎng)和/或(ii)由本發(fā)明的營養(yǎng)性產(chǎn)品使其減輕的疾病、病癥或病狀的風(fēng)險下的哺乳動物，諸如人(例如嬰兒、兒童、成人或年長成人)?！皨雰骸蓖ǔＪ悄挲g低于約1或2歲的人，“兒童”通常是年齡低于約18歲的人，并且“年長成人”或“年長”人是年齡約65歲或大于65歲的人。在其它優(yōu)選實施方案中，組合物或制劑在它提供能夠由預(yù)期消耗者水解的碳水化合物(稱為“營養(yǎng)性碳水化合物”)方面是營養(yǎng)性的。含有碳水化合物的組合物的營養(yǎng)性益處可通過許多量度來說明以及任選定量。舉例來說，營養(yǎng)性益處是對于消耗性生物體的等于或大于參照每日碳水化合物攝取值的至少約2％的益處。如本文所用的多肽“營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域”意指多肽的能夠提供營養(yǎng)的任何結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選地，多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域提供一種或多種超過含有營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域的全長多肽的優(yōu)勢，諸如營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域比全長多肽提供更多營養(yǎng)。舉例來說，相較于(i)參照多肽或含有參照多肽的混合物或組合物，(ii)存在于農(nóng)業(yè)源性食物產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)或多肽，和/或(iii)存在于哺乳動物受試者的膳食中的蛋白質(zhì)或多肽產(chǎn)品，多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域具有更高濃度的合乎需要的氨基酸，具有更低濃度的不合需要的氨基酸，含有由消化蛋白酶裂解的位點，更易于消化和/或更易于由消化較大多肽而產(chǎn)生，具有改進的儲存特征，或這些和/或其它要素的組合。多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域的其它優(yōu)勢包括相對于全長多肽，更易于和/或更高效產(chǎn)生，生理化學(xué)性質(zhì)不同或更有利，和/或具有不同或更有利的安全性質(zhì)(例如消除一個或多個過敏結(jié)構(gòu)域)。參照多肽可為天然存在的多肽或重組產(chǎn)生的多肽，其轉(zhuǎn)而可具有與天然存在的多肽同一或不同的氨基酸序列。參照多肽也可為不存在于天然存在的多肽中的共有氨基酸序列。另外，含有參照多肽的混合物或組合物可為天然存在的混合物，諸如存在于諸如奶或乳清的乳制品中的多肽的混合物，或可為多肽(其轉(zhuǎn)而可為天然存在的或合成的)的合成混合物。在某些實施方案中，營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域含有n末端氨基酸和/或c末端氨基酸不同于參照分泌多肽(諸如全長分泌多肽)的n末端氨基酸和/或c末端氨基酸的氨基酸序列。舉例來說，營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域具有對應(yīng)于在含有營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域的較大分泌多肽內(nèi)部的氨基酸序列的n末端氨基酸序列。營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域可包括或排除較大分泌多肽的信號序列。如本文所用，“含有”多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域的多肽含有所述多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域的全部以及至少一個在所述多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域的n末端或c末端的其它氨基酸。通常，多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域從含有編碼營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域的核酸的細胞或生物體分泌，并且稱為“分泌多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域”，并且在其中營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域從單細胞(或單細胞化)生物體分泌的情況下，它被稱為“單細胞分泌多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域”。在其它優(yōu)選實施方案中，組合物或制劑在它提供能夠由預(yù)期消耗者消化、并入、轉(zhuǎn)化或進行其它細胞用途的脂質(zhì)(稱為“營養(yǎng)性脂質(zhì)”)方面是營養(yǎng)性的。含有脂質(zhì)的組合物的營養(yǎng)性益處可通過許多量度來說明以及任選定量。舉例來說，營養(yǎng)性益處是對于消耗性生物體的等于或大于參照每日脂質(zhì)(即脂肪)攝取值的至少約2％的益處。如本文所用，“肥胖”受試者具有使受試者罹患包括心臟病、ii型糖尿病、骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)炎以及癌癥的疾病的可能性增加的過度體脂水平，而“超重”受試者高于被認定為正常、可接受或合乎需要而非肥胖的重量。在西方國家，bmi值超過30的受試者被視為肥胖，而bmi值在25-30之間的受試者被視為超重。如本文所用，“操作性地連接的”或“可操作地連接的”表達控制序列是指以下連接：其中表達控制序列與目標基因鄰接以控制所述目標基因，以及表達控制序列反式或在一定距離下起控制所述目標基因的作用。術(shù)語“序列同一性百分比”或“同一”在核酸序列的情形下是指當對準以達成最大對應(yīng)時，兩個序列中的殘基是相同的。存在本領(lǐng)域中已知的可用于測量核苷酸序列同一性的許多不同算法。舉例來說，可使用威斯康星程序包10.0版(geneticscomputergroup(gcg),madison,wis.)中的程序fasta、gap或bestfit比較多核苷酸序列。fasta提供在查詢序列與搜索序列之間最佳重疊的區(qū)域的比對和序列同一性百分比。pearson,methodsenzymol.183:63-98(1990)。術(shù)語“多核苷酸”、“核酸分子、“核酸”或“核酸序列”是指長度是至少10個堿基的聚合形式的核苷酸。所述術(shù)語包括dna分子(例如cdna或基因組或合成dna)和rna分子(例如mrna或合成rna)、以及dna或rna的含有非天然核苷酸類似物、非天然核苷間鍵或兩者的類似物。核酸可呈任何拓撲構(gòu)象。舉例來說，核酸可為單鏈、雙鏈、三鏈、四鏈體、部分雙鏈、分支式、發(fā)夾式、環(huán)狀或呈掛鎖(padlocked)構(gòu)象?！昂铣伞眗na、dna或混合聚合物是在細胞外部產(chǎn)生的rna、dna或混合聚合物，例如化學(xué)合成的rna、dna或混合聚合物。如本文所用的術(shù)語“核酸片段”是指相較于全長參照核苷酸序列，具有缺失(例如5’末端或3’末端缺失)的核酸序列。在一實施方案中，核酸片段是連續(xù)序列，其中所述片段的核苷酸序列與天然存在的序列中的相應(yīng)位置同一。在一些實施方案中，片段的長度是至少10、15、20或25個核苷酸、或至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800個或大于1800個核苷酸。在一些實施方案中，核酸序列的片段是開放閱讀框序列的片段。在一些實施方案中，這種片段編碼由開放閱讀框核苷酸序列編碼的多肽的多肽片段(如本文所定義)。術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可相互交換，并且這些術(shù)語涵蓋天然存在的多肽與非天然存在的多肽兩者及其如本文提供或如本領(lǐng)域中通常已知的片段、突變體、衍生物和類似物。多肽可為單體，此意味著它具有單鏈，或可為聚合的，此意味著它由兩個或更多個可共價或非共價締合的鏈組成。此外，多肽可包含各自具有一種或多種不同活性的許多不同結(jié)構(gòu)域。為免除懷疑，多肽可為大于或等于兩個氨基酸的任何長度。術(shù)語“分離的多肽”是就它的起源或獲得來源而言，(1)不與在它的任何天然狀態(tài)下伴隨它的天然相伴組分相伴，(2)以不見于自然界中的純度存在，其中純度可關(guān)于其它細胞物質(zhì)的存在加以斷定(例如不含來自相同物種或來自其中產(chǎn)生多肽的宿主物種的其它多肽)，(3)由來自不同物種的細胞表達，(4)由細胞重組表達(例如如果多肽由存在于宿主細胞中的重組核酸產(chǎn)生并從所述產(chǎn)生性宿主細胞分離，那么它是“分離的多肽”)，(5)不存在于自然界中(例如它是見于自然界中的多肽的結(jié)構(gòu)域或其它片段或它包括不見于自然界中的氨基酸類似物或衍生物或除標準肽鍵以外的鍵聯(lián))，或(6)另外通過人手來產(chǎn)生、制備和/或制造的多肽。因此，“分離的多肽”包括在宿主細胞中由重組核酸(諸如載體)產(chǎn)生的多肽，而無論所述宿主細胞是否天然產(chǎn)生具有同一氨基酸序列的多肽?！岸嚯摹卑ㄓ伤拗骷毎ㄟ^過度表達產(chǎn)生的多肽，所述過度表達例如是諸如通過改變多肽的啟動子以使它的表達增加至高于它在不存在改變的啟動子下在宿主細胞中的正常表達水平的水平來由宿主細胞同源性過度表達多肽?；瘜W(xué)合成或在不同于它所天然源于的細胞的細胞系統(tǒng)中合成的多肽將與它的天然相伴組分“分離”。也可通過使用本領(lǐng)域中熟知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)進行分離來致使多肽大致上不含天然相伴組分。如由此所定義，“分離”未必需要如此描述的蛋白質(zhì)、多肽、肽或寡肽已從于其中合成它的細胞物理移除。如本文所用的術(shù)語“多肽片段”或“蛋白質(zhì)片段”是指相較于參照多肽(例如全長多肽或天然存在的蛋白質(zhì)的多肽結(jié)構(gòu)域)具有較少氨基酸的多肽或其結(jié)構(gòu)域?！疤烊淮嬖诘牡鞍踪|(zhì)”或“天然存在的多肽”包括具有由非重組細胞或生物體產(chǎn)生的氨基酸序列的多肽。在一實施方案中，多肽片段是連續(xù)序列，其中所述片段的氨基酸序列與天然存在的序列中的相應(yīng)位置同一。片段的長度通常是至少5、6、7、8、9或10個氨基酸、或至少12、14、16或18個氨基酸、或至少20個氨基酸、或至少25、30、35、40或45個氨基酸、或至少50、60、70、80、90或100個氨基酸、或至少110、120、130、140、150、160、170、180、190或200個氨基酸、或225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600個或大于600個氨基酸。片段可為在細胞內(nèi)部或外部消化的較大多肽序列的一部分。因此，長度是50個氨基酸的多肽可在細胞內(nèi)產(chǎn)生，但在細胞內(nèi)部或外部被蛋白水解以產(chǎn)生長度小于50個氨基酸的多肽。這對于短于約25個氨基酸的多肽特別重要，所述多肽可比較大多肽更難以重組產(chǎn)生或更難以一旦重組產(chǎn)生即純化。如本文所用的術(shù)語“肽”是指短多肽或寡肽，例如通常含有小于約50個氨基酸，并且更通常小于約30個氨基酸，或更通常小于約15個氨基酸，諸如小于約10、9、8、7、6、5、4或3個氨基酸的短多肽或寡肽。如本文所用的所述術(shù)語涵蓋模擬結(jié)構(gòu)功能以及因此生物功能的類似物和模擬物。如本文所用，“多肽突變體”或“突變蛋白”是指相較于參照蛋白質(zhì)或多肽(諸如天然或野生型蛋白質(zhì))的氨基酸序列，其序列含有一個或多個氨基酸的插入、重復(fù)、缺失、重排或取代的多肽。突變蛋白可具有一個或多個氨基酸點取代，其中在某一位置處的單一氨基酸已變?yōu)榱硪话被幔灰粋€或多個插入和/或缺失，其中一個或多個氨基酸分別被插入在參照蛋白質(zhì)的序列中或在參照蛋白質(zhì)的序列中缺失；和/或氨基酸序列在氨基或羧基末端的任一者或兩者處的截短。突變蛋白相較于參照蛋白質(zhì)可具有相同或不同生物活性。在一些實施方案中，突變蛋白與它的對應(yīng)參照蛋白質(zhì)具有例如至少85％總體序列同源性。在一些實施方案中，突變蛋白與野生型蛋白質(zhì)具有至少90％總體序列同源性。在其它實施方案中，突變蛋白展現(xiàn)至少95％序列同一性，或98％或99％或99.5％或99.9％總體序列同一性如本文所用，“用于親和純化的多肽標簽”是具有可用于分離或純化融合于第一“標簽”多肽的目標第二蛋白質(zhì)或多肽序列的結(jié)合配偶體的任何多肽。若干實例在本領(lǐng)域中是熟知的，并且包括his-6標簽、flag表位、c-myc表位、strep-tagii、生物素標簽、谷胱甘肽5-轉(zhuǎn)移酶(gst)、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(cbp)、麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)或金屬親和標簽。如本文所用，“蛋白質(zhì)-能量營養(yǎng)不良”是指一種形式的營養(yǎng)不良，其中存在蛋白質(zhì)攝取不足。類型包括夸休可爾癥(kwashiorkor)(突出性蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良)、消瘦(缺乏卡路里與蛋白質(zhì)營養(yǎng)兩者)和消瘦性夸休可爾癥(存在顯著蛋白質(zhì)缺乏和顯著卡路里不足征象，有時被稱為最重度形式的營養(yǎng)不良)?！盃I養(yǎng)失調(diào)”和“營養(yǎng)不良”在本文中被等效使用。術(shù)語“純化(purify/purifying)”和“純化的(purified)”是指物質(zhì)(或?qū)嶓w、組合物、產(chǎn)物或材料)已與至少一些它在初始產(chǎn)生(在自然界中抑或在實驗環(huán)境中)時或在它初始產(chǎn)生之后的任何時間期間與其相伴的組分分離。如果諸如營養(yǎng)性多肽的物質(zhì)在產(chǎn)生時，或在直至并包括最終產(chǎn)物的任何層面或階段被分離，那么它將被視為是純化的，但最終產(chǎn)物可含有多達約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％或高于約90％的其它物質(zhì)，并且仍然被視為是“分離的”。純化物質(zhì)或?qū)嶓w可與至少約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％或大于90％的它們初始與其相伴的其它組分分離。在一些實施方案中，純化物質(zhì)的純度大于約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或大于約99％。在本文提供的多肽和其它多肽的情況下，這種多肽可從一種或多種能夠從分泌多肽的單細胞生物體分泌的其它多肽純化。如本文所用，如果多肽物質(zhì)大致上不含其它組分或其它多肽組分，那么它是“純的”。如本文所用，“重組”是指例如基因或多肽的生物分子(1)已從它的天然存在的環(huán)境移除，(2)不與在自然界中發(fā)現(xiàn)所述基因所處的多核苷酸的全部或一部分相伴，(3)操作性地連接于它在自然界中不連接的多核苷酸，或(4)不存在于自然界中。此外，“重組”是指細胞或生物體(諸如單細胞生物體(在本文中稱為“重組單細胞生物體”)、“重組宿主”或“重組細胞”)含有、產(chǎn)生和/或分泌可為重組生物分子或非重組生物分子的生物分子。舉例來說，重組單細胞生物體可含有提供重組多肽或非重組多肽的產(chǎn)生和/或分泌增強的重組核酸。重組細胞或生物體也意指諸如重組載體的重組核酸已被引入其中的細胞?！爸亟M單細胞生物體”包括重組微生物宿主細胞，并且不僅是指特定主題細胞，而且是指這種細胞的子代。因為某些修飾可由于突變或環(huán)境影響而發(fā)生在繼代中，所以所述子代可能實際上不與親本細胞相同，但仍然被包括在本文術(shù)語的范圍內(nèi)。術(shù)語“重組”可關(guān)于克隆的dna分離物、化學(xué)合成的多核苷酸類似物或由異源性系統(tǒng)生物合成的多核苷酸類似物、以及由所述核酸編碼的多肽和/或mrna加以使用。因此，舉例來說，例如如果由微生物合成的多肽由從存在于細胞中的重組基因或其它核酸序列轉(zhuǎn)錄的mrna產(chǎn)生，那么它是重組的。如本文所用，如果鄰近于生物體的基因組中的內(nèi)源性核酸序列放置異源性序列以使這個內(nèi)源性核酸序列的表達被改變，那么所述內(nèi)源性核酸序列(或那個序列的編碼多肽產(chǎn)物)在本文中被視為是“重組的”。在這個情形下，異源性序列是不天然鄰近于內(nèi)源性核酸序列的序列，無論所述異源性序列是否本身是內(nèi)源性的(源于相同宿主細胞或其子代)或外源性的(源于不同宿主細胞或其子代)。舉例來說，啟動子序列可取代(例如通過同源性重組)宿主細胞的基因組中的基因的天然啟動子，以使這個基因具有改變的表達樣式。這個基因現(xiàn)將變?yōu)椤爸亟M的”，因為它與至少一些天然側(cè)接它的序列分離。如果核酸含有不天然存在于基因組中的相應(yīng)核酸中的任何修飾，那么它也被視為是“重組的”。舉例來說，如果內(nèi)源性編碼序列含有例如通過人為干預(yù)來人工引入的插入、缺失或點突變，那么它被視為是“重組的”?！爸亟M核酸”也包括在異源性位點處整合至宿主細胞染色體中的核酸和以游離體形式存在的核酸構(gòu)建體。如本文所用的術(shù)語“重組宿主細胞”(或簡稱為“重組細胞”或“宿主細胞”)意指諸如重組載體的重組核酸已被引入其中的細胞。在一些情況下，用詞“細胞”由指定細胞類型的名稱替代。舉例來說，“重組微生物”是作為微生物宿主細胞的重組宿主細胞，而“重組藍細菌”是作為藍細菌宿主細胞的重組宿主細胞。應(yīng)了解所述術(shù)語意圖不僅指代特定主題細胞，而且指代這種細胞的子代。因為某些修飾可由于突變或環(huán)境影響而發(fā)生在繼代中，所以所述子代可能實際上不與親本細胞相同，但仍然被包括在如本文所用的術(shù)語“重組宿主細胞”、“重組細胞”和“宿主細胞”的范圍內(nèi)。重組宿主細胞可為培養(yǎng)生長的分離的細胞或細胞系或可為存在于活組織或生物體中的細胞。如本文所用，“肌肉減少癥”是指骨骼肌質(zhì)量(通常在25歲之后每年損失0.5-1％)、品質(zhì)和強度的與衰老相關(guān)的退化性損失。肌肉減少癥是虛弱綜合征的組成部分。歐洲關(guān)于年長人的肌肉減少癥的工作組(europeanworkinggrouponsarcopeniainolderpeople，ewgsop)已建立針對年齡相關(guān)的肌肉減少癥的實際臨床規(guī)定和統(tǒng)一診斷準則。對于肌肉減少癥的診斷，工作組已提出使用存在低肌肉質(zhì)量與低肌肉功能(強度或性能)兩者。肌肉減少癥的特征首先在于肌肉萎縮(肌肉尺寸降低)，以及由諸如肌肉纖維被脂肪置換、纖維化增加、肌肉代謝變化、氧化應(yīng)激和神經(jīng)肌肉接點退化的因素引起的肌肉組織“品質(zhì)”降低。這些變化組合在一起導(dǎo)致肌肉功能進行性損失，并且最終導(dǎo)致虛弱。虛弱是一種在年長成人中常見的體現(xiàn)災(zāi)難性健康和功能衰退的風(fēng)險升高的老年綜合征。虛弱的因素可包括肌肉減少癥、骨質(zhì)疏松和肌肉衰弱。肌肉衰弱，也稱為肌肉疲勞(或“缺乏強度”)，是指不能用骨骼肌施加力量。衰弱常在肌肉萎縮和活動減少之后，諸如在由于疾病的一段長期臥床休息之后。也存在由于肌肉減少癥的肌肉衰弱逐漸發(fā)作。因此，肌肉減少癥是與肌肉損耗相關(guān)的一示例性病狀。如本文所用，“飽足”是當進食時變飽或?qū)M食的需求降低的舉動。這會使進食停止或減少。如本文所用，“飽腹感”是餐后保持飽滿的舉動，其表現(xiàn)為餐后不進食的時期。如本文所用，“分泌(secrete/secretion)”和“分泌的(secreted)”全都是指多肽從多細胞生物體或單細胞生物體的細胞的細胞質(zhì)重定位至其細胞外環(huán)境中所依的舉動或過程。如本文所提供，所述分泌可主動或被動發(fā)生。此外，術(shù)語“排泄(excrete/excretion)”和“排泄的(excreted)”通常暗示從細胞或單細胞生物體被動清除物質(zhì)；然而，適當時，所述術(shù)語可與產(chǎn)生并從細胞或單細胞生物體向外轉(zhuǎn)移物質(zhì)相關(guān)。一般來說，在一組特定條件下在比特定dna雜交物的熱解鏈點(tm)低約25℃下進行“嚴格雜交”。在一組特定條件下在比特定dna雜交物的tm低約5℃的溫度下進行“嚴格洗滌”。tm是50％的靶標序列與完全匹配探針雜交所處的溫度。參見sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(1989),第9.51頁，據(jù)此以引用的方式并入本文。出于本文目的，溶液相雜交的“嚴格條件”被定義為在65℃下在6xssc(其中20xssc含有3.0mnac1和0.3m檸檬酸鈉)、1％sds中進行水性雜交(即不含甲酰胺)8-12小時，隨后在65℃下在0.2xssc、0.1％sds中進行2次20分鐘洗滌。熟練工作者應(yīng)了解在65℃下雜交將取決于許多因素而在不同速率下發(fā)生，所述因素包括雜交的序列的長度和同一性百分比。術(shù)語“大致上同源性”或“大致上類似性”在關(guān)于核酸或其片段時指示當在適當核苷酸插入或缺失下與另一核酸(或它的互補鏈)最優(yōu)比對時，在至少約76％、80％、85％、或至少約90％、或至少約95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸堿基中存在核苷酸序列同一性，如通過序列同一性的任何熟知算法，諸如如上討論的fasta、blast或gap所測量。術(shù)語“足量”意指足以產(chǎn)生所需作用的量，例如足以調(diào)節(jié)細胞中的蛋白質(zhì)聚集的量?！昂铣伞眗na、dna或混合聚合物是在細胞外部產(chǎn)生的rna、dna或混合聚合物，例如化學(xué)合成的rna、dna或混合聚合物。術(shù)語“治療有效量”是有效改善疾病的癥狀的量。治療有效量可為“防治有效量”，因為防治可被視為療法。如本文所用，“產(chǎn)熱”是哺乳動物中的熱產(chǎn)生過程。產(chǎn)熱伴隨有能量消耗增加。產(chǎn)熱具體來說是在食物組分(諸如蛋白質(zhì))代謝之后燃燒能量。這也可被稱為食物的熱效應(yīng)。由個體消耗的總能量等于靜息能量消耗(在空腹狀態(tài)下在靜息時被消耗來支持基礎(chǔ)代謝的能量)、食物的熱效應(yīng)和與身體活動相關(guān)的能量消耗的總和。靜息能量消耗占人中總能量消耗的約65-75％。肌塊的數(shù)量和活性是靜息能量消耗的一個影響因素。足以支持肌肉的蛋白質(zhì)消耗也影響靜息能量消耗。蛋白質(zhì)的攝取傾向于增加餐后能量消耗；這是食物的熱效應(yīng)。食物的熱效應(yīng)占人中總能量消耗的約10％。盡管這是總能量消耗的較小比例，但這個值的較小增加可影響體重。蛋白質(zhì)具有的熱效應(yīng)高于脂肪或碳水化合物；這個效應(yīng)連同蛋白質(zhì)的其它代謝影響一起使得蛋白質(zhì)成為適用于重量控制、糖尿病管理和其它情況的底物。如本文所用，“載體”意指能夠運送它已與其連接的另一核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！保渫ǔＪ侵缚上蚱渲羞B接其它dna區(qū)段的環(huán)狀雙鏈dna環(huán)，但也包括線性雙鏈分子，諸如通過聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)由擴增或由用限制酶處理環(huán)狀質(zhì)粒產(chǎn)生的那些。其它載體包括粘粒、細菌人工染色體(bac)和酵母人工染色體(yac)。另一類型的載體是病毒載體，其中可將其它dna區(qū)段連接至病毒基因組中(以下更詳細討論)。某些載體能夠在它們被引入其中的宿主細胞中自主復(fù)制(例如具有在宿主細胞中起作用的復(fù)制起點的載體)。其它載體可在引入宿主細胞中后整合至所述宿主細胞的基因組中，并且由此與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)它們所操作性地連接的基因的表達。所述載體在本文中稱為“重組表達載體”(或簡稱為“表達載體”)。營養(yǎng)性多肽和氨基酸序列存在于膳食性食物來源中的蛋白質(zhì)在它們的營養(yǎng)價值方面可極大變化。提供由于它們的氨基酸含量和可消化性而具有增強的營養(yǎng)價值以及生理和藥理學(xué)作用的營養(yǎng)性多肽。提供具有增強的必需氨基酸水平的營養(yǎng)性多肽，所述必需氨基酸在某人中的可用性不足會通過細胞功能的網(wǎng)絡(luò)的擾動來負面影響總體健康和生理機能，并且與一大批健康問題和疾病相關(guān)聯(lián)。也提供某些氨基酸的水平降低的營養(yǎng)性多肽，所述氨基酸在受影響受試者的膳食中存在或過于豐富會導(dǎo)致致病性和致命性增加。在傳統(tǒng)上，營養(yǎng)學(xué)家和健康研究者已利用特定來源成分(例如乳清蛋白質(zhì)、蛋白、大豆)或分級物和分離物(例如大豆蛋白質(zhì)分離物)來調(diào)節(jié)膳食中總蛋白質(zhì)的相對濃度，而未能調(diào)節(jié)特定氨基酸組分。本文提供能夠轉(zhuǎn)變健康狀況以及治療、預(yù)防與氨基酸病理生理學(xué)相關(guān)的眾多疾病、病癥和病狀和減輕其嚴重性的營養(yǎng)性多肽，因為它們由于特定生理益處被選擇來改進健康狀況和解決許多營養(yǎng)相關(guān)病狀，包括胃腸吸收不良、肌肉損耗、糖尿病或糖尿病前期、肥胖癥、腫瘤學(xué)疾病、代謝疾病和其它細胞和全身性疾病。也提供呈食物、飲料、醫(yī)學(xué)食物、補充劑和藥物形式的含有營養(yǎng)性多肽的組合物和制劑。本文在營養(yǎng)性多肽的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)表征和產(chǎn)生方面提供重要闡明。本發(fā)明利用在以下方面的本文所述的協(xié)同進步：(a)可食用物種—那些人食物來源生物體的基因組學(xué)和人基因組學(xué)，(b)在食物蛋白質(zhì)和食物核酸文庫中鑒定和定量蛋白質(zhì)方面的實質(zhì)性進步，(c)蛋白質(zhì)物理化學(xué)、溶解度、結(jié)構(gòu)-可消化性關(guān)系與氨基酸在動物和人中吸收和代謝之間的新關(guān)聯(lián)，(d)營養(yǎng)性多肽的組分氨基酸如何影響蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良、慢性疾病、對急性損傷的應(yīng)答和衰老的生理學(xué)和病理生理學(xué)信息，(e)利用在系統(tǒng)發(fā)生方面廣泛范圍的宿主生物體產(chǎn)生重組營養(yǎng)性多肽，(f)對過敏原性和產(chǎn)毒性的定性以及體外和體內(nèi)測試以評估口服消耗的營養(yǎng)性多肽的人安全性。鑒定和選擇編碼營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列。在營養(yǎng)性多肽的最廣泛意義上，它涵蓋能夠向它的預(yù)期消耗者遞送氨基酸和肽營養(yǎng)的多肽，所述消耗者從所述消耗獲得益處。各營養(yǎng)性多肽含有一種或多種氨基酸序列，并且本發(fā)明提供氨基酸序列被鑒定和用于產(chǎn)生、配制和施用具有這種氨基酸序列的營養(yǎng)性多肽所依的方法。在一些實施方案中，營養(yǎng)性多肽氨基酸序列的來源涵蓋已知由例如人或其它生物體(特定來說哺乳動物)進食，或另外被視為適于消耗，而無有害作用的任何含蛋白質(zhì)物質(zhì)，例如食物、飲料、組合物或其它產(chǎn)品。源于可食用物種的營養(yǎng)性多肽氨基酸序列。在一些實施方案中，營養(yǎng)性多肽包括天然存在于可食用產(chǎn)品(諸如食物)中，或產(chǎn)生用于食物中或用作食物的生物物質(zhì)的生物體中的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的片段或由其組成。在一些實施方案中，“可食用物種”是已知會產(chǎn)生可由人進食而無有害作用的蛋白質(zhì)的物種。存在于可食用物種中或由存在于可食用物種中的核酸編碼的蛋白質(zhì)或多肽稱為“可食用物種蛋白質(zhì)”或“可食用物種多肽”，或如果可食用物種是由人消耗的物種，那么術(shù)語“天然存在的人食物蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用。一些可食用產(chǎn)品是處于限定地理位置的僅一小組某一類型的哺乳動物的膳食的不常見但已知的組分，而其它可食用產(chǎn)品是遍及世界上大部分區(qū)域的膳食主要成分。在其它實施方案中，可食用產(chǎn)品是未知先前由任何哺乳動物進食，但在測試或分析產(chǎn)品或產(chǎn)品中含有的一種或多種蛋白質(zhì)后被證明可食用的產(chǎn)品。食物生物體包括但不限于2013年3月15日提交的pct/us2013/032232、2013年3月15日提交的pct/us2013/032180、2013年3月15日提交的pct/us2013/032225、2013年3月15日提交的pct/us2013/032218、2013年3月15日提交的pct/us2013/032212、2013年3月15日提交的pct/us2013/032206以及2013年4月29日提交的pct/us2013/038682中公開的可食用物種的那些生物體和任何在系統(tǒng)發(fā)生方面相關(guān)的生物體。在一些實施方案中，營養(yǎng)性多肽氨基酸序列鑒定于存在于食物來源中的蛋白質(zhì)(諸如食物中的豐富蛋白質(zhì))中，或是其衍生物或突變蛋白，或是食物中的蛋白質(zhì)或其衍生物或突變蛋白的氨基酸序列的片段。豐富蛋白質(zhì)是相對于食物中存在的其它蛋白質(zhì)，以較高濃度存在于所述食物中的蛋白質(zhì)?；蛘撸瑺I養(yǎng)性多肽氨基酸序列是從以相對較低豐度產(chǎn)生含有所述氨基酸序列的蛋白質(zhì)的可食用物種鑒定，但所述蛋白質(zhì)在源于所述可食用物種或由所述可食用物種產(chǎn)生的生物物質(zhì)的食物產(chǎn)品中可檢測到。在一些實施方案中，編碼蛋白質(zhì)的核酸在源于可食用物種的食物產(chǎn)品中可檢測到，或所述核酸可從由可食用物種產(chǎn)生的生物物質(zhì)檢測到?？墒秤梦锓N可產(chǎn)生是處于限定地理位置的僅一小組某一類型的哺乳動物的膳食的已知組分，或是遍及世界上大部分區(qū)域的膳食主要成分的食物。示例性可食用物種包括動物，諸如山羊、母牛、雞、豬和魚。在一些實施方案中，食物中的豐富蛋白質(zhì)選自雞蛋蛋白質(zhì)，諸如卵清蛋白、卵鐵傳遞蛋白和卵類粘蛋白；肉蛋白質(zhì)，諸如肌球蛋白、肌動蛋白、原肌凝蛋白、膠原蛋白和肌鈣蛋白；谷類蛋白質(zhì)，諸如酪蛋白、α1酪蛋白、α2酪蛋白、β酪蛋白、κ酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、谷蛋白、谷醇溶蛋白、麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、白蛋白、球蛋白；雞肌肉蛋白質(zhì)，諸如白蛋白、烯醇酶、肌酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、載脂蛋白、卵鐵傳遞蛋白、磷酸葡萄糖變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、血紅蛋白、絲切蛋白、糖原磷酸化酶、果糖-1,6-二磷酸酶、肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白a鏈、酪蛋白激酶、糖原磷酸化酶、果糖-1,6-二磷酸酶、醛縮酶、微管蛋白、波形蛋白、內(nèi)質(zhì)蛋白(endoplasmin)、乳酸脫氫酶、肌動蛋白解聚因子(destrin)、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、雙磷酸果糖醛縮酶、碳酸酐酶、醛脫氫酶、膜聯(lián)蛋白、腺苷基高半胱氨酸酶(adenosylhomocysteinase)；豬肉肌肉蛋白質(zhì)，諸如肌動蛋白、肌球蛋白、烯醇酶、肌聯(lián)蛋白(titin)、絲切蛋白、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸脫氫酶、糖原磷酸化酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、肌激酶；以及魚蛋白質(zhì)，諸如小白蛋白、丙酮酸脫氫酶、肌間線蛋白(desmin)和磷酸丙糖異構(gòu)酶。營養(yǎng)性多肽可含有存在于可食用物種多肽中的氨基酸序列。在一個實施方案中，分析來自可食用物種的生物物質(zhì)以測定所述生物物質(zhì)中的蛋白質(zhì)含量。一示例性分析方法在于使用對生物物質(zhì)的質(zhì)譜測定法分析，如以下實施例中所提供。另一示例性分析方法在于產(chǎn)生生物物質(zhì)的cdna文庫以產(chǎn)生可食用物種cdna的文庫，接著在適當重組表達宿主中表達cdna文庫，如以下實施例中所提供。另一示例性分析方法是查詢核酸和/或蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫，如以下實施例中所提供。測定營養(yǎng)性多肽中的氨基酸比率和氨基酸密度。在本文的一些情況下，特定類型的氨基酸在多肽、蛋白質(zhì)或組合物內(nèi)所占的部分是基于所述類型的氨基酸與所論述多肽、蛋白質(zhì)或組合物中存在的氨基酸的總重量的重量比來定量。這個值是通過用多肽、蛋白質(zhì)或組合物中的特定氨基酸的重量除以多肽、蛋白質(zhì)或組合物中存在的所有氨基酸的重量來計算。在其它情況下，使用多肽或蛋白質(zhì)中存在的特定類型的氨基酸殘基與所論述多肽或蛋白質(zhì)中存在的氨基酸的總數(shù)的比率。這個值是通過用各多肽或蛋白質(zhì)分子中存在的所論述氨基酸的數(shù)目除以各多肽或蛋白質(zhì)分子中存在的氨基酸殘基的總數(shù)來計算。熟練技術(shù)人員了解的是這兩種方法可互換，并且多肽或蛋白質(zhì)中存在的某一類型的氨基酸的重量比例可換算成特定類型的氨基酸殘基的比率，并且反之亦然。在一些方面，選擇營養(yǎng)性多肽以具有一種或多種必需氨基酸(eaa)的所需密度。必需氨基酸缺乏癥可以有效施用一種或多種另外不存在或以不足量存在于受試者的膳食中的必需氨基酸來治療或預(yù)防。舉例來說，eaa密度約等于或大于存在于諸如牛乳球蛋白、牛β-酪蛋白或牛i型膠原蛋白的全長參照營養(yǎng)性多肽中的必需氨基酸的密度，例如營養(yǎng)性多肽中的eaa密度比參照營養(yǎng)性多肽或存在于農(nóng)業(yè)源性食物產(chǎn)品中的多肽大至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％或高于500％。在一些方面，選擇營養(yǎng)性多肽以具有芳族氨基酸(“aaa”，包括苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、組氨酸和甲狀腺素)的所需密度。aaa例如適用于神經(jīng)發(fā)育以及預(yù)防運動誘發(fā)的疲勞。舉例來說，aaa密度約等于或大于存在于諸如牛乳球蛋白、牛β-酪蛋白或牛i型膠原蛋白的全長參照營養(yǎng)性多肽中的必需氨基酸的密度，例如營養(yǎng)性多肽中的aaa密度比參照營養(yǎng)性多肽或存在于農(nóng)業(yè)源性食物產(chǎn)品中的多肽大至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％或高于500％。在一些方面，選擇營養(yǎng)性多肽以具有支鏈氨基酸(bcaa)的所需密度。舉例來說，個別bcaa或總bcaa內(nèi)含物的bcaa密度約等于或大于存在于諸如牛乳球蛋白、牛β-酪蛋白或牛i型膠原蛋白的全長參照營養(yǎng)性多肽中的支鏈氨基酸的密度，例如營養(yǎng)性多肽中的bcaa密度比參照營養(yǎng)性多肽或存在于農(nóng)業(yè)源性食物產(chǎn)品中的多肽大至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％或高于500％。也可選擇營養(yǎng)性多肽中的bcaa密度以與一種或多種屬性(諸如eaa密度)組合。在一些方面，選擇營養(yǎng)性多肽以具有氨基酸精氨酸、谷氨酰胺和/或亮氨酸(rql氨基酸)的所需密度。舉例來說，rql氨基酸密度約等于或大于存在于諸如牛乳球蛋白、牛β-酪蛋白或牛i型膠原蛋白的全長參照營養(yǎng)性多肽中的必需氨基酸的密度，例如營養(yǎng)性多肽中的rql氨基酸密度比參照營養(yǎng)性多肽或存在于農(nóng)業(yè)源性食物產(chǎn)品中的多肽大至少約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％或高于500％。在一些方面，選擇營養(yǎng)性多肽以具有翻譯后修飾(ptm)的所需密度或分布。舉例來說，ptm包括添加、移除或重新分布生物素化、聚乙二醇化、?；?、烷基化、丁?；⑻腔?、羥基化、碘化、氧化、丙?；⒈；?、豆蔻?；?、棕櫚酰化、異戊二烯化、丁二酰化、硒化、sumo化、泛素化以及糖基磷脂酰肌醇化移除或重新分布二硫橋鍵。在本文的某些實施方案中，乳清、蛋或大豆中的支鏈氨基酸、亮氨酸和/或必需氨基酸的重量比例用作測量多肽、蛋白質(zhì)或包含多肽和蛋白質(zhì)中的至少一個的組合物的氨基酸組成的基準。在那些實施方案中，應(yīng)了解兩種量度不完全等效，但也應(yīng)了解所述量度產(chǎn)生的測量結(jié)果足夠類似來用于這個目的。舉例來說，當目標蛋白質(zhì)被表征為包含的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于24％(乳清中存在的支鏈氨基酸殘基的重量比例)時，那就是對蛋白質(zhì)的支鏈氨基酸含量的精確描述。同時，那個蛋白質(zhì)中存在的支鏈氨基酸殘基的重量比例未必恰好等于24％。即使如此，熟練技術(shù)人員也應(yīng)了解這是一種適用比較。如果提供目標蛋白質(zhì)中存在的氨基酸殘基的總數(shù)，那么熟練技術(shù)人員也可確定目標蛋白質(zhì)中的支鏈氨基酸殘基的重量比例。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包括可食用物種多肽的片段。在營養(yǎng)性蛋白質(zhì)的一些實施方案中，蛋白質(zhì)由第一多肽序列組成。在營養(yǎng)性蛋白質(zhì)的一些實施方案中，蛋白質(zhì)由可食用物種多肽的片段組成。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于存在于乳清蛋白質(zhì)、蛋蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)中的至少一個中的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率。因此，在所述實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于選自24％、20％和18％的比率。在其它實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、80、85、90、95或100％的百分比率。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的l(亮氨酸)殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于存在于乳清蛋白質(zhì)、蛋蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)中的至少一個中的l殘基與總氨基酸殘基的比率。在其它實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的亮氨酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30％或大于30％的百分比率。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于存在于乳清蛋白質(zhì)、蛋蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)中的至少一個中的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率。在其它實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的必需鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、75、80、85、90、95或100％的百分比率。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于存在于乳清蛋白質(zhì)、蛋蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)中的至少一個中的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率；和/或包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的l(亮氨酸)殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于存在于乳清蛋白質(zhì)、蛋蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)中的至少一個中的l殘基與總氨基酸殘基的比率，和/或包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于存在于乳清蛋白質(zhì)、蛋蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)中的至少一個中的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于存在于乳清蛋白質(zhì)、蛋蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)中的至少一個中的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率；以及包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于存在于乳清蛋白質(zhì)、蛋蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)中的至少一個中的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含等于或大于24％的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率以及等于或大于49％的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含等于或大于20％的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率以及等于或大于51％的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含等于或大于18％的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率以及等于或大于40％的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的l(亮氨酸)殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于存在于乳清蛋白質(zhì)、蛋蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)中的至少一個中的l殘基與總氨基酸殘基的比率；以及包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于存在于乳清蛋白質(zhì)、蛋蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)中的至少一個中的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含等于或大于11％的l(亮氨酸)殘基與總氨基酸殘基的比率以及等于或大于49％的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含等于或大于9％的l(亮氨酸)氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率以及等于或大于51％的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包含等于或大于8％的l(亮氨酸)氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率以及等于或大于40％的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，第一多肽序列包括包含等于或大于24％的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率、等于或大于11％的l(亮氨酸)殘基與總氨基酸殘基的比率的第一多肽序列，并且包含每種必需氨基酸中的至少一種。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，第一多肽序列包括包含等于或大于24％的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率和等于或大于49％的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率的第一多肽序列。提供營養(yǎng)全面的營養(yǎng)性多肽。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，第一多肽序列包括含有每種必需氨基酸中的至少一種的第一多肽序列。糖基化被調(diào)節(jié)的營養(yǎng)性糖蛋白和營養(yǎng)性多肽。術(shù)語“聚糖”或“糖基”是指可被連接于多肽、脂質(zhì)或蛋白聚糖的多糖或寡糖。在一些實施方案中，聚糖共價或非共價連接于多肽。在一些實施方案中，鍵聯(lián)通過糖苷鍵而發(fā)生。在一些實施方案中，鍵聯(lián)直接介于聚糖(或糖基)與多肽之間或通過中間分子來達成。在一些實施方案中，糖苷鍵是n連接的或o連接的。術(shù)語“多糖”或“寡糖”是指一個或多個由糖苷鍵接合在一起的單糖單元。在一些實施方案中，多糖或寡糖具有直鏈或分支結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，單糖單元包括n-乙?；肴樘前贰-乙?；咸烟前贰肴樘?、神經(jīng)氨酸、果糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、n-乙酰基神經(jīng)氨酸、n-羥乙酰基神經(jīng)氨酸、o-乳?；?n-乙酰基神經(jīng)氨酸、o-乙?；?n-乙?；窠?jīng)氨酸或o-甲基-n-乙?；窠?jīng)氨酸。在一些實施方案中，單糖被磷酸酯、硫酸酯或乙酸酯基團修飾。術(shù)語“糖基化接受體位點”是指沿多肽的在天然組成中攜帶聚糖或糖基的氨基酸。在一些實施方案中，接受體位點由糖苷鍵的親核接受體組成。在一些實施方案中，親核接受體位點由氨基組成。在一些實施方案中，氨基酸由天冬酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、羥基脯氨酸、羥基賴氨酸、色氨酸、磷酸蘇氨酸、絲氨酸或磷酸絲氨酸組成。術(shù)語“外源性糖基化接受體位點”是指不存在于多肽的天然組成中的糖基化接受體位點。在一些實施方案中，外源性糖基化接受體位點的氨基酸在天然組成中不攜帶聚糖或糖基。在一些實施方案中，在天然組成中，所述氨基酸不存在于多肽的一級序列中。術(shù)語“外源性聚糖”或“外源性糖基”是指占據(jù)糖基化接受體位點的聚糖或糖基，其在天然組成中不存在于同一糖基化接受體位點上。在一些實施方案中，糖基化接受體位點是外源性糖基化位點或天然糖基化位點。術(shù)語“糖蛋白”是指結(jié)合于至少一種聚糖或糖基的多肽。本文公開含有分離的營養(yǎng)性多肽的制劑，其中至少一個外源性糖基化接受體位點存在于營養(yǎng)性多肽的氨基酸上。在一些方面，至少一個外源性糖基化接受體位點由外源性糖基或聚糖占據(jù)，或者未被占據(jù)，或由非天然占據(jù)性糖基或聚糖占據(jù)。在一些實施方案中，營養(yǎng)性多肽是氨基酸序列與seqid00001-03909和seqid04129-44483至少90％同一的多肽，或是長度是至少50個氨基酸的可食用物種多肽序列或其片段，或是當糖基化接受體位點不存在或未被占據(jù)時具有實質(zhì)性免疫原性的多肽。營養(yǎng)性多肽比氨基酸序列與營養(yǎng)性多肽同一，但糖基化接受體位點不存在或在參照多肽中未被占據(jù)的所述參照多肽更加熱穩(wěn)定，更可消化，和/或具有較低聚集評分。含有外源性糖基化接受體位點的氨基酸(例如天冬酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、羥基脯氨酸和羥基賴氨酸)對蛋白水解具有抗性。示例性聚糖是n-乙?；肴樘前贰-乙?；咸烟前贰肴樘?、神經(jīng)氨酸、果糖、甘露糖、海藻糖、葡萄糖、木糖、n-乙酰基神經(jīng)氨酸、n-羥乙酰基神經(jīng)氨酸、o-乳酰基-n-乙?；窠?jīng)氨酸、o-乙酰基-n-乙?；窠?jīng)氨酸和o-甲基-n-乙?；窠?jīng)氨酸。在一些實施方案中，提供含有營養(yǎng)性多肽的制劑，所述營養(yǎng)性多肽與參照可食用物種糖蛋白中的多肽的氨基酸序列同一，但所述營養(yǎng)性多肽的碳水化合物組分不同于所述參照可食用物種糖蛋白的碳水化合物組分。例如通過在非天然宿主中表達參照糖蛋白的多肽來產(chǎn)生營養(yǎng)性多肽，所述宿主諸如曲霉屬(aspergillus)、芽孢桿菌屬(bacillus)、酵母屬(saccharomyces)或哺乳動物細胞。也提供變異營養(yǎng)性多肽，其中氨基酸序列與參照糖蛋白中的多肽的氨基酸序列有<1％、<5％、<10％或大于10％的不同，并且營養(yǎng)性多肽的碳水化合物組分的質(zhì)量不同于參照糖蛋白的碳水化合物組分的質(zhì)量。通過在參照糖蛋白的多肽的氨基酸序列中插入、缺失、取代或置換氨基酸殘基來產(chǎn)生營養(yǎng)性多肽變體。優(yōu)選地，營養(yǎng)性多肽與參照糖蛋白具有可區(qū)分的化學(xué)、生物化學(xué)、生物物理、生物或免疫性質(zhì)。舉例來說，營養(yǎng)性多肽比參照糖蛋白更吸濕、親水或可溶于水溶液中。或者，營養(yǎng)性多肽的吸濕性、親水性或在水溶液中的可溶性小于參照糖蛋白。在另一實例中，營養(yǎng)性多肽比參照糖蛋白更具抗原性、免疫原性或過敏原性，或者，營養(yǎng)性多肽的抗原性、免疫原性或過敏原性小于參照糖蛋白。營養(yǎng)性多肽比參照糖蛋白更穩(wěn)定或?qū)γ复俳到飧呖剐?，營養(yǎng)性多肽比參照糖蛋白更不穩(wěn)定或更易受酶促降解。營養(yǎng)性多肽的碳水化合物組分大致上不含n-羥乙?；窠?jīng)氨酸或相較于參照糖蛋白具有降低的n-羥乙?；窠?jīng)氨酸?；蛘撸噍^于參照糖蛋白，營養(yǎng)性多肽的碳水化合物組分具有升高的n-羥乙酰基神經(jīng)氨酸。也提供一種營養(yǎng)性多肽，其具有至少一個存在于所述營養(yǎng)性多肽的氨基酸上的外源性糖基化接受體位點，并且所述至少一個外源性糖基化接受體位點由外源性糖基或聚糖占據(jù)，并且所述營養(yǎng)性多肽包括氨基酸序列與seqid00001-03909和seqid04129-44483至少90％同一的多肽，其中基于質(zhì)量，所述營養(yǎng)性多肽以至少0.5g在至少10％的濃度下存在，并且其中制劑大致上不含非可食產(chǎn)品。參照營養(yǎng)性多肽和參照營養(yǎng)性多肽混合物。通常被認為是高品質(zhì)氨基酸的良好來源的三種天然蛋白質(zhì)來源是乳清蛋白質(zhì)、蛋蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)。各來源包含多種蛋白質(zhì)。表rnp1呈現(xiàn)各氨基酸在蛋白質(zhì)來源中的表示為百分比的重量比例表示(gaa/g蛋白質(zhì))。表rnp2呈現(xiàn)各蛋白質(zhì)來源的必需氨基酸、支鏈氨基酸(l、i和v)和亮氨酸(l)(單獨)重量比例。被依賴來確定乳清的氨基酸含量的出處是：belitzhd.,groschw.和schieberlep.foodchemistry(第4版).springer-verlag,berlinheidelberg2009；gnc.com/product/index.jsp？productid＝2986027；nutrabio.com/products/whey_protein_concentrate.htm；以及nutrabio.com/products/whey_protein_isolate.htm。將來自那些出處的氨基酸含量值平均化以給出表rnp1和rnp2中呈現(xiàn)的數(shù)值。用于大豆蛋白質(zhì)的出處是egg,nationalnutrientdatabaseforstandardreference,發(fā)布版24(ndb.nal.usda.gov/ndb/foods/list)。用于大豆蛋白質(zhì)的出處是selfnutritiondata(nutritiondata.self.com/facts/legumes-and-legume-products/4389/2)。根據(jù)usda營養(yǎng)數(shù)據(jù)庫，乳清可包括各種非蛋白質(zhì)組分：水、脂質(zhì)(諸如脂肪酸和膽固醇)、碳水化合物和糖、礦物質(zhì)(諸如ca、fe、mg、p、k、na和zn)和維生素(諸如維生素c、硫胺素、核黃素、煙酸、維生素b-6、葉酸、維生素b-12和維生素a)。根據(jù)usda營養(yǎng)數(shù)據(jù)庫，蛋白可包括各種非蛋白質(zhì)組分：水、脂質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)(諸如ca、fe、mg、p、k、na和zn)和維生素(諸如硫胺素、核黃素、煙酸、維生素b-6、葉酸和維生素b-12)。根據(jù)usda營養(yǎng)數(shù)據(jù)庫，大豆可包括各種非蛋白質(zhì)組分：水、脂質(zhì)(諸如脂肪酸)、碳水化合物、礦物質(zhì)(諸如ca、fe、mg、p、k、na和zn)和維生素(諸如硫胺素、核黃素、煙酸、維生素b-6、葉酸)。工程改造的營養(yǎng)性多肽。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包括蛋白質(zhì)的衍生物或突變蛋白、或可食用物種蛋白質(zhì)或天然存在于食物產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)的片段或由其組成。這種蛋白質(zhì)可被稱為“工程改造的蛋白質(zhì)”。在所述實施方案中，天然蛋白質(zhì)或其片段是“參照”蛋白質(zhì)或多肽，并且工程改造的蛋白質(zhì)或其第一多肽序列相對于參照蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列包含至少一種序列修飾。舉例來說，在一些實施方案中，工程改造的蛋白質(zhì)或其第一多肽序列與至少一種參照蛋白質(zhì)氨基酸序列是至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％同一的。通常，存在于工程改造的蛋白質(zhì)或其第一多肽序列中的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基、必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基、以及亮氨酸殘基與總氨基酸殘基中的至少一個的比率大于存在于參照蛋白質(zhì)或多肽序列中的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基、必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基、以及亮氨酸殘基與總氨基酸殘基中的至少一個的相應(yīng)比率。營養(yǎng)性多肽—直系同源物和同源物。在另一方面，提供含有與可食用物種多肽同源的氨基酸序列的營養(yǎng)性多肽，其任選從單細胞生物體分泌并從其純化。所述同源性多肽可為70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％類似的，或可與可食用物種多肽70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一。所述營養(yǎng)性多肽對于宿主細胞可為內(nèi)源性的或外源性的，可在宿主細胞中天然分泌，或兩者，并且可被工程改造以達成分泌。也提供營養(yǎng)性多肽的直系同源物。對營養(yǎng)性多肽序列的公開涵蓋對這種營養(yǎng)性多肽序列的來自在系統(tǒng)發(fā)生方面相關(guān)的生物體，或者來自與營養(yǎng)性多肽同源的在系統(tǒng)發(fā)生方面不同的生物體的所有直系同源物的公開，諸如30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％類似，或可為70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一的。營養(yǎng)性多肽片段、營養(yǎng)性多肽長度。在本文的一些實施方案中，營養(yǎng)性多肽含有可食用物種多肽的片段。在一些實施方案中，片段包含至少25個氨基酸。在一些實施方案中，片段包含至少50個氨基酸。在一些實施方案中，片段由至少25個氨基酸組成。在一些實施方案中，片段由至少50個氨基酸組成。在一些實施方案中，提供一種分離的重組蛋白。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，并且所述第一多肽序列包括可食用物種蛋白質(zhì)的具有至少25或至少50個氨基酸的片段。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)是分離的。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)是重組的。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包括可食用物種蛋白質(zhì)的具有至少50個氨基酸的片段。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)是分離的重組蛋白。在一些實施方案中，本文公開的分離的重組蛋白以非分離和/或非重組形式提供。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含10至5,000個氨基酸、20-2,000個氨基酸、20-1,000個氨基酸、20-500個氨基酸、20-250個氨基酸、20-200個氨基酸、20-150個氨基酸、20-100個氨基酸、20-40個氨基酸、30-50個氨基酸、40-60個氨基酸、50-70個氨基酸、60-80個氨基酸、70-90個氨基酸、80-100個氨基酸、至少10個氨基酸、至少11個氨基酸、至少12個氨基酸、至少13個氨基酸、至少14個氨基酸、至少15個氨基酸、至少16個氨基酸、至少17個氨基酸、至少18個氨基酸、至少19個氨基酸、至少20個氨基酸、至少21個氨基酸、至少22個氨基酸、至少23個氨基酸、至少24個氨基酸、至少25個氨基酸、至少30個氨基酸、至少35個氨基酸、至少40個氨基酸、至少45個氨基酸、至少50個氨基酸、至少55個氨基酸、至少60個氨基酸、至少65個氨基酸、至少70個氨基酸、至少75個氨基酸、至少80個氨基酸、至少85個氨基酸、至少90個氨基酸、至少95個氨基酸、至少100個氨基酸、至少105個氨基酸、至少110個氨基酸、至少115個氨基酸、至少120個氨基酸、至少125個氨基酸、至少130個氨基酸、至少135個氨基酸、至少140個氨基酸、至少145個氨基酸、至少150個氨基酸、至少155個氨基酸、至少160個氨基酸、至少165個氨基酸、至少170個氨基酸、至少175個氨基酸、至少180個氨基酸、至少185個氨基酸、至少190個氨基酸、至少195個氨基酸、至少200個氨基酸、至少205個氨基酸、至少210個氨基酸、至少215個氨基酸、至少220個氨基酸、至少225個氨基酸、至少230個氨基酸、至少235個氨基酸、至少240個氨基酸、至少245個氨基酸或至少250個氨基酸。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)由20至5,000個氨基酸、20-2,000個氨基酸、20-1,000個氨基酸、20-500個氨基酸、20-250個氨基酸、20-200個氨基酸、20-150個氨基酸、20-100個氨基酸、20-40個氨基酸、30-50個氨基酸、40-60個氨基酸、50-70個氨基酸、60-80個氨基酸、70-90個氨基酸、80-100個氨基酸、至少25個氨基酸、至少30個氨基酸、至少35個氨基酸、至少40個氨基酸、至少2455個氨基酸、至少50個氨基酸、至少55個氨基酸、至少60個氨基酸、至少65個氨基酸、至少70個氨基酸、至少75個氨基酸、至少80個氨基酸、至少85個氨基酸、至少90個氨基酸、至少95個氨基酸、至少100個氨基酸、至少105個氨基酸、至少110個氨基酸、至少115個氨基酸、至少120個氨基酸、至少125個氨基酸、至少130個氨基酸、至少135個氨基酸、至少140個氨基酸、至少145個氨基酸、至少150個氨基酸、至少155個氨基酸、至少160個氨基酸、至少165個氨基酸、至少170個氨基酸、至少175個氨基酸、至少180個氨基酸、至少185個氨基酸、至少190個氨基酸、至少195個氨基酸、至少200個氨基酸、至少205個氨基酸、至少210個氨基酸、至少215個氨基酸、至少220個氨基酸、至少225個氨基酸、至少230個氨基酸、至少235個氨基酸、至少240個氨基酸、至少245個氨基酸或至少250個氨基酸組成。在一些方面，蛋白質(zhì)或其片段包括至少兩個結(jié)構(gòu)域：第一結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)構(gòu)域。兩個結(jié)構(gòu)域中的一個可包括必要時可被移除的標簽結(jié)構(gòu)域。各結(jié)構(gòu)域的長度可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25個或大于25個氨基酸。舉例來說，第一結(jié)構(gòu)域可為長度是18個氨基酸的目標多肽，而第二結(jié)構(gòu)域可為長度是7個氨基酸的標簽結(jié)構(gòu)域。作為另一實例，第一結(jié)構(gòu)域可為長度是17個氨基酸的目標多肽，而第二結(jié)構(gòu)域可為長度是8個氨基酸的標簽結(jié)構(gòu)域。在本文的一些實施方案中，選擇以及任選分離可食用物種多肽的片段。在一些實施方案中，片段包含至少25個氨基酸。在一些實施方案中，片段包含至少50個氨基酸。在一些實施方案中，片段由至少25個氨基酸組成。在一些實施方案中，片段由至少50個氨基酸組成。在一些實施方案中，提供一種分離的重組蛋白。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，并且所述第一多肽序列包括可食用物種蛋白質(zhì)的具有至少25或至少50個氨基酸的片段。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)是分離的。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)是重組的。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含第一多肽序列，所述第一多肽序列包括可食用物種蛋白質(zhì)的具有至少50個氨基酸的片段。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)是分離的重組蛋白。在一些實施方案中，本文公開的分離的營養(yǎng)性多肽以非分離和/或非重組形式提供。營養(yǎng)性多肽物理化學(xué)性質(zhì)?？上?。在一些方面，在由哺乳動物受試者消耗后，營養(yǎng)性多肽大致上可消化。優(yōu)選地，營養(yǎng)性多肽比至少參照多肽或參照多肽混合物或消耗性受試者的膳食中的其它多肽的一部分更易于消化。如本文所用，“大致上可消化”可通過在消耗后測量營養(yǎng)性多肽的半衰期來說明。舉例來說，如果營養(yǎng)性多肽在人受試者的胃腸道中的半衰期小于60分鐘或小于50、40、30、20、15、10、5、4、3、2分鐘或1分鐘，那么它較易于消化。在某些實施方案中，以提供消化增強的制劑形式提供營養(yǎng)性多肽；例如提供不含其它多肽或其它物質(zhì)的營養(yǎng)性多肽。在一些實施方案中，營養(yǎng)性多肽含有一個或多個供一種或多種內(nèi)肽酶使用的識別位點。在一特定實施方案中，營養(yǎng)性多肽含有分泌前導(dǎo)(或促分泌前導(dǎo))序列，其接著從營養(yǎng)性多肽裂解。如本文所提供，營養(yǎng)性多肽涵蓋具有或不具有信號肽和/或促分泌前導(dǎo)序列的多肽。在一些實施方案中，營養(yǎng)性多肽易受一種或多種外肽酶的裂解。消化測定可消化性是與蛋白質(zhì)的益處和效用相關(guān)的參數(shù)。與相對消化完全性相關(guān)的信息可充當肽生物可用度的預(yù)測因子(daniel,h.,2003.molecularandintegrativephysiologyofintestinalpeptidetransport.annualreviewofphysiology,第66卷,第361-384頁)。在一些實施方案中，篩選本文公開的蛋白質(zhì)以評估它們的可消化性。可通過本領(lǐng)域中已知的任何適合方法來評估蛋白質(zhì)的可消化性。在一些實施方案中，可消化性是通過包括一個或兩個蛋白質(zhì)消化階段(即模擬胃消化和模擬腸消化)的生理相關(guān)體外消化反應(yīng)來評估(參見例如moreno等,2005.stabilityofthemajorallergenbrazilnut2salbumin(bere1)tophysiologicallyrelevantinvitrogastrointestinaldigestion.febsjournal,第341-352頁；martos,g.,contreras,p.,molina,e.和lopez-fandino,r.,2010.eggwhiteovalbumindigestionmimickingphysiologicalconditions.journalofagriculturalandfoodchemistry,第5640-5648頁；moreno,f.j.,mackie,a.r.和claremills,e.n.,2005).phospholipidinteractionsprotectthemilkallergena-lactalbuminfromproteolysisduringinvitrodigestion.journalofagriculturalandfoodchemistry,第9810-9816頁)。簡要來說，使測試蛋白質(zhì)依序暴露于模擬胃液(sgf)120分鐘(使90％液體餐食自胃傳至小腸所花費的時長；參見kong,f.和singh,r.p.,2008.disintegrationofsolidfoodsinhumanstomach.journaloffoodscience,第67-80頁)，接著轉(zhuǎn)移至模擬十二指腸液(sdf)中以再消化120分鐘。通過電泳(例如芯片電泳或sds-page)分析不同消化階段(例如2、5、15、30、60和120分鐘)的樣品以監(jiān)測完整蛋白質(zhì)以及任何大型消化片段(例如大于4kda)的大小和數(shù)量。蛋白質(zhì)隨時間消失指示蛋白質(zhì)在測定中被消化的速率。通過監(jiān)測隨時間觀察到的完整蛋白質(zhì)的量，計算sgf消化半衰期(τ1/2)，并且如果在用sgf處理之后檢測到完整蛋白質(zhì)，那么計算sif消化τ1/2。這個測定可用于評估比較可消化性(即相對于諸如乳清的基準蛋白質(zhì))或評估絕對可消化性。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)的可消化性高于(即sgfτ1/2和/或sifτ1/2較短)乳清蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)的sgfτ1/2是30分鐘或小于30分鐘、20分鐘或小于20分鐘、15分鐘或小于15分鐘、10分鐘或小于10分鐘、5分鐘或小于5分鐘、4分鐘或小于4分鐘、3分鐘或小于3分鐘、2分鐘或小于2分鐘、或1分鐘或小于1分鐘。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)的sifτ1/2是30分鐘或小于30分鐘、20分鐘或小于20分鐘、15分鐘或小于15分鐘、10分鐘或小于10分鐘、5分鐘或小于5分鐘、4分鐘或小于4分鐘、3分鐘或小于3分鐘、2分鐘或小于2分鐘、或1分鐘或小于1分鐘。在一些實施方案中，截至2分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘或120分鐘，在sgf測定和sif測定中的一者或兩者中不可檢測到蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，在sgf和sif中的一者或兩者中，蛋白質(zhì)在恒定速率下和/或在控制速率下被消化。在所述實施方案中，可不使蛋白質(zhì)的消化速率優(yōu)化以達成最高可能的消化速率。在所述實施方案中，相較于在sgf和sif中的一者或兩者中在較快初始速率下消化的具有類似氨基酸組成的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在由哺乳動物攝取之后的吸收速率可較慢，并且在攝取之后進行吸收所歷經(jīng)的總時期可較長。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)在sgf中被完全或大致上完全消化。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)大致上未由sgf消化或未由sgf消化；在大多數(shù)所述實施方案中，蛋白質(zhì)在sif中被消化。評估蛋白質(zhì)可消化性也可提供對蛋白質(zhì)的潛在過敏原性的了解，因為對消化性蛋白酶具有抗性的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的大片段可具有導(dǎo)致過敏原性反應(yīng)的較高風(fēng)險(goodman,r.e.等,2008.allergenicityassessmentofgeneticallymodifiedcrops-whatmakessense？naturebiotechnology,第73-81頁)。為檢測和鑒定太小以致不能進行芯片電泳分析的肽，可使用液相色譜法和質(zhì)譜測定法。在sgf樣品中，可通過lc/ms直接檢測和鑒定肽。sif蛋白質(zhì)消化可需要在通過lc/ms檢測和鑒定之前進行純化以移除膽汁酸。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)的可消化性是通過鑒定和定量蛋白質(zhì)氨基酸序列中的消化性蛋白酶識別位點來評估。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含至少一個選自胃蛋白酶識別位點、胰蛋白酶識別位點和胰凝乳蛋白酶識別位點的蛋白酶識別位點。如本文所用，“胃蛋白酶識別位點”是多肽序列中以實驗方式顯示由胃蛋白酶裂解的任何位點。在一些實施方案中，所述位點是在選自phe、trp、tyr、leu、ala、glu和gln的氨基酸殘基之后(即下游)的肽鍵，前提是隨后殘基不是選自ala、gly和val的氨基酸殘基。如本文所用，“胰蛋白酶識別位點”是多肽序列中以實驗方式顯示由胰蛋白酶裂解的任何位點。在一些實施方案中，所述位點是在選自lys或arg的氨基酸殘基之后的肽鍵，前提是隨后殘基不是脯氨酸。如本文所用，“胰凝乳蛋白酶識別位點”是多肽序列中以實驗方式顯示由胰凝乳蛋白酶裂解的任何位點。在一些實施方案中，所述位點是在選自phe、trp、tyr和leu的氨基酸殘基之后的肽鍵。相較于在不存在二硫鍵下將達成的消化速率，蛋白質(zhì)中的二硫鍵鍵合的半胱氨酸殘基傾向于降低蛋白質(zhì)的消化速率。舉例來說，已顯示當?shù)鞍踪|(zhì)b-乳球蛋白的二硫橋鍵被裂解時，它的消化速率增加(i.m.reddy,n.k.d.kella和j.e.kinsella.“structuralandconformationalbasisoftheresistanceofb-lactoglobulintopepticandchymotrypticdigestion”.j.agric.foodchem.1988,36,737-741)。因此，二硫鍵較少的蛋白質(zhì)的可消化性傾向于高于二硫鍵的數(shù)目較大的類似蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，篩選本文公開的蛋白質(zhì)以鑒定各蛋白質(zhì)中存在的半胱氨酸殘基的數(shù)目，并且特定來說以允許選擇包含相對較低數(shù)目的半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)。舉例來說，可鑒定不包含cys殘基或包含相對較低數(shù)目的cys殘基，諸如10個或少于10個cys殘基、9個或少于9個cys殘基、8個或少于8個cys殘基、7個或少于7個cys殘基、6個或少于6個cys殘基、5個或少于5個cys殘基、4個或少于4個cys殘基、3個或少于3個cys殘基、2個或少于2個cys殘基、1個cys殘基，或不包含cys殘基的可食用物種蛋白質(zhì)或片段。在一些實施方案中，通過缺失和/或通過用另一氨基酸取代來移除可食用物種蛋白質(zhì)或其片段中的一個或多個cys殘基。在一些實施方案中，缺失或置換1個cys殘基，缺失或置換1個或大于1個cys殘基，缺失或置換2個或大于2個cys殘基，缺失或置換3個或大于3個cys殘基，缺失或置換4個或大于4個cys殘基，缺失或置換5個或大于5個cys殘基，缺失或置換6個或大于6個cys殘基，缺失或置換7個或大于7個cys殘基，缺失或置換8個或大于8個cys殘基，缺失或置換9個或大于9個cys殘基，或缺失或置換10個或大于10個cys殘基。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)包含的cys殘基與總氨基酸殘基的比率等于或低于5％、4％、3％、2％或1％。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含10個或少于10個cys殘基、9個或少于9個cys殘基、8個或少于8個cys殘基、7個或少于7個cys殘基、6個或少于6個cys殘基、5個或少于5個cys殘基、4個或少于4個cys殘基、3個或少于3個cys殘基、2個或少于2個cys殘基、1個cys殘基，或不包含cys殘基。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含1個或少于1個cys殘基。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)不包含cys殘基?；蛘呋虼送?，可移除存在于或可存在于蛋白質(zhì)中的二硫鍵。可使用化學(xué)方法，通過用諸如β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇(dtt)或三(2-羧乙基)膦(tcep)的還原劑將二硫化物還原成兩個硫醇基團來移除二硫化物。硫醇可接著用諸如碘乙酰胺、n-乙基順丁烯二酰亞胺或亞硫酸鈉的試劑共價修飾或“加帽”(參見例如crankshaw,m.w.和grant,g.a.2001.modificationofcysteine.currentprotocolsinproteinscience.15.1.1–15.1.18)。粘度被調(diào)節(jié)的營養(yǎng)性多肽和營養(yǎng)性多肽制劑。本文公開含有粘度調(diào)節(jié)性營養(yǎng)性多肽的組合物、制劑和食物產(chǎn)品。在一個方面，提供大致上不含非可食產(chǎn)品的制劑，其含有以營養(yǎng)量存在的營養(yǎng)性多肽，并且營養(yǎng)性多肽使食物產(chǎn)品的粘度降低。在一些實施方案中，營養(yǎng)性多肽以約10g/l存在，并且制劑的粘度是在25℃下約1,000mpas至約10,000mpas，諸如在25℃下約2,500mpas至約5,000mpas。制劑被并入具有超過缺乏營養(yǎng)性多肽的類似食物產(chǎn)品的優(yōu)勢的食物產(chǎn)品中，或制劑被并入諸如飲料產(chǎn)品或動物飼料產(chǎn)品的其它產(chǎn)品中。舉例來說，相較于不具有營養(yǎng)性多肽的食物產(chǎn)品，所述食物產(chǎn)品具有降低的脂肪含量、降低的糖含量和/或降低的卡路里含量。優(yōu)選地，營養(yǎng)性多肽存在于食物產(chǎn)品中以使消耗營養(yǎng)量的食物產(chǎn)品具有飽足性。在本發(fā)明的一實施方案中，明膠(一種動物源性物質(zhì))被含有一種或多種營養(yǎng)性多肽的非動物源性產(chǎn)品替換。通常，營養(yǎng)性多肽以有效替換產(chǎn)品中的明膠的量存在。明膠替換物被并入食物產(chǎn)品、飲料產(chǎn)品或動物飼料產(chǎn)品中，并且制劑大致上不含非可食產(chǎn)品。也提供含有以功能量和/或營養(yǎng)量存在，使食物或飲料產(chǎn)品的粘度增加的營養(yǎng)性多肽的制劑，諸如并入食物產(chǎn)品中的含有粘度增加性營養(yǎng)性多肽的制劑，所述食物產(chǎn)品具有超過缺乏營養(yǎng)性多肽的類似食物產(chǎn)品的優(yōu)勢。舉例來說，相較于不具有營養(yǎng)性多肽的食物產(chǎn)品，所述食物產(chǎn)品具有降低的脂肪含量、降低的糖含量和/或降低的卡路里含量。粘稠營養(yǎng)性多肽可用作在營養(yǎng)方面有利的低卡路里脂肪替代物。另外，可能需要向組合物和產(chǎn)品中添加一種或多種多糖或乳化劑，從而導(dǎo)致奶油口感進一步改進。在一些實施方案中，通過使營養(yǎng)性多肽交聯(lián)或使營養(yǎng)性多肽與存在于物質(zhì)中的其它蛋白質(zhì)交聯(lián)來增強含有營養(yǎng)性多肽的物質(zhì)的粘度。有效交聯(lián)劑的一實例是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，其使蛋白質(zhì)在賴氨酸殘基的ε-氨基與谷氨酰胺殘基的γ-甲酰胺基團之間交聯(lián)，從而形成穩(wěn)定共價鍵。通過制備轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶偶聯(lián)的營養(yǎng)性蛋白質(zhì)組合物，隨后進行凝膠強度和乳化強度測定來考查如本文所述鑒定和產(chǎn)生的營養(yǎng)性多肽的所得凝膠強度和乳化強度。根據(jù)美國專利號5,156,956的教義的源于微生物的適合轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可商購獲得。這些可商購獲得的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶通常具有約100單位的酶活性。添加至分離的營養(yǎng)性多肽中的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(具有約100單位的活性)的量表示為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃度，其是每100克分離的營養(yǎng)性多肽對應(yīng)的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶單位數(shù)。分離的營養(yǎng)性多肽含有5至95％，優(yōu)選20至80％，優(yōu)選58％至72％蛋白質(zhì)，以及也優(yōu)選62％至68％蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶濃度是每克蛋白質(zhì)至少0.15，優(yōu)選0.25，以及最優(yōu)選0.30單位轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，直至每克蛋白質(zhì)0.80，以及優(yōu)選0.65單位轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶?？墒褂酶咭约案土?。這個酶處理也可繼之以熱處理以制備含有營養(yǎng)性多肽的粘稠溶液。為產(chǎn)生含有交聯(lián)的營養(yǎng)性多肽樣品，使樣品與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液在ph7.0下混合以給出酶與蛋白質(zhì)重量比1:25。在大多數(shù)實驗中，在40℃下進行酶催化的交聯(lián)反應(yīng)。振蕩剪切測量可用于探究營養(yǎng)性多肽的流變性質(zhì)。此外，為測定營養(yǎng)性多肽溶液和凝膠的粘度，通過動態(tài)振蕩流變測定法來探究粘彈性。將營養(yǎng)性多肽溶液或含有轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的營養(yǎng)性多肽溶液的2ml樣品傾入流變儀的couette型圓柱池(內(nèi)徑2.5cm，外徑2.75cm)中，并且用低粘度硅油薄層覆蓋以防止蒸發(fā)。對于存在酶的樣品，通過在40℃下孵育來原位誘導(dǎo)膠凝。對于無酶的營養(yǎng)性多肽樣品，通過使樣品經(jīng)受以下熱處理過程來誘導(dǎo)膠凝：在2kmin-1的恒定速率下使溫度從40℃增加至90℃，在90℃下保持30分鐘，在1kmin-1下從90℃冷卻至30℃，并且在30℃下保持15分鐘。一些樣品可在酶處理之后經(jīng)受這個熱處理。小變形剪切流變性質(zhì)主要在線性粘彈性方案(最大應(yīng)變幅度0.5％)中測定，其中在1hz的恒定頻率下測量儲存和損耗模量(g‘和g“)。此外，隨頻率而變(例如2×10-3至2hz)來進行一些小變形測量，并且在多達接近100％的應(yīng)變下進行一些大變形測量。用于維持和提高肌肉質(zhì)量、強度和性能的營養(yǎng)性多肽提供適用于維持和提高肌肉質(zhì)量、強度和性能，以及治療和預(yù)防肌肉損耗疾病的營養(yǎng)性多肽以及含有營養(yǎng)性多肽的組合物和制劑。營養(yǎng)性多肽也適用于治療和預(yù)防受試者的肌肉質(zhì)量和肌肉功能的損失。此外，營養(yǎng)性多肽進一步適用于降低或防止治療性或防治性疾病方案的副作用(其意指藥物制劑或醫(yī)學(xué)治療的通常不合需要的繼發(fā)性作用)，因為除導(dǎo)致肌肉質(zhì)量和肌肉功能損失之外，所述方案也可導(dǎo)致氨基酸為受試者的可用性降低。此外，營養(yǎng)性多肽適用于治療和預(yù)防由于損傷或?qū)е录∪鈸p耗的其它非疾病狀況的肌肉損耗。氨基酸藥理學(xué)。氨基酸是含有氨基與酸基團兩者的有機分子。除甘氨酸之外，所有氨基酸都具有不對稱碳，并且除脯氨酸之外，所有蛋白質(zhì)氨基酸都具有結(jié)合于羧基和伯氨基的α碳。由于它們的側(cè)鏈不同，氨基酸展現(xiàn)一定范圍的不同生物化學(xué)性質(zhì)和生物功能。除谷氨酰胺和半胱氨酸之外，它們在溶液中在生理ph下是穩(wěn)定的。在一些蛋白質(zhì)的情形下，視宿主和翻譯機構(gòu)而定，氨基酸可經(jīng)受翻譯后修飾。這可對它們的生物可用度、代謝功能和體內(nèi)生物活性具有顯著影響。在翻譯后附接于蛋白質(zhì)的糖部分可通過影響氨基酸和包埋肽的胃腸釋放來降低營養(yǎng)性蛋白質(zhì)的適用性。將相同蛋白質(zhì)的糖基化形式和非糖基化形式的消化進行比較顯示非糖基化形式比糖基化形式更快速被消化(我們的數(shù)據(jù))。盡管在自然界中存在超過300種氨基酸，但20種充當?shù)鞍踪|(zhì)中的構(gòu)筑嵌段。非蛋白質(zhì)α-aa和非αaa是這20種蛋白質(zhì)氨基酸的直接產(chǎn)物，并且在細胞代謝方面起重大作用。由于氨基酸分解代謝的驅(qū)動氨基酸之間相互轉(zhuǎn)化的代謝反應(yīng)，20種標準蛋白質(zhì)氨基酸中的一子組11種氨基酸被視為是人非必需的，因為它們在體內(nèi)可從其它代謝物(氨基酸、酮等)合成：丙氨酸；精氨酸；天冬酰胺；天冬氨酸；半胱氨酸；谷氨酸；谷氨酰胺；甘氨酸；脯氨酸；絲氨酸；和酪氨酸。精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸和酪氨酸被視為是條件性必需的，因為它們通常不于膳食中被使用，并且在特定群體中不以足量合成來滿足當利用速率高于合成速率時的最優(yōu)需要。然而，當考慮氨基酸是否真正是非必需的或在某一群體中可為條件性必需的時，可考慮諸如繁殖、疾病預(yù)防或代謝異常的功能性需要。稱為必需氨基酸的其它9種蛋白質(zhì)氨基酸以食物形式獲取，因為它們的碳骨骼不由身體重新合成來滿足最優(yōu)代謝需求：組氨酸；異亮氨酸；亮氨酸；賴氨酸；甲硫氨酸；苯丙氨酸；蘇氨酸；色氨酸；和纈氨酸。所有20種蛋白質(zhì)氨基酸(和非蛋白質(zhì)代謝物)都用于達成正常細胞功能性，并且通過改變單一氨基酸的可用性來驅(qū)動的代謝轉(zhuǎn)變可影響全身體內(nèi)平衡和生長。另外，氨基酸充當用于維持、生長、繁殖、免疫的關(guān)鍵代謝路徑的信號傳導(dǎo)分子和調(diào)控劑。在體內(nèi)，骨骼肌由于它占身體質(zhì)量組成的大部分(約40-45％)而代表游離氨基酸與蛋白質(zhì)結(jié)合的氨基酸兩者的最大儲庫。小腸是用于氨基酸分解代謝的另一重要部位，其支配膳食性氨基酸的首過代謝以及向門靜脈中和向外周血漿中的進入。膳食中30-50％的eaa可由小腸在首過代謝中分解代謝。腸粘膜中高活性的bcaa轉(zhuǎn)氨酶導(dǎo)致bcaa轉(zhuǎn)化成支鏈α-酮酸以為腸上皮細胞提供能量，這與骨骼肌中所進行的類似。肌肉和小腸代謝的生理狀態(tài)的差異會全身性大幅牽涉人中各組織的氨基酸生物作用。除甘氨酸(非手性)之外，氨基酸可以l-亞型與d-亞型兩者存在。除由于它的硫原子在側(cè)鏈的第二位置處的半胱氨酸(d-cys)之外，蛋白質(zhì)中幾乎所有氨基酸都以l-亞型存在，除非另外被酶促翻譯后修飾或化學(xué)處理以達成儲存或烹調(diào)目的。除d-arg、d-cys、d-his、d-lys和d-thr之外的大多數(shù)d-氨基酸可由d-aa氧化酶和轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化成l手性。為被分解代謝，這些d對映異構(gòu)體被跨越質(zhì)膜和其它生物膜轉(zhuǎn)運，并且經(jīng)受d-氧化或使氨基酸脫氨基以轉(zhuǎn)化成它的α-酮酸，或經(jīng)受外消旋化以使d-aa轉(zhuǎn)化成它的l-亞型。d-異構(gòu)體的轉(zhuǎn)運受限于l-aa轉(zhuǎn)運體對d-aa的較低親和力。出于這個原因，基于l-異構(gòu)體的摩爾數(shù)，視氨基酸和物種而定，d-aa利用效率可在20-100％的范圍內(nèi)。丙氨酸：由于丙氨酸能夠在肌肉細胞中從bcaa和丙酮酸作為葡萄糖-丙氨酸循環(huán)的一部分被合成，所以它是葡萄糖生成性非必需氨基酸。這涉及來自蛋白質(zhì)的骨骼肌自由能儲存以在肝中遠側(cè)產(chǎn)生供肝外細胞(包括免疫細胞)和組織使用的葡萄糖所依的嚴密調(diào)控過程。所引起的對葡糖異生的刺激在食物剝奪的時期期間提供呈葡萄糖形式的能量來源。丙氨酸變?yōu)橐环N用以使利用肌肉中的bcaa產(chǎn)生蛋白質(zhì)和通過肝中葡糖異生產(chǎn)生可用能量平衡的極敏感中間物。此外，丙氨酸誘導(dǎo)葡糖異生為支持不限于肌肉、肝和免疫細胞的許多組織的功能所不可缺少。然而，除充當單純中間體之外，它也直接調(diào)控這個能量平衡中的關(guān)鍵酶丙酮酸激酶的活性。丙氨酸能夠通過促進丙酮酸激酶的磷酸化，減緩糖酵解以及驅(qū)動丙酮酸向磷酸烯醇丙酮酸(pep)的逆反應(yīng)以引發(fā)葡糖異生來抑制丙酮酸激酶。高量丙氨酸如發(fā)生在空腹狀態(tài)下的atp產(chǎn)生性底物缺乏可導(dǎo)致自體吞噬和溶酶體中細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換以提供能量來源。低水平的葡萄糖生成性氨基酸(包括丙氨酸)可刺激肝自體吞噬，從而導(dǎo)致肝功能退化。當處于高脂肪膳食供食時，β細胞顯示自體吞噬增加來作為當身體對血漿葡萄糖濃度上升起反應(yīng)時對胰島素產(chǎn)生和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換需求增加的應(yīng)答。在肥胖癥中，朝向胰島素產(chǎn)生增加的這個進展是糖尿病前期的早期標志、胰島素抗性的指示、以及最終導(dǎo)致在超重個體中發(fā)生糖尿病的胰島β細胞功能性衰退的風(fēng)險因素。通過營養(yǎng)作用來調(diào)控丙氨酸水平的能力可提供用于轉(zhuǎn)變肝和β細胞自體吞噬以擾亂超重個體中受損的胰島素代謝的強力手段。丙氨酸直接產(chǎn)生β-丙氨酸，其對泛酸(維生素b5)、輔酶a和肌肽(或它是限速性前體)的生物合成是重要的。肌肽以及其它β-丙氨酸源性二肽(其不并入蛋白質(zhì)中)卡西尼(carcinine)、鵝肌肽(anserine)和巴樂尼(balenine)充當肌肉組織中的抗氧化緩沖劑，構(gòu)成i型和ii型肌肉纖維中緩沖能力的多達20％。這個緩沖對于在糖原分解成乳酸期間維持肌肉中的組織ph是重要的。在學(xué)院運動員中進行的重量減輕/增加試驗中，顯示用β-丙氨酸進行補充會在重量減輕中防止瘦性質(zhì)量損失，并且相較于安慰劑使重量增加期間的瘦性質(zhì)量增加增大。β-丙氨酸也牽涉于減輕疲勞和增加肌肉工作量中。肌肽是抗氧化劑和過渡金屬離子螯合劑。它通過抑制高級糖化終產(chǎn)物(age)的形成來充當抗糖化劑。age在糖尿病患者血管結(jié)構(gòu)中是普遍的，并且促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。age在各種細胞類型中存在會影響細胞外結(jié)構(gòu)和功能與細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能兩者。(golden,a.等advancedglycosylationendproducts,circulation2006)。此外，age在腦中積累是衰老和退化的特征，特別是在阿爾茨海默氏病(alzheimer’sdisease)中。age積累解釋阿爾茨海默氏病的許多神經(jīng)病理學(xué)和生物化學(xué)特征，諸如蛋白質(zhì)交聯(lián)、氧化應(yīng)激和神經(jīng)元細胞死亡。由于肌肽的抗氧化性質(zhì)和抗糖化性質(zhì)的組合，所以它能夠減小細胞氧化應(yīng)激，并且抑制細胞內(nèi)形成反應(yīng)性氧物質(zhì)和反應(yīng)性氮物質(zhì)。低量丙氨酸在肥胖癥和糖尿病的狀態(tài)下，已顯示動物會展現(xiàn)降低的肝自體吞噬，從而導(dǎo)致胰島素抗性增加。自體吞噬對于維持er和細胞體內(nèi)平衡是重要的，所述體內(nèi)平衡在受應(yīng)激時可導(dǎo)致胰島素敏感性受損。在動物模型中進行高脂肪膳食供食使er受應(yīng)激，同時通過過度刺激mtorc1來導(dǎo)致肝自體吞噬受阻抑，此使糖尿病中朝向β細胞胰島素敏感性功能受損的進展加強。降低全身性丙氨酸的水平提供用以降低mtorc1活性以及恢復(fù)自體吞噬的健康水平的機會。精氨酸：精氨酸是葡萄糖生成性非必需氨基酸，其可通過谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺和脯氨酸來合成。它由哺乳動物小腸通過氧化谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸來產(chǎn)生，所述氧化產(chǎn)生鳥氨酸、瓜氨酸、精氨酸和丙氨酸。它也可通過脯氨酸氧化酶路徑由在腸上皮細胞中使脯氨酸活性降解來產(chǎn)生(連同鳥氨酸和瓜氨酸一起)。在腎和一些內(nèi)皮細胞(白細胞和平滑肌)中，精氨酸從由腸上皮細胞釋放至循環(huán)中的瓜氨酸轉(zhuǎn)化。新生兒利用大多數(shù)局部處于小腸中的游離瓜氨酸來合成精氨酸，而非全身性釋放。由于其它組織的吡咯啉-5-羧酸脫氫酶的活性降低，所以精氨酸和脯氨酸氧化被限于粘膜。高量精氨酸瓜氨酸作為由nos家族催化的反應(yīng)的副產(chǎn)物從精氨酸產(chǎn)生。已知膳食性補充精氨酸或瓜氨酸會降低作為代謝綜合征的風(fēng)險因素的血漿葡萄糖、高半胱氨酸和不對稱二甲基精氨酸水平。l-瓜氨酸使從肌肉移除乳酸加速，可能歸因于對血管張力和內(nèi)皮功能的影響。新近研究也已顯示來自西瓜汁的l-瓜氨酸提供從運動的更大程度恢復(fù)，以及較少次日酸痛。也似乎以游離形式遞送l-瓜氨酸導(dǎo)致在體外向細胞中的攝取小于在西瓜汁(其含有高水平的l-瓜氨酸)的情形下。這表明有機會遞送可將精氨酸運送至肌肉組織中以在內(nèi)皮膜處由enos轉(zhuǎn)化成瓜氨酸來改進功效的肽劑量。精氨酸是牽涉于許多信號傳導(dǎo)路徑中，以及作為一氧化氮(no)的直接前體的高度功能性氨基酸，其促進組織之間的全身性信號傳導(dǎo)以及對營養(yǎng)物代謝和免疫功能的調(diào)控。no對于正常內(nèi)皮功能和心血管健康(包括血管張力、血液動力學(xué)和血管生成)是重要的。精氨酸通過直接使β細胞的質(zhì)膜去極化，從而導(dǎo)致ca2+流入和隨后胰島素胞外分泌來刺激胰島素分泌。顯示精氨酸補充會改進內(nèi)皮依賴性松弛，這是i型和ii型糖尿病模型中心血管功能的指標。值得注意的是，在zucker糖尿病大鼠和膳食誘發(fā)性肥胖大鼠中，精氨酸補充使白色脂肪組織降低，但使棕色脂肪質(zhì)量增加。精氨酸和/或它的代謝物可增強棕色脂肪細胞的增殖、分化和功能。此外，骨骼肌質(zhì)量與全身胰島素敏感性兩者均應(yīng)答于精氨酸補充，通過涉及肌肉mtor和no信號傳導(dǎo)增加的機理而增強。驚人地，長期口服施用精氨酸使患有ii型糖尿病的肥胖成人的脂肪質(zhì)量降低(lucotti等2006)。此外，用精氨酸對常規(guī)基于玉米和大豆的膳食進行補充降低脂肪堆積，并且促進蛋白質(zhì)沉積在生長肥育豬的全身中。在人中進行的小型試探性試驗中，數(shù)據(jù)指示肥胖癥和非胰島素依賴性糖尿病患者(niddm)中的缺陷性胰島素介導(dǎo)的血管舒張可通過靜脈內(nèi)l-精氨酸來正?；?；l-精氨酸也改進健康受試者、肥胖患者和niddm患者的胰島素敏感性，從而指示不同于恢復(fù)胰島素介導(dǎo)的血管舒張的可能機理。此外，長期施用l-精氨酸改進ii型糖尿病患者的葡萄糖水平、胰島素誘導(dǎo)的肝葡萄糖產(chǎn)生、以及胰島素敏感性(piatti等2001)。尚未分離和測試富含精氨酸的肽。通過靜脈內(nèi)或口服途徑在高劑量(膳食中可用劑量的10-20倍，或在20分鐘內(nèi)以.1-.3g/kg體重給藥)下施用氨基酸可刺激激素通過內(nèi)分泌細胞從腸分泌。精氨酸是被充分研究的促泌素，其可刺激全身性釋放胰島素、生長激素、促乳激素、升糖素、孕酮和胎盤催乳激素。這個生物作用直接牽涉存在于腸中的營養(yǎng)物的消化生物作用與吸收兩者，以及通過觸發(fā)由內(nèi)分泌激素介導(dǎo)的飽腹感信號來影響能量平衡。調(diào)節(jié)這些激素的能力提供用于降低諸如肥胖癥的代謝病癥中的卡路里攝取，或者觸發(fā)肌肉損耗、肌肉減少癥和惡病質(zhì)中的食欲，以及轉(zhuǎn)變糖尿病發(fā)作中的胰島素敏感性的治療機會。精氨酸是用于以細胞特異性方式刺激mtor1磷酸化的重要信號傳導(dǎo)分子。這調(diào)控細胞蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換(自體吞噬)，并且使胰島素樣生長信號整合于各組織的蛋白質(zhì)合成引發(fā)。這個生物作用已與骨骼肌中瘦性組織質(zhì)量的生物發(fā)生、肥胖癥和胰島素抗性的疾病狀態(tài)的代謝轉(zhuǎn)變、以及衰老直接相關(guān)聯(lián)。它也是可被劫持來使快速生長的癌細胞增殖的主要信號傳導(dǎo)路徑。有證據(jù)表明在諸如病毒性感染和營養(yǎng)不良的分解代謝狀態(tài)下在小腸中，精氨酸使蛋白質(zhì)合成的水平增加，其中氨基酸水平從它們的正常吸收后狀態(tài)顯著轉(zhuǎn)變。另外，所證明的在腸上皮細胞中由精氨酸達成的mtor活化提供一種通過刺激蛋白質(zhì)合成和細胞增殖來修復(fù)腸上皮的機理。已在肌細胞中觀察到應(yīng)答于精氨酸血漿水平上升的類似合成代謝信號傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致全身和骨骼肌蛋白質(zhì)合成增加。精氨酸是維持在足以支持eaa的合成代謝作用的水平下的氨基酸。已顯示賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在添加至12.7％粗蛋白質(zhì)膳食中時不能支持增加的蛋白質(zhì)合成和全身生長，從而指示缺乏合成代謝介導(dǎo)性非必需氨基酸，包括精氨酸。精氨酸也上調(diào)與線粒體生物發(fā)生和底物氧化，刺激脂肪酸儲存物的代謝，以及降低脂肪組織質(zhì)量相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶。膳食性精氨酸的補充在由于他們的卡路里攝取增加而遭受胰島素抗性的肥胖和糖尿病前期群體中提供治療益處。同樣，刺激線粒體生物發(fā)生的能力直接牽涉衰老和使經(jīng)受氧化應(yīng)激的功能性蛋白質(zhì)和健康細胞再生的能力。確定的是膳食性缺乏蛋白質(zhì)使包括精氨酸(盡管它不被視為是必需的)的大多數(shù)氨基酸的可用性降低。已知精氨酸缺乏會導(dǎo)致在9天之后精子計數(shù)降低90％，從而使非活動精子的比例增加10倍。已在動物中證明精氨酸補充會增加精液中精氨酸、脯氨酸、鳥氨酸和其它精氨酸代謝物(諸如聚胺)的水平，此與精子計數(shù)和精子活動性增加一致。在懷孕期間當胎盤生長速率達到峰值時同樣觀察到no合成和聚胺(憑借)的變化，從而指示精氨酸在妊娠期間在胎兒發(fā)育中具有作用。在早期懷孕期間，在子宮液中，精氨酸水平也應(yīng)答于特定氨基酸轉(zhuǎn)運體在胚胎處的表達而降低。在早期懷孕期間，對動物的膳食補充精氨酸已顯示胚胎存活和每窩產(chǎn)仔數(shù)增加，從而指示在妊娠期間遞送高水平的精氨酸具有重大潛力。基于對no產(chǎn)生(此可增強吞噬細胞的殺滅能力)、激素促泌素活性和刺激mtor的直接影響，精氨酸對增強免疫功能具有充分研究的影響。已知由脯氨酸氧化酶達成的脯氨酸分解代謝在哺乳動物的胎盤和小腸中具有高活性水平。這個活性指向精氨酸在腸免疫和胎盤免疫中具有關(guān)鍵作用，所述免疫兩者均通過產(chǎn)生對病原性細菌具有細胞毒性的h2o2以及合成精氨酸而達成。在危急性受損患者中，在6天富含精氨酸的膳食之后，白細胞計數(shù)更快速正?；?，其中在10天之后恢復(fù)至正常tnf應(yīng)答(100％改進)。在296名手術(shù)、創(chuàng)傷或敗血癥患者中進行的相對于經(jīng)腸配方來考查富含精氨酸(12.5g/l精氨酸)的制劑的臨床研究指示醫(yī)院停留期高度降低(8-10天)，并且獲得感染的頻率較大降低。對相對于經(jīng)腸配方以富含精氨酸(12.5g/l精氨酸)的配方供食的181名敗血患者的單獨臨床研究顯示菌血癥(8％對22％)、醫(yī)院感染(6％對20％)顯著減少。精氨酸也是用于合成膠原蛋白的關(guān)鍵底物?？诜a充精氨酸使健康受試者的傷口愈合和淋巴細胞免疫應(yīng)答增強。觀察到在傷口部位處膠原蛋白沉積增加2.4倍(24nmol/cm對10.1nmol/cm)，以及相對于對照，淋巴細胞增殖增加。精氨酸是n-乙?；劝彼岷铣擅傅淖儤?gòu)活化劑，所述合成酶是在線粒體中使谷氨酸和乙?；?輔酶a轉(zhuǎn)化成n-乙酰基谷氨酸的酶。這將肝尿素循環(huán)推向適用于氨解毒的活性狀態(tài)。這意味著膳食性遞送具有低劑量的精氨酸的營養(yǎng)物可適用于其中患者奮力從他們的循環(huán)中清除尿素的腎病的情形。從可用氮源消除精氨酸以限制尿毒癥，同時能夠維持有限蛋白質(zhì)攝取以防止組織分解代謝是一種針對腎病的破壞性營養(yǎng)后果的新型策略。精氨酸上調(diào)gtp環(huán)水解酶-i的活性，從而使四氫生物蝶呤(thb)釋放以達成no合成以及由芳族氨基酸羥化酶(aaah)使芳族氨基酸(araa)羥基化。出于這個原因，遞送高水平的精氨酸以提升細胞thb水平會直接刺激cns毛細血管內(nèi)皮細胞中許多神經(jīng)遞質(zhì)的生物合成。araa充當用于生物合成單胺神經(jīng)遞質(zhì)的前體，所述神經(jīng)遞質(zhì)包括褪黑素、多巴胺、去甲腎上腺素(norepinephrine/noradrenaline)和腎上腺素(epinephrine/adrenaline)。低量精氨酸過量精氨酸攝取，從而刺激在血液中產(chǎn)生高水平的no可導(dǎo)致細胞的氧化損傷和凋亡。精氨酸過度或耗竭會影響哺乳動物肝細胞中的整體基因表達。使用體外模型，耗竭導(dǎo)致1419種基因的表達顯著(p<0.05)改變，其中使用9因素生物信息學(xué)分析，56種基因顯示至少2倍變化。大多數(shù)在表達方面升高，包括多種生長、存活和應(yīng)激相關(guān)的基因，諸如gadd45、ta1/lat1以及卡斯帕酶(caspase)11和12。許多在腔性er應(yīng)激應(yīng)答方面是相關(guān)的。ldlr，作為膽固醇和類固醇生物合成的調(diào)控子，也應(yīng)答于精氨酸耗竭而被調(diào)節(jié)。與精氨酸影響基因表達一致，膳食性精氨酸補充上調(diào)抗氧化基因，并且降低促炎性基因在脂肪和小腸組織中的表達。較低精氨酸水平抑制神經(jīng)遞質(zhì)生物合成，此已在諸如躁狂癥、帕金森病(parkinson)和運動障礙的適應(yīng)癥中顯示臨床功效。天冬酰胺：天冬酰胺是葡萄糖生成性非必需氨基酸，其前體是草酰乙酸(oaa)，并且其由轉(zhuǎn)氨酶通過谷氨酰胺和天冬氨酸來合成。它用于達成諸如成淋巴細胞的一些贅生性細胞的功能。天冬酰胺通常位于蛋白質(zhì)的α螺旋的末端，并且提供n連接的糖基化的重要位點以添加碳水化合物鏈，此影響對氨基酸攝取的免疫應(yīng)答。在許多植物源性食物中，通過天冬酰胺與葡萄糖和果糖的羰基之間的熱誘導(dǎo)反應(yīng)形成丙烯酰胺。丙烯酰胺是可具有細胞毒性，導(dǎo)致基因突變，并且通常影響食物品質(zhì)的氧化劑。具有低水平的天冬酰胺的組合物適用于制備可經(jīng)受烹調(diào)或非冷藏儲存條件的較安全食物產(chǎn)品。天冬氨酸：天冬氨酸是由轉(zhuǎn)氨酶通過草酰乙酸(oaa)前體合成的葡萄糖生成性非必需氨基酸。作為尿素循環(huán)的一部分，它也可從鳥氨酸和瓜氨酸(或精氨酸)產(chǎn)生，因為釋放的反丁烯二酸被轉(zhuǎn)化成蘋果酸，并且隨后再循環(huán)成oaa。天冬氨酸提供肌苷合成中的氮原子，所述肌苷是嘌呤生物合成中的前體。它也涉及于β-丙氨酸的合成中。天冬氨酸在小腸的腸上皮細胞中氧化，從而產(chǎn)生含氮產(chǎn)物鳥氨酸、瓜氨酸、精氨酸和丙氨酸。天冬氨酸是nmda受體(谷氨酸受體)的激動劑，從而釋放ca2+作為許多細胞信號傳導(dǎo)路徑中的第二信使。存在牽涉于精神分裂癥中的多巴胺能和谷氨酰胺能異常，其中nmda拮抗劑模擬精神分裂癥的一些陽性和陰性癥狀，同時攜有的腦損害風(fēng)險小于多巴胺激動劑所攜有的風(fēng)險。氯胺酮(ketamine)和pcp例如產(chǎn)生在精神分裂癥中觀察到的類似表型，其中pcp顯示代表性較小的癥狀，但類似的腦結(jié)構(gòu)變化。谷氨酸受體具有增加的功能，從而促進精神分裂癥發(fā)作。突觸后谷氨酸受體相對于突觸前谷氨酸受體的比例增加導(dǎo)致谷氨酸信號傳導(dǎo)增加。視moa和受體特異性而定，使nmda受體激動與使nmda受體拮抗兩者均已在治療阿爾茨海默氏癡呆方面顯示一定益處。因此，遞送具有高水平或低水平的天冬氨酸(其也作為nmda激動劑活性)的蛋白質(zhì)可對這個患者群體具有治療性。具有低水平的天冬氨酸的蛋白質(zhì)將可能與諸如美金剛胺(memantine)的nmda拮抗劑并肩提供協(xié)同益處。同樣，關(guān)于ly2140023的臨床試驗已將基于谷氨酸的治療證明為具有治療精神分裂癥而無以異源化學(xué)抗精神病劑觀察到的副作用的潛力。將共激動劑甘氨酸與抗精神病劑組合的類似研究顯示癥狀改進，從而表明遞送高劑量的天冬氨酸(也是nmda激動劑)將在這個患者群體中產(chǎn)生類似治療益處。天冬氨酸是酸性氨基酸，具有低pka3.9。天冬氨酸通過甲酯與苯丙氨酸呈二肽形式產(chǎn)生用作商業(yè)人工甜味劑的阿斯巴甜(aspartame)。半胱氨酸：半胱氨酸是非必需氨基酸，并且從高半胱氨酸合成，所述高半胱氨酸自身由甲硫氨酸的代謝合成。絲氨酸通過與高半胱氨酸縮合以形成胱硫醚而涉及于半胱氨酸的合成中。胱硫醚接著被脫氨基以及水解以形成半胱氨酸和α酮基丁酸。半胱氨酸的硫來自高半胱氨酸，但分子的其余部分來自初始絲氨酸殘基。在植物和原核生物中，半胱氨酸的生物合成通過不同機理而發(fā)生。半胱氨酸是至關(guān)重要的氨基酸，因為它在蛋白質(zhì)折疊中起重要作用。在半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu)，并且這些二硫鍵在分泌蛋白質(zhì)之中最為常見，其中蛋白質(zhì)暴露于見于細胞內(nèi)部中的更具氧化性條件。盡管高半胱氨酸具有益處，但具有高全身性水平是顯現(xiàn)心血管疾病的風(fēng)險因素。高半胱氨酸升高可由遺傳缺乏胱硫醚β-合成酶引起，并且過度甲硫氨酸攝取可為另一解釋?？刂萍琢虬彼釘z取以及在膳食中補充葉酸和維生素b12已用于降低高半胱氨酸水平。此外，因為半胱氨酸的可用性是限制谷胱甘肽合成的關(guān)鍵組成部分，所以膳食性補充半胱氨酸的前體n-乙?；?半胱氨酸在廣泛范圍的疾病狀態(tài)下高度有效增強免疫性。半胱氨酸經(jīng)受快速氧化以得到胱氨酸。它促進谷胱甘肽的生物合成，所述谷胱甘肽是可向諸如反應(yīng)性氧物質(zhì)(ros)自由基的不穩(wěn)定分子貢獻還原當量的強力抗氧化劑。在還原氧化性物質(zhì)之后，它可與另一反應(yīng)性谷胱甘肽形成谷胱甘肽硫化物，從而提供從細胞耗竭氧化應(yīng)激誘導(dǎo)性分子的機理(肝可維持多達5mm的濃度)。谷胱甘肽是肝中毒素的強力中和劑，并且有助于保護肝免遭毒素的損害作用。另外，這個解毒能力有助于減少肌肉衰弱，防止毛發(fā)焦枯，并且防止與這些毒素相關(guān)的輻射。因此，它有益于遭受化學(xué)物質(zhì)過敏或暴露于高水平的空氣污染者。谷胱甘肽也是inos的輔因子，允許no在arg-no路徑中最大合成。no對于正常內(nèi)皮功能和心血管健康(包括血管張力、血液動力學(xué)、血管生成)是重要的。除是谷胱甘肽的前體之外，半胱氨酸也是h2s的前體，所述h2s可誘導(dǎo)內(nèi)皮依賴性松弛，并且可進一步轉(zhuǎn)化成半胱氨酸亞磺酸鹽。半胱氨酸亞磺酸鹽可轉(zhuǎn)化成能夠降低甲硫氨酸攝取的?；撬?。甲硫氨酸過度會通過誘發(fā)高同型半胱氨酸血癥來增加顯現(xiàn)動脈粥樣硬化的風(fēng)險，因為高半胱氨酸是甲硫氨酸與半胱氨酸之間的中間體。然而，未知半胱氨酸是否直接或通過還原甲硫氨酸來降低高半胱氨酸(sebastiaanwesseling等,hypertension.2009；53:909-911)。此外，半胱氨酸是調(diào)節(jié)精氨酸-no路徑的牛磺酸的前體。?；撬峋哂腥舾蓾撛诒Ｗo作用。首先，牛磺酸能夠通過結(jié)合次氯酸來降低氧化應(yīng)激。已假設(shè)?；撬崤c線粒體轉(zhuǎn)移rna綴合，并且在這種情況下，防止形成線粒體超氧化物。另外，牛磺酸抑制血管平滑肌細胞的由高半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并且因此恢復(fù)細胞外過氧化物歧化酶的表達和分泌。谷氨酸：谷氨酸在小腸的腸上皮細胞中氧化，從而產(chǎn)生含氮產(chǎn)物鳥氨酸、瓜氨酸、精氨酸和丙氨酸。谷氨酸也調(diào)節(jié)精氨酸-no路徑。no對于正常內(nèi)皮功能和心血管健康(包括血管張力、血液動力學(xué)、血管生成)是重要的。高量谷氨酸如發(fā)生在空腹狀態(tài)下的atp產(chǎn)生性底物缺乏可導(dǎo)致自體吞噬和溶酶體中細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換以提供能量來源。低水平的葡萄糖生成性氨基酸(包括谷氨酸)可刺激肝自體吞噬，從而導(dǎo)致肝功能退化。瓜氨酸作為由nos家族催化的反應(yīng)的副產(chǎn)物從谷氨酸產(chǎn)生。已知膳食性補充瓜氨酸會降低作為代謝綜合征的風(fēng)險因素的血漿葡萄糖、高半胱氨酸和不對稱二甲基精氨酸水平。l-瓜氨酸使從肌肉移除乳酸加速，可能歸因于對血管張力和內(nèi)皮功能的影響。新近研究也已顯示來自西瓜汁的l-瓜氨酸提供從運動的更大程度恢復(fù)，以及較少次日酸痛。也似乎以游離形式遞送l-瓜氨酸導(dǎo)致在體外向細胞中的攝取小于在西瓜汁(其含有高水平的l-瓜氨酸)的情形下。這表明有機會遞送可將精氨酸運送至肌肉組織中以在內(nèi)皮膜處由enos轉(zhuǎn)化成瓜氨酸來改進功效的肽劑量。谷氨酸促進谷胱甘肽的生物合成，所述谷胱甘肽可向諸如反應(yīng)性氧物質(zhì)(ros)和自由基的不穩(wěn)定分子貢獻還原當量。在還原氧化性物質(zhì)之后，它可與另一反應(yīng)性谷胱甘肽形成谷胱甘肽二硫化物，從而提供從細胞耗竭氧化應(yīng)激誘導(dǎo)性分子的機理(在肝中維持多達5mm的高濃度)。谷胱甘肽也是inos的輔因子，允許no在arg-no路徑中最大合成。谷氨酸與共激動劑甘氨酸或絲氨酸一起是nmda受體的激動劑，從而釋放ca2+作為許多細胞信號傳導(dǎo)路徑中的第二信使。存在牽涉于精神分裂癥中的多巴胺能和谷氨酰胺能異常，其中nmda拮抗劑模擬精神分裂癥的一些陽性和陰性癥狀，同時攜有的腦損害風(fēng)險小于多巴胺激動劑所攜有的風(fēng)險。氯胺酮和pcp例如產(chǎn)生在精神分裂癥中觀察到的類似表型，其中pcp顯示代表性較小的癥狀，但類似的腦結(jié)構(gòu)變化。谷氨酸受體具有增加的功能，從而促進精神分裂癥發(fā)作。突觸后谷氨酸受體相對于突觸前谷氨酸受體的比例增加導(dǎo)致谷氨酸信號傳導(dǎo)增加。視moa和受體特異性而定，使nmda受體激動與使nmda受體拮抗兩者均已在治療阿爾茨海默氏癡呆方面顯示一定益處。因此，遞送具有高水平或低水平的谷氨酸(其也作為nmda激動劑活性)的蛋白質(zhì)可對這個患者群體具有治療性。具有低水平的谷氨酸的蛋白質(zhì)將可能與諸如美金剛胺的nmda拮抗劑并肩提供協(xié)同益處。同樣，關(guān)于ly2140023的臨床試驗已將基于谷氨酸的治療證明為具有治療精神分裂癥而無以異源化學(xué)抗精神病劑觀察到的副作用的潛力。將共激動劑甘氨酸與抗精神病劑組合的類似研究顯示癥狀改進，從而表明遞送高劑量的天冬氨酸(也是nmda激動劑)將在這個患者群體中產(chǎn)生類似治療益處。低量谷氨酸谷氨酸和乙?；?輔酶a在線粒體中轉(zhuǎn)化成n-乙?；劝彼?。這將肝尿素循環(huán)推向適用于氨解毒的活性狀態(tài)。這意味著膳食性遞送具有低劑量的谷氨酸的營養(yǎng)物可適用于其中患者奮力從他們的循環(huán)中清除尿素的腎病的情形。從可用氮源消除谷氨酸以限制尿毒癥，同時能夠維持有限蛋白質(zhì)攝取以防止組織分解代謝是一種針對腎病的破壞性營養(yǎng)后果的新型策略。谷氨酰胺：谷氨酰胺在小腸的腸上皮細胞中氧化，從而產(chǎn)生含氮產(chǎn)物鳥氨酸、瓜氨酸、精氨酸和丙氨酸。瓜氨酸作為由nos家族催化的反應(yīng)的副產(chǎn)物從谷氨酰胺產(chǎn)生。已知膳食性補充瓜氨酸會降低作為代謝綜合征的風(fēng)險因素的血漿葡萄糖、高半胱氨酸和不對稱二甲基精氨酸水平。l-瓜氨酸使從肌肉移除乳酸加速，可能歸因于對血管張力和內(nèi)皮功能的影響。新近研究也已顯示來自西瓜汁的l-瓜氨酸提供從運動的更大程度恢復(fù)，以及較少次日酸痛。也似乎以游離形式遞送l-瓜氨酸導(dǎo)致在體外向細胞中的攝取小于在西瓜汁(其含有高水平的l-瓜氨酸)的情形下。這表明有機會遞送可將精氨酸運送至肌肉組織中以在內(nèi)皮膜處由enos轉(zhuǎn)化成瓜氨酸來改進功效的肽劑量。高量谷氨酰胺谷氨酰胺是被充分研究的促泌素，其可刺激全身性釋放來自β細胞的胰島素、生長激素、促乳激素、升糖素、孕酮和胎盤催乳激素。也已顯示它會降低循環(huán)糖皮質(zhì)素和應(yīng)激激素。這個生物作用直接牽涉存在于腸中的營養(yǎng)物的消化生物作用與吸收兩者，以及通過觸發(fā)由內(nèi)分泌激素介導(dǎo)的飽腹感信號來影響能量平衡。調(diào)節(jié)這些激素的能力提供用于降低諸如肥胖癥的代謝病癥中的卡路里攝取，或者觸發(fā)肌肉損耗、肌肉減少癥和惡病質(zhì)中的食欲，以及轉(zhuǎn)變糖尿病發(fā)作中的胰島素敏感性的治療機會。膳食性谷氨酰胺補充上調(diào)抗氧化基因，并且降低促炎性基因在脂肪和小腸組織中的表達。谷氨酰胺是用于以細胞特異性方式刺激mtor1磷酸化的重要信號傳導(dǎo)分子。這調(diào)控細胞蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換(自體吞噬)，并且使胰島素樣生長信號整合于各組織的蛋白質(zhì)合成引發(fā)。這個生物作用已與骨骼肌中瘦性組織質(zhì)量的生物發(fā)生、肥胖癥和胰島素抗性的疾病狀態(tài)的代謝轉(zhuǎn)變、以及衰老直接相關(guān)聯(lián)。谷氨酰胺是維持在足以支持eaa的合成代謝作用的水平下的氨基酸。已顯示賴氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、色氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在添加至12.7％粗蛋白質(zhì)膳食中時不能支持增加的蛋白質(zhì)合成和全身生長，從而指示缺乏合成代謝介導(dǎo)性非必需氨基酸，包括谷氨酰胺。谷氨酰胺被緩慢環(huán)化成焦谷氨酸。谷氨酰胺是用于包括腸上皮細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和腫瘤的快速分裂細胞的優(yōu)選燃料來源。在膳食中補充谷氨酰胺在手術(shù)、急病、灼傷和感染中在腸完整性和免疫功能方面具有重大論證益處。12天谷氨酰胺補充(0.35g/kg)灼燒損傷研究顯示腸可滲透性降低，內(nèi)毒素水平降低，以及醫(yī)院停留時長縮短。這提供在3天之后乳果糖/甘露糖醇比率降低8.8倍對降低5.5倍以及醫(yī)院停留期減少6天。對等待手術(shù)的營養(yǎng)失調(diào)患者的2周谷氨酰胺總胃腸外營養(yǎng)(tpn)(0.23g/kg)對無谷氨酰胺tpn研究顯示無谷氨酰胺組中腸可滲透性增加。這提供在2周之后乳果糖/甘露糖醇比率增加3.6倍對0.81倍。這些改進指向在臨床中遞送高水平的谷氨酰胺以改進腸免疫性和減少菌血癥的機會。這也全身性改進淋巴細胞計數(shù)，并且減少在醫(yī)院停留期間的感染性并發(fā)癥。在具有嚴重灼燒損傷的患者中進行的谷氨酰胺補充(26g/天直至出院)研究顯示相對于富含谷氨酰胺組，在標準總經(jīng)腸營養(yǎng)(ten)組中血培養(yǎng)陽性頻率大3倍，從而顯著降低致死率。另外，谷氨酰胺補充顯示淋巴細胞計數(shù)和功能增加，hgh增加，感染性并發(fā)癥減少，醫(yī)院停留期減少，致病率降低，致死率降低，以及腸可滲透性降低。在諸如應(yīng)激、灼傷、損傷和敗血癥的分解代謝狀態(tài)下，肌肉內(nèi)谷氨酰胺水平降低。這個降低導(dǎo)致瘦性組織中的蛋白質(zhì)凈負性。已顯示向骨骼肌施用谷氨酰胺會體外增加蛋白質(zhì)合成，同時抑制分解。此外，已觀察到骨骼肌中從生理濃度(1mm谷氨酰胺)直至增高15倍的濃度的劑量依賴性。所述作用在取自小腸的粘膜細胞中被進一步證明。支鏈氨基酸都是用于谷氨酰胺合成的代謝底物，在胎兒中提供谷氨酰胺來源，增強胎盤和胎兒生長，從而表明谷氨酰胺在介導(dǎo)它們對哺乳動物中的合成代謝的影響方面具有作用。此外，已顯示谷氨酰胺水平和從血漿的可用性的時機影響亮氨酸的細胞攝取，以及隨后mtor活化的分布。細胞內(nèi)谷氨酰胺的積累用于通過谷氨酰胺/亮氨酸反向轉(zhuǎn)運體slc7a5來攝取亮氨酸。在與亮氨酸的相等比例下體外施用谷氨酰胺導(dǎo)致通過mtor更持續(xù)刺激蛋白質(zhì)合成，而在亮氨酸施用之前用谷氨酰胺使細胞致敏導(dǎo)致更快速但短暫的mtor活化(nicklin,p.等cell2009)。如發(fā)生在空腹狀態(tài)下的atp產(chǎn)生性底物缺乏可導(dǎo)致自體吞噬和溶酶體中細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換以提供能量來源。低水平的葡萄糖生成性氨基酸(包括谷氨酰胺)可刺激肝自體吞噬，從而導(dǎo)致肝功能退化。低量谷氨酰胺mtor是可被劫持來使快速生長的癌細胞增殖的主要信號傳導(dǎo)路徑，如由致癌性細胞對谷氨酰胺的優(yōu)先攝取所證實。甘氨酸：如發(fā)生在空腹狀態(tài)下的atp產(chǎn)生性底物缺乏可導(dǎo)致自體吞噬和溶酶體中細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換以提供能量來源。低水平的葡萄糖生成性氨基酸(包括甘氨酸)可刺激肝自體吞噬，從而導(dǎo)致肝功能退化。甘氨酸促進谷胱甘肽的生物合成，所述谷胱甘肽可向諸如反應(yīng)性氧物質(zhì)(ros)和自由基的不穩(wěn)定分子貢獻還原當量。在還原氧化性物質(zhì)之后，它可與另一反應(yīng)性谷胱甘肽形成谷胱甘肽二硫化物，從而提供從細胞耗竭氧化應(yīng)激誘導(dǎo)性分子的機理(在肝中維持多達5mm的高濃度)。谷胱甘肽也是inos的輔因子，允許no在arg-no路徑中最大合成。組氨酸：組氨酸是必需氨基酸，并且是肌肽的前體。肌肽是抗氧化劑和過渡金屬離子螯合劑。它通過抑制高級糖化終產(chǎn)物(age)的形成來充當抗糖化劑。age在糖尿病患者血管結(jié)構(gòu)中是普遍的，并且促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。age在各種細胞類型中存在會影響細胞外結(jié)構(gòu)和功能與細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能兩者。(golden,a.等advancedglycosylationendproducts,circulation2006)。此外，age在腦中積累是衰老和退化的特征，特別是在阿爾茨海默氏病中。age積累解釋阿爾茨海默氏病的許多神經(jīng)病理學(xué)和生物化學(xué)特征，諸如蛋白質(zhì)交聯(lián)、氧化應(yīng)激和神經(jīng)元細胞死亡。由于肌肽的抗氧化性質(zhì)和抗糖化性質(zhì)的組合，所以它能夠減小細胞氧化應(yīng)激，并且抑制細胞內(nèi)形成反應(yīng)性氧物質(zhì)和反應(yīng)性氮物質(zhì)。組氨酸具有抗氧化、消炎和抗分泌性質(zhì)。組氨酸的咪唑環(huán)能夠清除由細胞在急性炎癥性應(yīng)答期間產(chǎn)生的反應(yīng)性氧物質(zhì)(ros)。組氨酸施用會抑制細胞和組織損害中涉及的細胞因子和生長因子。組氨酸施用有助于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療，并且每日施用4.5g已用于有效治療患有重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者。已發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者具有低血清組氨酸水平，此歸因于組氨酸從血液極快速移除。低血漿組氨酸水平也已見于慢性腎衰竭患者、肥胖婦女(其中這也對氧化應(yīng)激和炎癥具有負面影響)、兒科肺炎患者、和哮喘患者中。已顯示組氨酸補充會減小胰島素抗性，降低bmi和脂肪質(zhì)量。在患有代謝綜合征的肥胖受試者中，組氨酸遏制炎癥和氧化應(yīng)激。最后，作為組胺的前體，組氨酸使血液中和腦中的組胺水平增加。低血液組胺見于精神病患者的一些躁狂、精神分裂癥、高銅和活動過度群組中。翻譯后修飾轉(zhuǎn)錄調(diào)控中涉及的蛋白質(zhì)是一種用于調(diào)控基因的機理。這個修飾可以特定方式改變蛋白質(zhì)功能。一種修飾形式是蛋白質(zhì)甲基化，其是一種最豐富的蛋白質(zhì)修飾。蛋白質(zhì)甲基化攜帶重要生物功能，包括基因調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。組氨酸在蛋白質(zhì)修飾以及最終基因調(diào)控中起作用，因為它接受通過蛋白質(zhì)甲基轉(zhuǎn)移酶從s-腺苷基甲硫氨酸轉(zhuǎn)移的甲基(young-holee和michaelr.stallcup,molendocrinol.2009年4月；23(4):425–433)。組氨酸補充可有助于治療多種疾病，包括：阿爾茨海默氏病、糖尿病、動脈粥樣硬化、婦女代謝綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和各種精神病狀況(躁狂、精神分裂癥、高銅和活動過度群組)。另外，由于組氨酸在蛋白質(zhì)修飾中的作用，它提供用以抗擊由基因去調(diào)控所致的疾病(包括癌癥)的途徑。低量組氨酸存在了解不帶電荷的trna如何變構(gòu)活化gcn2，從而導(dǎo)致與脂肪生成和蛋白質(zhì)合成以及真核生物中許多生物合成路徑相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(以下討論的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的機制。缺乏必需氨基酸的膳食在膳食引入之后數(shù)分鐘內(nèi)顯著觸發(fā)這個信號傳導(dǎo)(hao等,science2005)。已體內(nèi)顯示通過srebp-1c進行的信號傳導(dǎo)通過阻遏與脂肪生成相關(guān)的基因而對調(diào)動脂質(zhì)儲存物具有顯著影響。已顯示srebp-1c特異性作用于肝脂質(zhì)合成，并且能夠?qū)е赂沃咀冃员硇鸵约皟?nèi)臟脂肪質(zhì)量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。已顯示對于采用在缺乏組氨酸下補充1-5.4％氨基酸混合物的基本酪蛋白膳食的大鼠，缺乏組氨酸的不平衡膳食會傳導(dǎo)gcn2信號。組氨酸剝奪通過它對gcn2的作用而對srebp-1c具有影響，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪組織重量、膽固醇/甘油三酯含量和食物攝取降低。驅(qū)動脂肪質(zhì)量降低同時維持瘦性質(zhì)量在諸如肥胖癥、糖尿病和心血管健康的領(lǐng)域中提供治療機會。異亮氨酸：異亮氨酸是eaa，并且也是bcaa。異亮氨酸與其它bcaa組合用于改進罹患肝病的患者的營養(yǎng)狀態(tài)。包括異亮氨酸的bcaa充當代謝應(yīng)激的時期期間骨骼肌的燃料來源；促進蛋白質(zhì)合成，遏制蛋白質(zhì)分解代謝，并且充當葡糖異生的底物。bcaa，并且具體來說異亮氨酸，在骨骼肌中被分解代謝，并且刺激l-丙氨酸和l-谷氨酰胺的產(chǎn)生。已顯示bcaa通過在靜息人肌肉中增加蛋白質(zhì)合成的速率以及降低蛋白質(zhì)降解的速率而對蛋白質(zhì)代謝具有合成代謝作用。另外，顯示bcaa在耐力訓(xùn)練后的恢復(fù)期間在人肌肉中具有合成代謝作用。這些作用通過mtor的磷酸化以及70-kds6蛋白質(zhì)激酶(p70-kds6)和真核起始因子4e結(jié)合蛋白1的依序活化來介導(dǎo)。p70-kds6因它在調(diào)節(jié)細胞周期進展、細胞大小和細胞存活方面的作用而眾所周知。應(yīng)答于有絲分裂原刺激的p70-kds6活化上調(diào)核糖體生物合成，并且增強細胞的翻譯能力(w-lan等,amjpathol.2003年8月；163(2):591–607；e.blomstrand等,j.nutr.2006年1月136:269s-273s)。真核起始因子4e結(jié)合蛋白1是使40s核糖體亞單位向mrna的5’末端募集的多亞單位復(fù)合物的限制性組分。p70s6激酶的活化以及核糖體蛋白質(zhì)s6的隨后磷酸化與特定mrna的翻譯增強相關(guān)。在一個時間段的四頭肌肌肉抵抗訓(xùn)練期間以及之后向受試者給與bcaa顯示mtor、p70s6激酶增加，并且s6磷酸化見于訓(xùn)練之后的恢復(fù)時期中。然而，bcaa對akt或糖原合成酶激酶3(gsk-3)不存在所述作用。在不攝取bcaa下訓(xùn)練導(dǎo)致p70s6激酶的部分磷酸化而不活化所述酶，akt磷酸化降低，并且gsk-3不變化。bcaa輸注也以akt非依賴性方式增加靜息受試者的p70s6激酶磷酸化。這個mtor活性調(diào)控細胞蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換(自體吞噬)，并且使胰島素樣生長信號整合于各組織的蛋白質(zhì)合成引發(fā)。這個生物作用已與骨骼肌中瘦性組織質(zhì)量的生物發(fā)生、肥胖癥和胰島素抗性的疾病狀態(tài)的代謝轉(zhuǎn)變、以及衰老直接相關(guān)聯(lián)。異亮氨酸補充可用于改進運動表現(xiàn)和肌肉形成，防止伴隨衰老的肌肉損失，輔助罹患肝病者，支持兒童身體生長，并且改進向饑餓群體給與的食物的營養(yǎng)品質(zhì)。另外，作為l-丙氨酸和l-谷氨酰胺的前體，異亮氨酸介導(dǎo)它們的重大代謝信號傳導(dǎo)活性。低量異亮氨酸在肥胖癥和糖尿病的狀態(tài)下，已顯示動物會展現(xiàn)降低的肝自體吞噬，從而導(dǎo)致胰島素抗性增加。自體吞噬對于維持er和細胞體內(nèi)平衡是重要的，所述體內(nèi)平衡在受應(yīng)激時可導(dǎo)致胰島素敏感性受損。在動物模型中進行高脂肪膳食供食使er受應(yīng)激，同時通過過度刺激mtorc1來導(dǎo)致肝自體吞噬受阻抑，此使糖尿病中朝向β細胞胰島素敏感性功能受損的進展加強。降低全身性異亮氨酸的水平提供用以降低mtorc1活性以及恢復(fù)自體吞噬的健康水平的機會。存在了解不帶電荷的trna如何變構(gòu)活化gcn2，從而導(dǎo)致與脂肪生成和蛋白質(zhì)合成以及真核生物中許多生物合成路徑相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(以下討論的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的機制。缺乏任何eaa的膳食在膳食引入之后數(shù)分鐘內(nèi)顯著觸發(fā)這個信號傳導(dǎo)(hao等,science2005)。已體內(nèi)顯示通過srebp-1c進行的信號傳導(dǎo)通過阻遏與脂肪生成相關(guān)的基因而對調(diào)動脂質(zhì)儲存物具有顯著影響。已顯示srebp-1c特異性作用于肝脂質(zhì)合成，并且能夠?qū)е赂沃咀冃员硇鸵约皟?nèi)臟脂肪質(zhì)量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。異亮氨酸剝奪通過它對gcn2的作用而對srebp-1c具有影響，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪組織重量、膽固醇/甘油三酯含量和食物攝取降低。驅(qū)動脂肪質(zhì)量降低同時維持瘦性質(zhì)量在諸如肥胖癥、糖尿病和心血管健康的領(lǐng)域中提供治療機會。亮氨酸：亮氨酸是必需氨基酸和支鏈氨基酸。包括亮氨酸的支鏈氨基酸充當代謝應(yīng)激的時期期間骨骼肌的燃料來源；促進蛋白質(zhì)合成，遏制蛋白質(zhì)分解代謝，并且充當葡糖異生的底物。bcaa，并且包括亮氨酸，在骨骼肌中被分解代謝，并且刺激l-丙氨酸和l-谷氨酰胺的產(chǎn)生。亮氨酸通過細胞mtor信號傳導(dǎo)和基因表達以及起活化谷氨酸脫氫酶的作用來在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換的調(diào)控中起直接作用。已顯示bcaa通過在靜息人肌肉中增加蛋白質(zhì)合成的速率以及降低蛋白質(zhì)降解的速率而對蛋白質(zhì)代謝具有合成代謝作用。另外，顯示bcaa在耐力訓(xùn)練后的恢復(fù)期間在人肌肉中具有合成代謝作用。這些作用通過mtor的磷酸化以及70-kds6蛋白質(zhì)激酶(p70-kds6)和真核起始因子4e結(jié)合蛋白1的依序活化來介導(dǎo)。p70-kds6因它在調(diào)節(jié)細胞周期進展、細胞大小和細胞存活方面的作用而眾所周知。應(yīng)答于有絲分裂原刺激的p70-kds6活化上調(diào)核糖體生物合成，并且增強細胞的翻譯能力(w-lan等,amjpathol.2003年8月；163(2):591–607；e.blomstrand等,j.nutr.2006年1月136:269s-273s)。真核起始因子4e結(jié)合蛋白1是使40s核糖體亞單位向mrna的5’末端募集的多亞單位復(fù)合物的限制性組分。p70s6激酶的活化以及核糖體蛋白質(zhì)s6的隨后磷酸化與特定mrna的翻譯增強相關(guān)。在一個時間段的四頭肌肌肉抵抗訓(xùn)練期間以及之后向受試者給與bcaa顯示mtor、p70s6激酶增加，并且s6磷酸化見于訓(xùn)練之后的恢復(fù)時期中。然而，bcaa對akt或糖原合成酶激酶3(gsk-3)不存在所述作用。在不攝取bcaa下訓(xùn)練導(dǎo)致p70s6激酶的部分磷酸化而不活化所述酶，akt磷酸化降低，并且gsk-3不變化。bcaa輸注也以akt非依賴性方式增加靜息受試者的p70s6激酶磷酸化。此外，已知亮氨酸是用于以細胞特異性方式刺激mtor1磷酸化的主要信號傳導(dǎo)分子。這調(diào)控細胞蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換(自體吞噬)，并且使胰島素樣生長信號整合于各組織的蛋白質(zhì)合成引發(fā)。這個生物作用已與骨骼肌中瘦性組織質(zhì)量的生物發(fā)生、肥胖癥和胰島素抗性的疾病狀態(tài)的代謝轉(zhuǎn)變、以及衰老直接相關(guān)聯(lián)。亮氨酸是被充分研究的促泌素，其可刺激全身性釋放來自β細胞的胰島素、生長激素、促乳激素、升糖素、孕酮和胎盤催乳激素。這個生物作用直接牽涉存在于腸中的營養(yǎng)物的消化生物作用與吸收兩者，以及通過觸發(fā)由內(nèi)分泌激素介導(dǎo)的飽腹感信號來影響能量平衡。調(diào)節(jié)這些激素的能力提供用于降低諸如肥胖癥的代謝病癥中的卡路里攝取，或者觸發(fā)肌肉損耗、肌肉減少癥和惡病質(zhì)中的食欲，以及轉(zhuǎn)變糖尿病發(fā)作中的胰島素敏感性的治療機會。亮氨酸活化谷氨酸脫氫酶，其是催化谷氨酸、α-酮戊二酸和氨之間的可逆相互轉(zhuǎn)化的酶。在哺乳動物中，谷氨酸脫氫酶在肝、腎、腦和胰腺中具有高活性水平。在肝中，谷氨酸脫氫酶提供適于門靜脈周圍肝細胞中的尿素合成的氨和氨基酸比率，并且谷氨酸脫氫酶反應(yīng)似乎呈接近平衡狀態(tài)。另外，已顯示谷氨酸脫氫酶會產(chǎn)生谷氨酸以供在一小圈中心周圍肝細胞中合成谷氨酰胺，從而使得它能夠充當氨來源或氨清除劑。在腎中，谷氨酸脫氫酶起用以從谷氨酸產(chǎn)生氨以控制酸中毒的作用(c.spanaki和a.plaitakis,neurotoxres.2012年1月；21(1):117-27)。亮氨酸補充可用于改進運動表現(xiàn)和肌肉形成，防止伴隨衰老的肌肉損失，輔助罹患肝病者，支持兒童身體生長，并且改進向饑餓群體給與的食物的營養(yǎng)品質(zhì)。另外，亮氨酸在肝細胞中的尿素合成中起重要作用，并且可被給與以治療罹患導(dǎo)致他們患有高氨血癥的病狀者。最后，亮氨酸可用于治療酸中毒。低量亮氨酸在肥胖癥和糖尿病的狀態(tài)下，已顯示動物會展現(xiàn)降低的肝自體吞噬，從而導(dǎo)致胰島素抗性增加。自體吞噬對于維持er和細胞體內(nèi)平衡是重要的，所述體內(nèi)平衡在受應(yīng)激時可導(dǎo)致胰島素敏感性受損。在動物模型中進行高脂肪膳食供食使er受應(yīng)激，同時通過過度刺激mtorc1來導(dǎo)致肝自體吞噬受阻抑，此使糖尿病中朝向β細胞胰島素敏感性功能受損的進展加強。降低全身性亮氨酸的水平提供用以降低mtorc1活性以及恢復(fù)自體吞噬的健康水平的機會。mtor是可被劫持來使快速生長的癌細胞增殖的主要信號傳導(dǎo)路徑。耗竭亮氨酸可降低快速生長的細胞維持組成性mtor活化的能力。存在了解不帶電荷的trna如何變構(gòu)活化gcn2，從而導(dǎo)致與脂肪生成和蛋白質(zhì)合成以及真核生物中許多生物合成路徑相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(以下討論的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的機制。缺乏eaa的膳食在膳食引入之后數(shù)分鐘內(nèi)顯著觸發(fā)這個信號傳導(dǎo)(hao等,science2005)。已體內(nèi)顯示通過srebp-1c進行的信號傳導(dǎo)通過阻遏與脂肪生成相關(guān)的基因而對調(diào)動脂質(zhì)儲存物具有顯著影響。已顯示srebp-1c特異性作用于肝脂質(zhì)合成，并且能夠?qū)е赂沃咀冃员硇鸵约皟?nèi)臟脂肪質(zhì)量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。亮氨酸剝奪通過它對gcn2的作用而對srebp-1c具有影響，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪組織重量、膽固醇/甘油三酯含量和食物攝取降低。驅(qū)動脂肪質(zhì)量降低同時維持瘦性質(zhì)量在諸如肥胖癥、糖尿病和心血管健康的領(lǐng)域中提供治療機會。此外，亮氨酸剝奪已直接顯示上調(diào)棕色脂肪組織(bat)中的ucp1(產(chǎn)熱的直接量度)，增加能量消耗(假定由于bat中產(chǎn)熱增加)，以及通過刺激白色脂肪組織(wat)中的脂解來相應(yīng)降低脂肪質(zhì)量。ucp1上調(diào)導(dǎo)致食物攝取、體重、腹部脂肪質(zhì)量、脂肪質(zhì)量降低以及維持瘦性質(zhì)量(guo,f.thegcn2eif2alphakinaseregulatesfatty-acidhomeostasisintheliverduringdeprivationofanessentialaminoacid.cellmetab.,2007)。賴氨酸：賴氨酸是對于適當生長重要的eaa，并且在肉堿的產(chǎn)生中起至關(guān)重要作用。肉堿是在心肌中的能量產(chǎn)生中起重要作用的季胺。肉堿將游離脂肪酸轉(zhuǎn)運至線粒體中，并且在這種情況下，增加心臟中用于氧化代謝的優(yōu)選底物。另外，肉堿防止在可導(dǎo)致心室性心律不齊的缺血性事件期間發(fā)生的脂肪酸積累。因為在缺血性事件期間心肌肉堿水平快速減小，所以外源性補充肉堿會補給耗竭的心肌肉堿水平，并且改進心臟代謝和左心室功能。另外，對4個研究的分析證明相較于安慰劑，在急性心肌梗塞(ami)之后補充l-肉堿在ami之后的第一年中顯著降低左心室擴張。這是重要的，因為在ami之后對左心室擴張的預(yù)防以及對心臟功能的維護是向心臟衰竭和死亡進展的強力預(yù)測因素。另外，肉堿有助于降低膽固醇，此進一步支持心臟健康，并且有助于預(yù)防急性心肌梗塞(jamesj.dinicolantonio等,mayoclinicproceedings,2013；88,544-551)。賴氨酸補充適用于支持心臟健康，以及在缺血性事件期間防止心室性心律不齊。此外，賴氨酸補充可幫助心臟病發(fā)作患者有效恢復(fù)，并且有助于預(yù)防左心室擴張者的心臟病發(fā)作。此外，賴氨酸可用于降低高膽固醇患者的膽固醇水平。賴氨酸有助于幫助身體吸收鈣，并且降低尿中損失的鈣量。由于鈣在骨健康中的作用，賴氨酸補充有助于預(yù)防與骨質(zhì)疏松相關(guān)的骨損失。此外，l-精氨酸和賴氨酸的組合使得骨構(gòu)筑細胞更具活性，并且增強膠原蛋白的產(chǎn)生，所述膠原蛋白是對于包括以下的骨和結(jié)締組織重要的物質(zhì)：皮膚、肌腱和軟骨。賴氨酸補充適用于罹患骨質(zhì)疏松的患者和處于顯現(xiàn)骨質(zhì)疏松的風(fēng)險下者；年長者、絕經(jīng)婦女、生長兒童，由于它在膠原蛋白產(chǎn)生中的作用而適用于化妝品中，以及適用于運動員以改進韌帶完整性。賴氨酸缺乏會導(dǎo)致疲勞、惡心、眩暈、食欲不振、激動、眼充血、生長緩慢、貧血和生殖病癥。當定期采用時，賴氨酸有助于預(yù)防和遏制唇皰疹和生殖器皰疹的爆發(fā)。當以單次或多次劑量向45名患有頻繁復(fù)發(fā)性皰疹感染的患者每日給與312-1200mg賴氨酸時，從感染恢復(fù)以及對復(fù)發(fā)的遏制被證實(griffithr.s.等,dermatologica1978；156:257–267)。這是因為賴氨酸具有抗病毒作用，其通過阻斷促進單純皰疹病毒(hsv)復(fù)制的精氨酸的活性來起作用。在組織培養(yǎng)研究中，當精氨酸/賴氨酸比率有利于精氨酸時，皰疹病毒復(fù)制被增強。然而，當精氨酸/賴氨酸比率有利于賴氨酸時，病毒復(fù)制被遏制，因為hsv的細胞病原性被抑制。(griffithr.s.等,dermatologica1978；156:257–267)。已顯示相較于降低爆發(fā)的嚴重性和持續(xù)時間，口服賴氨酸更有效預(yù)防爆發(fā)。對于被hsv感染者，用賴氨酸補充膳食會遏制唇皰疹和生殖器疣的爆發(fā)，并且當定期主動采用時，極有益于預(yù)防爆發(fā)。賴氨酸調(diào)節(jié)精氨酸-no路徑。no對于正常內(nèi)皮功能和心血管健康(包括血管張力、血液動力學(xué)、血管生成)是重要的。賴氨酸是l-精氨酸轉(zhuǎn)運的天然抑制劑，并且與l-精氨酸競爭通過系統(tǒng)y+來攝取，所述系統(tǒng)是哺乳動物細胞中陽離子氨基酸的主要轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。過度一氧化氮促成與敗血癥相關(guān)的難治性低血壓，并且可因為l-賴氨酸抑制作為no合成的重要組分的精氨酸而以施用l-賴氨酸來抗擊(k.g.allman等,britishjournalofanaesthesia(1998)81:188-192)。此外，由于no從作為主要神經(jīng)退化區(qū)域的腦血管結(jié)構(gòu)、腦組織和神經(jīng)末梢釋放，所以no過度可導(dǎo)致疾病。過度no可導(dǎo)致偏頭痛、腦細胞損害，所述腦細胞損害可導(dǎo)致神經(jīng)退化性疾病，如帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓病(huntingtondisease)和肌萎縮性側(cè)索硬化。此外，由胰腺產(chǎn)生的no可損害β細胞，如1型糖尿病中所發(fā)生。賴氨酸補充適用于通過防止血管舒張來預(yù)防與敗血癥相關(guān)的低血壓。另外，賴氨酸可用于預(yù)防/治療偏頭痛，并且防止/減緩如ad、帕金森氏病、亨廷頓病和肌萎縮性側(cè)索硬化的神經(jīng)退化性疾病的進展。低量賴氨酸存在了解不帶電荷的trna如何變構(gòu)活化gcn2，從而導(dǎo)致與脂肪生成和蛋白質(zhì)合成以及真核生物中許多生物合成路徑相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(以下討論的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的機制。缺乏eaa的膳食在膳食引入之后數(shù)分鐘內(nèi)顯著觸發(fā)這個信號傳導(dǎo)(hao等,science2005)。已體內(nèi)顯示通過srebp-1c進行的信號傳導(dǎo)通過阻遏與脂肪生成相關(guān)的基因而對調(diào)動脂質(zhì)儲存物具有顯著影響。已顯示srebp-1c特異性作用于肝脂質(zhì)合成，能夠?qū)е赂沃咀冃员硇鸵约皟?nèi)臟脂肪質(zhì)量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。賴氨酸剝奪通過它對gcn2的作用而對srebp-1c具有影響，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪組織重量、膽固醇/甘油三酯含量和食物攝取降低。驅(qū)動脂肪質(zhì)量降低同時維持瘦性質(zhì)量在諸如肥胖癥、糖尿病和心血管健康的領(lǐng)域中提供治療機會。甲硫氨酸：甲硫氨酸是必需氨基酸，并且是實際上所有真核蛋白質(zhì)的合成中的引發(fā)氨基酸。甲硫氨酸是一種最具疏水性的aa。球狀蛋白質(zhì)中的大多數(shù)甲硫氨酸殘基可見于疏水性核心的內(nèi)部中。常發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸與跨膜蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中的脂質(zhì)雙層相互作用。歸因于甲硫氨酸的位置和強力抗氧化性質(zhì)，它已被視為蛋白質(zhì)中的內(nèi)源性抗氧化劑(johnt.brosnan和margarete.brosnan,j.nutr.2006年6月第136卷第6期1636s-1640s)。甲硫氨酸殘基對通過氧化酶、臭氧、過氧化氫、超氧化物、γ-輻射、金屬催化氧化、從電子傳遞鏈的“泄漏”和黃素或生物異源物質(zhì)的自氧化達成的氧化具有高易感性。一旦被氧化，甲硫氨酸殘基即轉(zhuǎn)化成甲硫氨酸亞砜，其可通過甲硫氨酸亞砜還原酶被轉(zhuǎn)化回甲硫氨酸(rodneyl.levine等,procnatlacadsciusa,1996年12月24日；93(26):15036–15040)。作為一種抗氧化劑，甲硫氨酸補充可有助于預(yù)防癌癥、退化性疾病、心臟病、肝病變和腎病變。它也可在化妝品中用于對抗uv射線對皮膚的損害。甲硫氨酸是抗脂肪肝aa，并且?guī)椭翁幚碇|(zhì)，并由此幫助防止脂肪在肝和動脈中積累，所述積累可最終導(dǎo)致向腦、心臟和腎的血流的阻塞。另外，脂肪在肝中積累會驅(qū)動稱為肝脂肪變性的病變，其可最終導(dǎo)致肝硬化。對于經(jīng)受藥物解毒的個體，甲硫氨酸補充可改進所述過程，對于采用具有毒副作用的藥物者也是如此。此外，作為抗脂肪肝aa，甲硫氨酸通過增加肝對已知幫助降低膽固醇水平的卵磷脂的產(chǎn)生來促進心臟健康。甲硫氨酸補充可預(yù)防由脂肪沉積在肝中所致的肝硬化。另外，它可通過防止脂肪沉積至動脈中，由此預(yù)防可能的心肌梗塞和中風(fēng)來促進心血管健康。此外，甲硫氨酸可幫助膽固醇水平較高者降低他們的膽固醇，從而改進心血管疾病的風(fēng)險。甲硫氨酸有助于免疫系統(tǒng)適當起作用，因為甲硫氨酸的水平升高會增加幫助改進免疫功能的?；撬嵋约案甙腚装彼岷凸入赘孰牡乃?。用于達成免疫功能的潛伏機理可涉及mtor活化、no和谷胱甘肽合成、h2s信號傳導(dǎo)和細胞細胞氧化還原態(tài)。甲硫氨酸是調(diào)節(jié)精氨酸-no路徑的?；撬岬那绑w。no對于正常內(nèi)皮功能和心血管健康(包括血管張力、血液動力學(xué)、血管生成)是重要的。甲硫氨酸也轉(zhuǎn)化成作為谷胱甘肽的前體的半胱氨酸。谷胱甘肽是肝中毒素的強力中和劑，并且有助于保護肝免遭毒素的損害作用。另外，這個解毒能力有助于減少肌肉衰弱，防止毛發(fā)焦枯，并且防止與這些毒素相關(guān)的輻射。因此，它有益于遭受化學(xué)物質(zhì)過敏或暴露于高水平的空氣污染者。甲硫氨酸可有助于免疫系統(tǒng)受損害的患者，諸如aids患者和癌癥患者。同樣，在流行性感冒季節(jié)期間，特別是對于最易感的群組，包括：年長者、兒童和妊娠婦女，它可為適用補充劑。此外，它可用于到他們將可能易感于區(qū)域性感染所處的國家旅行者。觀察到aids患者中的甲硫氨酸水平較低。這個甲硫氨酸水平降低已與導(dǎo)致如癡呆和記憶回想減弱的癥狀的神經(jīng)系統(tǒng)衰退相關(guān)聯(lián)。每天補充6克甲硫氨酸可導(dǎo)致這些患者的記憶回想改進。同樣，甲硫氨酸可有益于患有涉及神經(jīng)系統(tǒng)退化的疾病(包括阿爾茨海默氏病、als、ms和亨廷頓氏病)者。甲硫氨酸參與一碳代謝，并且由此也參與蛋白質(zhì)和dna的甲基化，此轉(zhuǎn)而幫助調(diào)控基因表達和蛋白質(zhì)的生物活性。對于處于相關(guān)遺傳病癥的風(fēng)險者，甲硫氨酸補充可用于促進所有個體的適當基因調(diào)控。低量甲硫氨酸甲硫氨酸是毒性高半胱氨酸的前體，所述高半胱氨酸通過下調(diào)體內(nèi)ddah來介導(dǎo)adma以代謝adma，從而干擾精氨酸-no路徑。no對于正常內(nèi)皮功能和心血管健康(包括血管張力、血液動力學(xué)、血管生成)是重要的。存在了解不帶電荷的trna如何變構(gòu)活化gcn2，從而導(dǎo)致與脂肪生成、蛋白質(zhì)合成以及真核生物中許多生物合成路徑相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(以下討論的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的機制。缺乏任何eea的膳食在膳食引入之后數(shù)分鐘內(nèi)顯著觸發(fā)這個信號傳導(dǎo)(hao等,science2005)。已體內(nèi)顯示通過srebp-1c進行的信號傳導(dǎo)通過阻遏與脂肪生成相關(guān)的基因而對調(diào)動脂質(zhì)儲存物具有顯著影響。已顯示srebp-1c特異性作用于肝脂質(zhì)合成，并且能夠?qū)е赂沃咀冃员硇鸵约皟?nèi)臟脂肪質(zhì)量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。甲硫氨酸剝奪通過它對gcn2的作用而對srebp-1c具有影響，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪組織重量、膽固醇/甘油三酯含量和食物攝取降低。驅(qū)動脂肪質(zhì)量降低同時維持瘦性質(zhì)量在諸如肥胖癥、糖尿病和心血管健康的領(lǐng)域中提供治療機會。苯丙氨酸：苯丙氨酸是eea、auaa和用于在腦中合成去甲腎上腺素的前體，以及是酪氨酸的代謝前體，所述酪氨酸是另一芳族氨基酸和用于合成多巴胺的前體。去甲腎上腺素(ne)由β-羥化酶以及輔因子抗壞血酸使多巴胺進行β-氧化來在交感神經(jīng)系統(tǒng)中的腎上腺髓質(zhì)和節(jié)后神經(jīng)元中合成。它通過分泌至突觸間隙中來起作用，在所述突觸間隙中，它刺激腎上腺素能受體，并且接著由周圍細胞降解或攝取。作為一種兒茶酚胺，它不跨越血腦屏障。ne可用于抗擊注意力不足/活動過度病癥(adhd)、抑郁和低血壓。就如adhd的注意力病癥而言，指定的藥物傾向于幫助增加ne和多巴胺的水平。此外，抑郁通常用抑制血清素(serotonin)和ne再攝取，由此增加腦中突觸后細胞中可用的血清素和ne的量的藥物治療。新近證據(jù)已表明血清素-去甲腎上腺素再攝取抑制劑(snri)也可增加多巴胺傳送，因為如果去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體也通常使多巴胺再循環(huán)，那么snri將也增強多巴胺能傳送。因此，也可與ne水平增加相關(guān)的抗抑郁劑作用可部分歸因于多巴胺同時增加(特定來說在腦前額皮質(zhì)中)。ne用于治療患有危急性低血壓的患者。ne是血管加壓劑，并且作用于α1腎上腺素能受體與α2腎上腺素能受體兩者以導(dǎo)致血管收縮，由此使血壓增加。作為ne的前體，苯丙氨酸可用于治療注意力病癥，如adhd和add。另外，它可用于治療罹患抑郁或創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合征者。苯丙氨酸也可用于治療抑郁或改變諸如ssri的神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)性藥物的功能。另外，由于它能夠通過增加血管張力來增加血壓，所以它可用于治療具有低血壓傾向者。此外，苯丙氨酸可用作酪氨酸水平，以及由此酪氨酸功能的上游調(diào)控劑。由于酪氨酸作為l-多巴和多巴胺的前體的作用，所以酪氨酸補充可幫助治療帕金森氏病。另外，它可用于治療患有如抑郁的情緒/精神病病癥者，以及治療成癮性。此外，它可通過增加學(xué)習(xí)困難或復(fù)雜概念或動作期間的獎賞/愉快應(yīng)答來促進學(xué)習(xí)。多巴胺，作為一種單胺兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)，在免疫系統(tǒng)中起調(diào)控作用。與存在于特定免疫效應(yīng)細胞中的特定受體相互作用的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽由免疫系統(tǒng)釋放以影響這些細胞在宿主中針對疾病和其它環(huán)境應(yīng)激的功能。已顯示多巴胺的免疫調(diào)控性作用通過存在于靶標細胞中的五種不同g蛋白偶聯(lián)受體來調(diào)控。存在這些受體的兩個廣泛類別：g1和g2，其涵蓋不同亞型。d1類別的受體包括d2和d5亞型，并且在活化后使細胞內(nèi)camp增加。d2類別的受體由d2、d3和d4亞型組成，并且已被報道在刺激后抑制細胞內(nèi)camp。多巴胺受體已見于正常人白細胞上。同樣，淋巴組織具有通過交感神經(jīng)達成的多巴胺能神經(jīng)支配，此表明多巴胺可能夠調(diào)控免疫系統(tǒng)效應(yīng)細胞(basu,sujit和sarkar,chandrani,dopamineandimmunesystem.scitopics2010)。多巴胺通過活化靜息t細胞以及抑制受刺激t細胞的活化來影響t細胞。在正常靜息外周人t淋巴細胞中，多巴胺活化d2和d3子類的受體，此轉(zhuǎn)而活化整聯(lián)蛋白(integrin)(α4β1和α5β1)。這些整聯(lián)蛋白是使細胞附著于細胞外基質(zhì)組分纖維結(jié)合蛋白(fibronectin)的異二聚跨膜糖蛋白。纖維結(jié)合蛋白用于使t細胞跨越組織屏障和血管進行遷移和外滲。此外，多巴胺通過d3受體起選擇性誘導(dǎo)cd8+t細胞遷移和歸巢的作用。此外，多巴胺通過影響由t細胞分泌細胞因子來影響t細胞。當多巴胺刺激d3和d1/d5受體時，tnf-α(一種多效性炎癥性細胞因子)的分泌被增加。當刺激d2受體時，il-10(一種消炎性細胞因子)被誘導(dǎo)分泌。然而，多巴胺可通過下調(diào)非受體酪氨酸激酶lck和fyn的表達來抑制活化的t細胞受體誘導(dǎo)的細胞增殖以及許多細胞因子(如il-2、ifn-γ和il-4)的分泌，所述激酶是在引發(fā)tcr活化方面重要的酪氨酸激酶(basu,sujit和sarkar,chandranidopamineandimmunesystem.scitopics2010)。b細胞具有極高多巴胺d2、d3和d5受體表達。多巴胺能夠抑制靜息和惡性b淋巴細胞的增殖。多巴胺通過促進周期性b細胞由于氧化應(yīng)激的凋亡來起作用。然而，尚未在靜息淋巴細胞中觀察到這個多巴胺能作用，因此表明在預(yù)防癌癥方面的作用(basu,sujit和sarkar,chandrani,dopamineandimmunesystem.scitopics2010)。酪氨酸，作為多巴胺的前體，可用于改進免疫應(yīng)答以及改進總體免疫系統(tǒng)功能性。它可向年長者、妊娠婦女、兒童和免疫功能受損害者(如aids患者和癌癥患者)提供益處。它也可向教師、旅行者和頻繁暴露于病菌的任何人給與。普遍稱為腎上腺素(adrenaline)的腎上腺素(epinephrine)是由腎上腺的髓質(zhì)分泌的激素。腎上腺素應(yīng)答于諸如恐懼或憤怒的強烈情緒而釋放，其導(dǎo)致心率、肌肉強度、血壓和糖代謝增加。它導(dǎo)致使身體準備進行困難或激烈活動的驚逃或?qū)箲?yīng)答。腎上腺素用作心臟停搏期間的刺激劑、休克期間用以增加血壓的血管收縮劑、和支氣管哮喘中的支氣管擴張劑和抗痙劑。腎上腺素不大量見于體內(nèi)，但在維持心血管體內(nèi)平衡方面極其重要，因為它能夠使血液轉(zhuǎn)向處于應(yīng)激下的組織。腎上腺素通過影響肌肉收縮來具有這個作用。當濃度比細胞中的正常值大10倍時，通過鈣調(diào)蛋白(calmodulin)與鈣結(jié)合來發(fā)生肌肉的收縮。鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物接著繼續(xù)活化肌球蛋白輕鏈激酶，其接著使lc2磷酸化，從而導(dǎo)致收縮。腎上腺素結(jié)合腎上腺素受體，此活化腺苷?；h(huán)化酶，并且從atp產(chǎn)生環(huán)狀amp。camp活化蛋白質(zhì)激酶，其由此使肌球蛋白輕鏈激酶磷酸化。這個磷酸化肌球蛋白輕鏈激酶對鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物具有較低親和力，并且因此是非活性的。因此，平滑肌組織被松馳。腎上腺素的這個作用使得它極適用于治療哮喘、心臟停搏和過敏性休克。酪氨酸，作為腎上腺素的前體，可用于處于心臟停搏的風(fēng)險下的患者、罹患哮喘者和處于過敏性休克的風(fēng)險者。腎上腺素是通過結(jié)合肝細胞的外部上的受體來分解糖原的兩種主要激素中的一種。這個結(jié)合導(dǎo)致發(fā)生構(gòu)象變化，由此允許g蛋白進行結(jié)合，并且變得具有活性。g蛋白偶聯(lián)受體的活化導(dǎo)致發(fā)生分子構(gòu)象變化，所述構(gòu)象變化導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶進行結(jié)合。一旦腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合復(fù)合物，腺苷酸環(huán)化酶即將atp分解成camp，其接著變?yōu)檫@個過程中的第二信使蛋白質(zhì)，并且活化蛋白質(zhì)激酶?；罨牡鞍踪|(zhì)激酶使磷酸化酶活化，所述磷酸化酶是催化糖原分解成葡萄糖的酶。酪氨酸，作為腎上腺素的前體，可用于通過使得葡萄糖可易于用于為運動供以燃料來改進運動表現(xiàn)。黑色素(melanin)是酪氨酸的代謝物，并且是強力抗氧化劑。另外，它在抑制炎癥性細胞因子和超氧化物的產(chǎn)生方面具有影響。當促炎性細胞因子被過度產(chǎn)生時，它介導(dǎo)如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主反應(yīng)、惡病質(zhì)和敗血癥綜合征的病理性病狀中炎癥的損害作用。已發(fā)現(xiàn)黑色素抑制正在進行的細胞因子合成，此強烈表明黑色素可適用作針對涉及促炎性細胞因子的病狀的疊加療法(mohagheghpourn.等,cellimmunol.2000年1月10日；199(1):25-36)。酪氨酸可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡病質(zhì)、敗血癥綜合征、具有與自體免疫病癥相關(guān)的炎癥者、和病理性病狀的其它炎癥性后遺癥。苯丙氨酸上調(diào)gtp環(huán)水解酶-i的活性，從而使四氫生物蝶呤(thb)釋放以達成no合成以及由芳族氨基酸羥化酶(aaah)使araa羥基化。出于這個原因，遞送高水平的苯丙氨酸以提升細胞thb水平會直接刺激cns毛細血管內(nèi)皮細胞中許多神經(jīng)遞質(zhì)的生物合成。araa充當用于生物合成單胺神經(jīng)遞質(zhì)的前體，所述神經(jīng)遞質(zhì)包括褪黑素、多巴胺、去甲腎上腺素(norepinephrine/noradrenaline)和腎上腺素(epinephrine/adrenaline)。在促進no合成方面，苯丙氨酸可用于治療高血壓，降低血壓，并且可在潛水或到高海拔旅行者的情形下用于增加血管舒張。低量苯丙氨酸存在了解不帶電荷的trna如何變構(gòu)活化gcn2，從而導(dǎo)致與脂肪生成和蛋白質(zhì)合成以及真核生物中許多生物合成路徑相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(以下討論的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的機制。缺乏任何eaa的膳食在膳食引入之后數(shù)分鐘內(nèi)顯著觸發(fā)這個信號傳導(dǎo)(hao等,science2005)。已體內(nèi)顯示通過srebp-1c進行的信號傳導(dǎo)通過阻遏與脂肪生成相關(guān)的基因而對調(diào)動脂質(zhì)儲存物具有顯著影響。已顯示srebp-1c特異性作用于肝脂質(zhì)合成，并且能夠?qū)е赂沃咀冃员硇鸵约皟?nèi)臟脂肪質(zhì)量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。苯丙氨酸剝奪通過它對gcn2的作用而對srebp-1c具有影響，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪組織重量、膽固醇/甘油三酯含量和食物攝取降低。驅(qū)動脂肪質(zhì)量降低同時維持瘦性質(zhì)量在諸如肥胖癥、糖尿病和心血管健康的領(lǐng)域中提供治療機會。脯氨酸：瓜氨酸作為由nos家族催化的反應(yīng)的副產(chǎn)物從谷氨酰胺產(chǎn)生。已知膳食性補充瓜氨酸會降低作為代謝綜合征的風(fēng)險因素的血漿葡萄糖、高半胱氨酸和不對稱二甲基精氨酸水平。l-瓜氨酸使從肌肉移除乳酸加速，可能歸因于對血管張力和內(nèi)皮功能的影響。新近研究也已顯示來自西瓜汁的l-瓜氨酸提供從運動的更大程度恢復(fù)以及較少次日酸痛。也似乎以游離形式遞送l-瓜氨酸導(dǎo)致在體外向細胞中的攝取小于在西瓜汁(其含有高水平的l-瓜氨酸)的情形下。這表明有機會遞送可將精氨酸運送至肌肉組織中以在內(nèi)皮膜處由enos轉(zhuǎn)化成瓜氨酸來改進功效的肽劑量。在懷孕期間當胎盤生長速率達到峰值時觀察到no合成和聚胺(憑借脯氨酸)的變化，從而指示精氨酸在妊娠期間在胎兒發(fā)育中具有作用。絲氨酸：絲氨酸是非必需氨基酸，并且通過3-磷酸甘油酸由糖酵解生物合成。絲氨酸在中間代謝中起至關(guān)重要作用，因為它促進磷脂、鞘脂和半胱氨酸生物合成以及細菌中色氨酸合成，并且是甘氨酸的主要來源。身體對甘氨酸具有可能超過膳食攝取量10-50倍的需要。這個需求不僅用于合成蛋白質(zhì)，特別是膠原蛋白，而且也用于甘氨酸作為以下5個主要代謝生物合成路徑的前體：肌酸、卟啉、嘌呤、膽汁酸和谷胱甘肽。另外，由于它在甘氨酸產(chǎn)生中的作用，絲氨酸也是用于生物合成嘌呤和5’-單磷酸2’脫氧胸苷以及使高半胱氨酸再甲基化成甲硫氨酸的葉酸關(guān)聯(lián)一碳單元的主要供體。重要的是應(yīng)注意對于源于絲氨酸的每個甘氨酸分子，都有一碳單元形成。(cook,r.definingthestepsofthefolateone-carbonshuffleandhomocysteinemetabolism1’2；am.jclinnutr；2000)在一碳代謝中，用于生物合成的一碳單元由稱為四氫葉酸(thf)聚谷氨酸的輔因子的家族攜帶并化學(xué)活化。thf介導(dǎo)的一碳代謝是劃分在細胞質(zhì)、線粒體和核中的相互依賴性生物合成路徑的代謝系統(tǒng)。在細胞質(zhì)中，一碳代謝用于合成嘌呤和胸苷酸，以及使高半胱氨酸再甲基化成甲硫氨酸(高半胱氨酸過于豐富可對身體有害)。在線粒體中，一碳代謝用于合成甲酰化甲硫氨?；?trna；分解代謝膽堿、嘌呤和組氨酸；以及使絲氨酸和甘氨酸相互轉(zhuǎn)化。另外，線粒體是用于細胞質(zhì)代謝的一碳單元的主要來源。葉酸介導(dǎo)的一碳代謝的破壞已與許多病變和發(fā)育異常相關(guān)聯(lián)。(j.t.fox和p.j.stover,第1章,folate‐mediatedone‐carbonmetabolism,geraldlitwack編,vitamins&hormones,academicpress,2008,第79卷,第1-44頁)。絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(shmt)在依賴于葉酸與5-磷酸吡哆醛兩者的反應(yīng)中催化絲氨酸和甘氨酸的自由可逆相互轉(zhuǎn)化。絲氨酸轉(zhuǎn)化成甘氨酸涉及移除c-3絲氨酸和形成5,10-亞甲基四氫葉酸，其可用于葉酸依賴性一碳代謝或通過10-甲?；臍淙~酸氧化成二氧化碳(robertjcook,amjclinnutr2000年12月第72卷第6期1419-1420)。絲氨酸是半胱氨酸的前體。半胱氨酸從高半胱氨酸合成，所述高半胱氨酸自身由甲硫氨酸的代謝合成。絲氨酸通過與高半胱氨酸縮合以形成胱硫醚而涉及于半胱氨酸的合成中。胱硫醚接著被脫氨基以及水解以形成半胱氨酸和α酮基丁酸。半胱氨酸的硫來自高半胱氨酸，但分子的其余部分來自初始絲氨酸殘基。在植物和原核生物中，半胱氨酸的生物合成通過不同機理而發(fā)生。半胱氨酸是至關(guān)重要的氨基酸，因為它在蛋白質(zhì)折疊中起重要作用。在半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵有助于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三級和四級結(jié)構(gòu)，并且這些二硫鍵在分泌蛋白質(zhì)之中最為常見，其中蛋白質(zhì)暴露于見于細胞內(nèi)部中的更具氧化性條件。盡管高半胱氨酸具有益處，但高水平可為顯現(xiàn)心血管疾病的風(fēng)險因素。高半胱氨酸升高可由遺傳缺乏胱硫醚β-合成酶引起，并且過度甲硫氨酸攝取可為另一解釋?？刂萍琢虬彼釘z取以及在膳食中補充葉酸和維生素b12已用于降低高半胱氨酸水平。同樣，增加絲氨酸水平以支持高半胱氨酸向半胱氨酸轉(zhuǎn)化可為有益的。n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)是腦中的一種最基本神經(jīng)遞質(zhì)。它是谷氨酸受體，并且是用于控制突觸可塑性和記憶功能的至關(guān)重要分子裝置。這個受體是谷氨酸的促離子型受體，并且特征在于對谷氨酸的親和力較高，單通道電導(dǎo)較高，鈣可滲透性較高，并且由鎂離子以電壓依賴性阻斷。為使nmda受體打開，它由谷氨酸和甘氨酸或d-絲氨酸結(jié)合。d-絲氨酸是神經(jīng)遞質(zhì)和膠質(zhì)遞質(zhì)，在腦中由絲氨酸外消旋酶從l-絲氨酸生物合成。它是使甘氨酸成為nmda受體結(jié)合位點的強力或有力激動劑。(jean-pierremothet等,procnatlacadsciusa,2000,97(9)4926-4931；zitok和scheussv.(2009)nmdareceptorfunctionandphysiologicalmodulation.encyclopediaofneuroscience(squirelr編),第6卷,第1157-1164頁.oxford:academicpress)。絲氨酸在學(xué)習(xí)和突觸可塑性方面起重要作用，因此，絲氨酸補充可適用于年長者、生長兒童、學(xué)齡兒童和經(jīng)受學(xué)習(xí)困難者。另外，它可向試圖學(xué)習(xí)新任務(wù)的任何人給與，所述新任務(wù)無論是儀器或運動員/跳舞者試圖改進或?qū)W習(xí)新運動和動作。此外，由于它作為半胱氨酸的前體的作用，它可作為用于達成半胱氨酸的作用的上游調(diào)控劑來給與。作為合成甘氨酸的前體，絲氨酸可用于化妝產(chǎn)品中以抗擊衰老，并且由于它在膠原蛋白合成中的作用而促進適當生長。此外，由于它在肌酸生物合成路徑中的作用，它可用于改進運動能力。此外，由于它在谷胱甘肽代謝路徑中的作用，它可極其適用于解毒和免疫健康中。蘇氨酸：蘇氨酸是eaa，并且是不通過轉(zhuǎn)氨酶和d-aa氧化酶轉(zhuǎn)化成它的l-異構(gòu)體的少數(shù)aa中的一個。蘇氨酸用于合成粘蛋白，所述粘蛋白用于維持腸的完整性和功能。由粘蛋白和無機鹽混懸于水中組成的粘液充當對抗與諸如胃酸和煙霧的有害物質(zhì)接觸的擴散屏障。粘液也充當用以使剪切應(yīng)力最小的潤滑劑(g.k.law等,amjphysiolgastrointestliverphysiol292:g1293-g1301,2007)。90％的膳食性蘇氨酸在腸中用于粘液合成。粘蛋白被連續(xù)合成并對腸蛋白水解極具抗性，并且因此并不極其易于被再循環(huán)。因此，大量和連貫供給蘇氨酸用于有效維持腸功能和結(jié)構(gòu)。因此，極其重要的是膳食富含蘇氨酸以防止粘液產(chǎn)生降低，此可導(dǎo)致腸中癌癥、潰瘍等(g.k.law等,amjphysiolgastrointestliverphysiol292:g1293-g1301,2007；a.hamard等,journalofnutritionalbiochemistry,2010年10月,第21卷,第10期,第914-921頁)。歸因于粘液對腸的完整性和結(jié)構(gòu)的重要性，蘇氨酸補充可適用于預(yù)防腸病癥，包括癌癥、潰瘍、感染和糜爛。蘇氨酸在體液免疫中起關(guān)鍵作用，因為蘇氨酸是由血液中的b淋巴細胞分泌的免疫球蛋白的主要組分。一旦釋放，它們即到達感染部位，識別、結(jié)合它們的抗原以及使所述抗原失活。由于免疫球蛋白的蘇氨酸含量較高，所以蘇氨酸缺乏可負面影響免疫球蛋白產(chǎn)生，并且由此降低免疫應(yīng)答。蘇氨酸補充為它在免疫應(yīng)答中的作用所必需，并且可支持白血病患者、aids患者和具有免疫缺陷的個體。另外，它可支持在流行性感冒季節(jié)期間易感于感染者，諸如年長者和小童，以及全年增強免疫應(yīng)答。低量蘇氨酸存在了解不帶電荷的trna如何變構(gòu)活化gcn2，從而導(dǎo)致與脂肪生成、蛋白質(zhì)合成以及真核生物中許多生物合成路徑相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(以下討論的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的機制。缺乏任何eaa的膳食在膳食引入之后數(shù)分鐘內(nèi)顯著觸發(fā)這個信號傳導(dǎo)(hao等,science2005)。已體內(nèi)顯示通過srebp-1c進行的信號傳導(dǎo)通過阻遏與脂肪生成相關(guān)的基因而對調(diào)動脂質(zhì)儲存物具有顯著影響。已顯示srebp-1c特異性作用于肝脂質(zhì)合成，并且能夠?qū)е赂沃咀冃员硇鸵约皟?nèi)臟脂肪質(zhì)量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。已顯示對于采用在缺乏蘇氨酸下補充1-5.4％氨基酸混合物的基本酪蛋白膳食的大鼠，缺乏蘇氨酸的不平衡膳食會傳導(dǎo)gcn2信號。蘇氨酸剝奪通過它對gcn2的作用而對srebp-1c具有影響，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪組織重量、膽固醇/甘油三酯含量和食物攝取降低。驅(qū)動脂肪質(zhì)量降低同時維持瘦性質(zhì)量在諸如肥胖癥、糖尿病和心血管健康的領(lǐng)域中提供治療機會。色氨酸：色氨酸是在免疫功能中起重要作用的eaa。舉例來說，色氨酸的濃度由于慢性肺炎癥而進行性下降。這表明通過吲哚胺2,3-雙加氧酶(ido)分解代謝色氨酸似乎對于巨噬細胞和淋巴細胞的功能極其重要。因此，鄰氨基苯甲酸(ans)抑制促炎性t輔助1細胞因子的產(chǎn)生，并且預(yù)防自體免疫神經(jīng)炎癥。色氨酸可用于處理包括關(guān)節(jié)炎和哮喘或其它自體免疫疾病的某些疾病的炎癥性效應(yīng)。它也是血清素(5-ht)合成的前體，所述血清素是影響食欲、睡眠，并且廣泛牽涉于抑郁發(fā)作中的神經(jīng)遞質(zhì)?；謴?fù)的抑郁患者(采用ssri或其它神經(jīng)遞質(zhì)再攝取抑制劑)中的5-ht活性異常導(dǎo)致對血流中低水平的色氨酸的急性敏感性。5-ht產(chǎn)生可通過口服攝取游離色氨酸而增加2倍，從而指示色氨酸施用在抑郁中具有作用。此外，由于明顯依賴于5-ht可用性來達成患者結(jié)果改進，所以色氨酸可增強ssri的作用。此外，除罹患如抑郁或pms的影響的情緒病癥者之外，色氨酸也可用于幫助重量減輕/維持，使罹患睡眠病癥者受益，從旅行和時差綜合癥恢復(fù)。低量色氨酸存在了解不帶電荷的trna如何變構(gòu)活化gcn2，從而導(dǎo)致與脂肪生成、蛋白質(zhì)合成以及真核生物中許多生物合成路徑相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(以下討論的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的機制。缺乏任何eaa的膳食在膳食引入之后數(shù)分鐘內(nèi)顯著觸發(fā)這個信號傳導(dǎo)(hao等,science2005)。已體內(nèi)顯示通過srebp-1c進行的信號傳導(dǎo)通過阻遏與脂肪生成相關(guān)的基因而對調(diào)動脂質(zhì)儲存物具有顯著影響。已顯示srebp-1c特異性作用于肝脂質(zhì)合成，并且能夠?qū)е赂沃咀冃员硇鸵约皟?nèi)臟脂肪質(zhì)量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。色氨酸剝奪通過它對gcn2的作用而對srebp-1c具有影響，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪組織重量、膽固醇/甘油三酯含量和食物攝取降低。驅(qū)動脂肪質(zhì)量降低同時維持瘦性質(zhì)量在諸如肥胖癥、糖尿病和心血管健康的領(lǐng)域中提供治療機會。酪氨酸：酪氨酸是從苯丙氨酸合成的非必需氨基酸。它用作包括腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺的許多重要神經(jīng)遞質(zhì)的前體。酪氨酸幫助產(chǎn)生黑色素，并且?guī)椭苽浜驼{(diào)控激素的器官，如腎上腺、甲狀腺和垂體腺。另外，酪氨酸涉及于體內(nèi)幾乎每種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)中。酪氨酸羥化酶使用四氫蝶啶作為輔因子或通過酪氨酸酶使l-酪氨酸轉(zhuǎn)化成左旋多巴。由酪氨酸酶介導(dǎo)的所述轉(zhuǎn)化使左旋多巴特異性氧化成多巴醌，并且左旋多巴由多巴脫羧酶進一步脫羧成多巴胺。多巴胺是極其重要的激素和神經(jīng)遞質(zhì)，并且在精神健康與身體健康兩者中起至關(guān)重要作用。多巴胺有助于控制腦的獎賞和愉快中心，有助于調(diào)控運動和情緒應(yīng)答，并且使得能夠看見獎賞并采取行動以向那些獎賞移動。含有多巴胺的神經(jīng)元簇集在稱為黑質(zhì)的區(qū)域中的中腦中。在受帕金森氏病折磨者中，這個區(qū)域中傳送多巴胺的神經(jīng)元死亡，從而導(dǎo)致不能控制身體運動。為緩和帕金森氏病的癥狀，向患者給與可被轉(zhuǎn)化成多巴胺的l-多巴。由于酪氨酸作為l-多巴和多巴胺的前體的作用，所以酪氨酸補充可幫助治療帕金森氏病。另外，它可用于治療患有如抑郁的情緒/精神病病癥者，以及治療成癮性。此外，它可通過增加學(xué)習(xí)困難或復(fù)雜概念或動作期間的獎賞/愉快應(yīng)答來促進學(xué)習(xí)。多巴胺，作為一種單胺兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)，在免疫系統(tǒng)中起調(diào)控作用。與存在于特定免疫效應(yīng)細胞中的特定受體相互作用的神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽由免疫系統(tǒng)釋放以影響這些細胞在宿主中針對疾病和其它環(huán)境應(yīng)激的功能。已顯示多巴胺的免疫調(diào)控性作用通過存在于靶標細胞中的五種不同g蛋白偶聯(lián)受體來調(diào)控。存在這些受體的兩個廣泛類別：g1和g2，其涵蓋不同亞型。d1類別的受體包括d2和d5亞型，并且在活化后使細胞內(nèi)camp增加。d2類別的受體由d2、d3和d4亞型組成，并且已被報道在刺激后抑制細胞內(nèi)camp。多巴胺受體已見于正常人白細胞上。同樣，淋巴組織具有通過交感神經(jīng)達成的多巴胺能神經(jīng)支配，此表明多巴胺可能夠調(diào)控免疫系統(tǒng)效應(yīng)細胞(basu,sujit和sarkar,chandrani,dopamineandimmunesystem.scitopics2010)。多巴胺通過活化靜息t細胞以及抑制受刺激t細胞的活化來影響t細胞。在正常靜息外周人t淋巴細胞中，多巴胺活化d2和d3子類的受體，此轉(zhuǎn)而活化整聯(lián)蛋白(α4β1和α5β1)。這些整聯(lián)蛋白是使細胞附著于細胞外基質(zhì)組分纖維結(jié)合蛋白的異二聚跨膜糖蛋白。纖維結(jié)合蛋白用于使t細胞跨越組織屏障和血管進行遷移和外滲。此外，多巴胺通過d3受體起選擇性誘導(dǎo)cd8+t細胞遷移和歸巢的作用。此外，多巴胺通過影響由t細胞分泌細胞因子來影響t細胞。當多巴胺刺激d3和d1/d5受體時，tnf-α(一種多效性炎癥性細胞因子)的分泌被增加。當刺激d2受體時，il-10(一種消炎性細胞因子)被誘導(dǎo)分泌。然而，多巴胺可通過下調(diào)非受體酪氨酸激酶lck和fyn的表達來抑制活化的t細胞受體誘導(dǎo)的細胞增殖以及許多細胞因子(如il-2、ifn-γ和il-4)的分泌，所述激酶是在引發(fā)tcr活化方面重要的酪氨酸激酶(basu,sujit和sarkar,chandranidopamineandimmunesystem.scitopics2010)。b細胞具有極高多巴胺d2、d3和d5受體表達。多巴胺能夠抑制靜息和惡性b淋巴細胞的增殖。多巴胺通過促進周期性b細胞由于氧化應(yīng)激的凋亡來起作用。然而，尚未在靜息淋巴細胞中觀察到這個多巴胺能作用，因此表明在預(yù)防癌癥方面的作用(basu,sujit和sarkar,chandrani,dopamineandimmunesystem.scitopics2010)。酪氨酸，作為多巴胺的前體，可用于改進免疫應(yīng)答以及改進總體免疫系統(tǒng)功能性。它可向年長者、妊娠婦女、兒童和免疫功能受損害者(如aids患者和癌癥患者)提供益處。它也可向教師、旅行者和頻繁暴露于病菌的任何人給與。ne由β-羥化酶以及輔因子抗壞血酸使多巴胺進行β-氧化來在交感神經(jīng)系統(tǒng)中的腎上腺髓質(zhì)和節(jié)后神經(jīng)元中合成。它通過分泌至突觸間隙中來起作用，在所述突觸間隙中，它刺激腎上腺素能受體，并且接著由周圍細胞降解或攝取。作為一種兒茶酚胺，它不跨越血腦屏障。ne可用于抗擊adhd、抑郁和低血壓。就如adhd的注意力病癥而言，指定的藥物傾向于幫助增加ne和多巴胺的水平。此外，抑郁通常用抑制血清素和ne再攝取，由此增加腦中突觸后細胞中可用的血清素和ne的量的藥物治療。新近證據(jù)已表明snri也可增加多巴胺傳送，因為如果去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運體也通常使多巴胺再循環(huán)，那么snri將也增強多巴胺能傳送。因此，也可與ne水平增加相關(guān)的抗抑郁劑作用可部分歸因于多巴胺同時增加(特定來說在腦前額皮質(zhì)中)。ne用于治療患有危急性低血壓的患者。ne是血管加壓劑，并且作用于α1腎上腺素能受體與α2腎上腺素能受體兩者以導(dǎo)致血管收縮，由此使血壓增加。作為ne的前體，酪氨酸可用于治療注意力病癥，如adhd和add。另外，它可用于治療罹患抑郁、創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合征者和急性低血壓者。普遍稱為腎上腺素(adrenaline)的腎上腺素(epinephrine)是由腎上腺的髓質(zhì)分泌的激素。腎上腺素應(yīng)答于諸如恐懼或憤怒的強烈情緒而釋放，其導(dǎo)致心率、肌肉強度、血壓和糖代謝增加。它導(dǎo)致使身體準備進行困難或激烈活動的驚逃或?qū)箲?yīng)答。腎上腺素用作心臟停搏期間的刺激劑、休克期間用以增加血壓的血管收縮劑、和支氣管哮喘中的支氣管擴張劑和抗痙劑。腎上腺素不大量見于體內(nèi)，但在維持心血管體內(nèi)平衡方面極其重要，因為它能夠使血液轉(zhuǎn)向處于應(yīng)激下的組織。腎上腺素通過影響肌肉收縮來具有這個作用。當濃度比細胞中的正常值大10倍時，通過鈣調(diào)蛋白與鈣結(jié)合來發(fā)生肌肉的收縮。鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物接著繼續(xù)活化肌球蛋白輕鏈激酶，其接著使lc2磷酸化，從而導(dǎo)致收縮。腎上腺素結(jié)合腎上腺素受體，此活化腺苷酰基環(huán)化酶，并且從atp產(chǎn)生環(huán)狀amp。camp活化蛋白質(zhì)激酶，其由此使肌球蛋白輕鏈激酶磷酸化。這個磷酸化肌球蛋白輕鏈激酶對鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物具有較低親和力，并且因此是非活性的。因此，平滑肌組織被松馳。腎上腺素的這個作用使得它極適用于治療哮喘、心臟停搏和過敏性休克。酪氨酸，作為腎上腺素的前體，可用于處于心臟停搏的風(fēng)險下的患者、罹患哮喘者和處于過敏性休克的風(fēng)險者。腎上腺素是通過結(jié)合肝細胞的外部上的受體來分解糖原的兩種主要激素中的一種。這個結(jié)合導(dǎo)致發(fā)生構(gòu)象變化，由此允許g蛋白進行結(jié)合，并且變得具有活性。g蛋白偶聯(lián)受體的活化導(dǎo)致發(fā)生分子構(gòu)象變化，所述構(gòu)象變化導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶進行結(jié)合。一旦腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合復(fù)合物，腺苷酸環(huán)化酶即將atp分解成camp，其接著變?yōu)檫@個過程中的第二信使蛋白質(zhì)，并且活化蛋白質(zhì)激酶?；罨牡鞍踪|(zhì)激酶使磷酸化酶活化，所述磷酸化酶是催化糖原分解成葡萄糖的酶。酪氨酸，作為腎上腺素的前體，可用于通過使得葡萄糖可易于用于為運動供以燃料來改進運動表現(xiàn)。黑色素是酪氨酸的代謝物，并且是強力抗氧化劑。另外，它在抑制炎癥性細胞因子和超氧化物的產(chǎn)生方面具有影響。當促炎性細胞因子被過度產(chǎn)生時，它介導(dǎo)如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植物抗宿主反應(yīng)、惡病質(zhì)和敗血癥綜合征的病理性病狀中炎癥的損害作用。已發(fā)現(xiàn)黑色素抑制正在進行的細胞因子合成，此強烈表明黑色素可適用作針對涉及促炎性細胞因子的病狀的疊加療法(mohagheghpourn.等,cellimmunol.2000年1月10日；199(1):25-36)。酪氨酸可用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡病質(zhì)、敗血癥綜合征、具有與自體免疫病癥相關(guān)的炎癥者、和病理性病狀的其它炎癥性后遺癥。纈氨酸：纈氨酸是eaa，并且也是bcaa。包括纈氨酸的bcaa通過促進蛋白質(zhì)合成，遏制蛋白質(zhì)分解代謝，以及充當葡糖異生的底物來充當代謝應(yīng)激的時期期間骨骼肌的燃料來源。包括纈氨酸的bcaa是動物組織中合成谷氨酰胺的底物，并且已顯示谷氨酰胺可在介導(dǎo)動物中bcaa的合成代謝作用方面起作用。這種作用可能對于泌乳乳腺是重要的，因為它產(chǎn)生的谷氨酰胺多于它從動脈血液所攝取。胎盤中bcaa的分解代謝導(dǎo)致谷氨酰胺合成以及它向胎兒循環(huán)中釋放，此是在胎兒中循環(huán)的谷氨酰胺的主要來源。這表明用纈氨酸以及其它bcaa或其組合補充膳食可增加哺乳動物中的胎兒生長。另外，纈氨酸在丙氨酸的合成中起直接作用，并且因此關(guān)于丙氨酸具有調(diào)控功能。已顯示bcaa通過在靜息人肌肉中增加蛋白質(zhì)合成的速率以及降低蛋白質(zhì)降解的速率而對蛋白質(zhì)代謝具有合成代謝作用。另外，顯示bcaa在耐力訓(xùn)練后的恢復(fù)期間在人肌肉中具有合成代謝作用。這些作用通過mtor的磷酸化以及70-kds6蛋白質(zhì)激酶(p70-kds6)和真核起始因子4e結(jié)合蛋白1的依序活化來介導(dǎo)。p70-kds6因它在調(diào)節(jié)細胞周期進展、細胞大小和細胞存活方面的作用而眾所周知。應(yīng)答于有絲分裂原刺激的p70-kds6活化上調(diào)核糖體生物合成，并且增強細胞的翻譯能力(w-lan等,amjpathol.2003年8月；163(2):591–607；e.blomstrand等,j.nutr.2006年1月136:269s-273s)。真核起始因子4e結(jié)合蛋白1是使40s核糖體亞單位向mrna的5’末端募集的多亞單位復(fù)合物的限制性組分。p70s6激酶的活化以及核糖體蛋白質(zhì)s6的隨后磷酸化與特定mrna的翻譯增強相關(guān)。在一個時間段的四頭肌肌肉抵抗訓(xùn)練期間以及之后向受試者給與bcaa顯示mtor、p70s6激酶增加，并且s6磷酸化見于訓(xùn)練之后的恢復(fù)時期中。然而，bcaa對akt或糖原合成酶激酶3(gsk-3)不存在所述作用。在不攝取bcaa下訓(xùn)練導(dǎo)致p70s6激酶的部分磷酸化而不活化所述酶，akt磷酸化降低，并且gsk-3不變化。bcaa輸注也以akt非依賴性方式增加靜息受試者的p70s6激酶磷酸化。這個mtor活性調(diào)控細胞蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換(自體吞噬)，并且使胰島素樣生長信號整合于各組織的蛋白質(zhì)合成引發(fā)。這個生物作用已與骨骼肌中瘦性組織質(zhì)量的生物發(fā)生、肥胖癥和胰島素抗性的疾病狀態(tài)的代謝轉(zhuǎn)變、以及衰老直接相關(guān)聯(lián)。纈氨酸在肌肉代謝、組織修復(fù)、以及體內(nèi)適當?shù)胶獾木S持中起關(guān)鍵作用。作為三種bcaa中的一種，它可由肌肉組織用作能量來源。纈氨酸是葡萄糖生成性aa，并且因此提供葡萄糖。纈氨酸可適用于治療肝和膽囊疾病。另外，纈氨酸可適用于矯正重度aa缺乏癥的由藥物成癮性引起的類型。此外，已發(fā)現(xiàn)纈氨酸會促進精神活力、肌肉調(diào)協(xié)和情緒平靜。它也可用于防止在高海拔處的肌肉損失。纈氨酸補充可用于改進運動表現(xiàn)和肌肉形成，有助于藥物成癮性康復(fù)，增強年長者和生長兒童的精神活力，防止伴隨衰老的肌肉損失，輔助罹患肝病者，支持兒童身體生長，充當針對膽囊和肝疾病的療法，增加哺乳動物的泌乳，增加哺乳動物中的胎兒生長，并且改進向饑餓群體給與的食物的營養(yǎng)品質(zhì)。低量纈氨酸在肥胖癥和糖尿病的狀態(tài)下，已顯示動物會展現(xiàn)降低的肝自體吞噬，從而導(dǎo)致胰島素抗性增加。自體吞噬對于維持er和細胞體內(nèi)平衡是重要的，所述體內(nèi)平衡在受應(yīng)激時可導(dǎo)致胰島素敏感性受損。在動物模型中進行高脂肪膳食供食使er受應(yīng)激，同時通過過度刺激mtorc1來導(dǎo)致肝自體吞噬受阻抑，此使糖尿病中朝向β細胞胰島素敏感性功能受損的進展加強。降低全身性纈氨酸的水平提供用以降低mtorc1活性以及恢復(fù)自體吞噬的健康水平的機會。存在了解不帶電荷的trna如何變構(gòu)活化gcn2，從而導(dǎo)致與脂肪生成和蛋白質(zhì)合成以及真核生物中許多生物合成路徑相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(以下討論的srebp-1c、eif2a和gcn4p)的下游磷酸化的機制。缺乏任何eaa的膳食在膳食引入之后數(shù)分鐘內(nèi)顯著觸發(fā)這個信號傳導(dǎo)(hao等,science2005)。已體內(nèi)顯示通過srebp-1c進行的信號傳導(dǎo)通過阻遏與脂肪生成相關(guān)的基因而對調(diào)動脂質(zhì)儲存物具有顯著影響。已顯示srebp-1c特異性作用于肝脂質(zhì)合成，并且能夠?qū)е赂沃咀冃员硇鸵约皟?nèi)臟脂肪質(zhì)量增加(knebel,b.等liver-specificexpressionoftranscriptionallyactivesrebp-1cisassociatedwithfattyliverandincreasedvisceralfatmass.plos,2012)。纈氨酸剝奪通過它對gcn2的作用而對srebp-1c具有影響，并且使生理量度肝重量(和脂肪肝表型)、脂肪組織重量、膽固醇/甘油三酯含量和食物攝取降低。驅(qū)動脂肪質(zhì)量降低同時維持瘦性質(zhì)量在諸如肥胖癥、糖尿病和心血管健康的領(lǐng)域中提供治療機會。氨基酸藥理學(xué)的體外分析。如本文所提供，氨基酸充當為合成新蛋白質(zhì)所必需的底物，并且也充當信號傳導(dǎo)分子。對給定氨基酸的藥理學(xué)性質(zhì)的分析取決于所用細胞系和模型系統(tǒng)。舉例來說，已顯示氨基酸亮氨酸會增加雷帕霉素(rapamycin)復(fù)合物i的哺乳動物靶標和骨骼肌細胞中的合成代謝中涉及的下游靶標的磷酸化(granp和dcameron-smith.2011.theactionsofexogenousleucineonmtorsignalingandaminoacidtransportersinhumanmyotubes.bmcphysiol.11:10)。氨基酸藥理學(xué)的體外測定也可揭示某些癌癥類型中的營養(yǎng)缺陷體。已報道多種永生化癌細胞系中的甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷體(cavuotop和mffenech.2012.areviewofmethioninedependencyandtheroleofmethioninerestrictionincancergrowthcontrolandlife-spanextension.cancertreatrev.38:726-736)。在鑒定相關(guān)細胞系之后，可設(shè)計利用氨基酸、蛋白質(zhì)消化物或二肽和三肽作為自變量或操縱變量的體外測定。適當細胞系是基于它作為細胞過程的模型的相關(guān)性來選擇。舉例來說，c2c12(atcc，crl-1772)是分化成肌纖維，并且用作骨骼肌纖維分化和發(fā)育的模型的鼠類成肌細胞細胞系。細胞被維持在補充以多達10％的供給必需生長因子的胎牛血清、以及青霉素和鏈霉素的完全培養(yǎng)基中。使粘著細胞系在具有用于過濾氣體交換的酚性蓋的t75燒瓶中生長，并且于含濕氣環(huán)境中在37℃下在5％co2下孵育。表aa列出用于測定氨基酸藥理學(xué)的細胞系。對于體外測定，將細胞在憑經(jīng)驗確定的適當細胞密度下接種于t75燒瓶、6孔板、12孔板、24孔板、48孔板或96孔板中。在孵育時期之后，完全生長培養(yǎng)基用缺乏測試物品的培養(yǎng)基替換。在一段時期的培養(yǎng)基耗竭之后，將測試物品添加在適當培養(yǎng)基中。在處理時期之后，測量相關(guān)因變量。表aa.用于氨基酸藥理學(xué)的體外測定中的示例性細胞系的清單。參見例如wu,g.aminoacids:metabolism,functions,andnutrition.aminoacids37(1):1-17(2009)；wu,g.functionalaminoacidsinnutritionandhealth.aminoacids45(3):407-11(2013)；schworer,c.glucagon-inducedautophagyandproteolysisinratliver:mediationbyselectivedeprivationofintracellularaminoacids.pnas76(7):3169-73(1979)；codongo,p.autophagy:apotentiallinkbetweenobesityandinsulinresistance.cellmetabolism11(6):449-51(2010)；leong,h等.short-termargininedeprivationresultsinlarge-scalemodulationofhepaticgeneexpressioninbothnormalandtumorcells:microarraybioinformaticanalysis.nutritionandmetabolism3:37(2006)；harbrecht,b.g.glutathioneregulatesnitricoxidesynthaseinculturedhepatocytes.annalsofsurgery225(1):76-87(1997)；watermelonjuice:apotentialfunctionaldrunkforsoremusclereliefinathletes.j.agric.foodchem.61(31):7522-8(2013)。分泌營養(yǎng)性多肽。在另一方面，提供含有可食用物種多肽的氨基酸序列的營養(yǎng)性多肽，其被工程改造來從單細胞生物體分泌并從其純化。所述營養(yǎng)性多肽對于宿主細胞可為內(nèi)源性的或外源性的，可以多肽形式或在宿主細胞中天然分泌，或兩者，并且被工程改造以達成營養(yǎng)性多肽的分泌。營養(yǎng)性多肽的有利性質(zhì)包括能夠在宿主細胞中表達和分泌，可溶于廣泛多種溶劑中，并且當由預(yù)定受試者消耗時，具有營養(yǎng)性益處、降低的過敏原性或無過敏原性，無毒性，并且可消化。所述性質(zhì)可至少部分基于預(yù)期消耗者和消耗營養(yǎng)性多肽的原因(例如為達成總體健康、肌肉合成代謝、免疫健康或治療或預(yù)防疾病、病癥或病狀)而被重視。例如通過基于一級序列計算所有相關(guān)氨基酸的質(zhì)量分數(shù)，一個或多個營養(yǎng)準則得以滿足。非限制性地舉例來說，本發(fā)明的多肽提供于表1中。預(yù)測的前導(dǎo)物列顯示預(yù)測的前導(dǎo)物(如果存在前導(dǎo)物)的序列索引。片段索引列顯示片段序列的序列索引。dbid列列出各序列截至2014年9月24日可用的uniprot或genbank登錄號，其各自以引用的方式并入本文。僅具有數(shù)字字符的dbid來自genbank數(shù)據(jù)庫，而具有混合字母/數(shù)字字符的那些來自uniprot數(shù)據(jù)庫。核酸本文也提供編碼多肽或蛋白質(zhì)的核酸。在一些實施方案中，核酸是分離的。在一些實施方案中，核酸是純化的。在核酸的一些實施方案中，核酸包含編碼本文公開的第一多肽序列的核酸序列。在核酸的一些實施方案中，核酸由編碼本文公開的第一多肽序列的核酸序列組成。在核酸的一些實施方案中，核酸包含編碼本文公開的蛋白質(zhì)的核酸序列。在核酸的一些實施方案中，核酸由編碼本文公開的蛋白質(zhì)的核酸序列組成。在核酸的一些實施方案中，編碼第一多肽序列的核酸序列操作性地連接于至少一種表達控制序列。舉例來說，在核酸的一些實施方案中，編碼第一多肽序列的核酸序列操作性地連接于啟動子，諸如本文所述的啟動子。因此，在一些實施方案中，本公開的核酸分子編碼自身是多肽或蛋白質(zhì)的多肽或蛋白質(zhì)。這種核酸分子可被稱為“核酸”。在一些實施方案中，核酸編碼自身包含以下至少一個的多肽或蛋白質(zhì)：a)至少24％的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率；b)至少11％的leu殘基與總氨基酸殘基的比率；和c)至少49％的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率。在一些實施方案中，核酸包含至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少60個核苷酸、至少70個核苷酸、至少80個核苷酸、至少90個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸、至少400個核苷酸、至少500個核苷酸、至少600個核苷酸、至少700個核苷酸、至少800個核苷酸、至少900個核苷酸、至少1,000個核苷酸。在一些實施方案中，營養(yǎng)性核酸包含10至100個核苷酸、20至100個核苷酸、10至50個核苷酸、或20至40個核苷酸。在一些實施方案中，核酸包含編碼可食用物種多肽或蛋白質(zhì)的開放閱讀框的全部或一部分。在一些實施方案中，核酸由編碼可食用物種蛋白質(zhì)的片段的開放閱讀框組成，其中所述開放閱讀框不編碼完整可食用物種蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，核酸是cdna。在一些實施方案中，提供包含與可食用物種核酸至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％同一的序列的核酸分子。在一些實施方案中，提供在嚴格雜交條件下與至少一種參照核酸雜交的核酸。本公開中提供的核酸及其片段顯示在多種系統(tǒng)和方法中具有效用。舉例來說，片段可在各種雜交技術(shù)中用作探針。視方法而定，靶標核酸序列可為dna或rna?？稍陔s交之前分級分離(例如通過凝膠電泳)靶標核酸序列，或雜交可對樣品原位進行。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解具有已知序列的核酸探針在確定染色體結(jié)構(gòu)(例如通過dna印跡)和測量基因表達(例如通過rna印跡)方面具有效用。在所述實驗中，序列片段優(yōu)選被可檢測標記，以使可檢測以及任選定量它們與靶標序列的特異性雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解本公開的核酸片段可用于本文未明確描述的廣泛多種印跡技術(shù)中。也應(yīng)了解當固定在微陣列芯片上時，本文公開的核酸序列片段也適用作探針。用于通過將核酸沉積和固定于支撐基材上來產(chǎn)生微陣列的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。綜述于以下中：dnamicroarrays:apracticalapproach(practicalapproachseries),schena(編),oxforduniversitypress(1999)(isbn:0199637768)；naturegenet.21(1)(增刊):1-60(1999)；microarraybiochip:toolsandtechnology,schena(編),eatonpublishingcompany/biotechniquesbooksdivision(2000)(isbn:1881299376)，其公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。使用包含核酸序列片段(諸如本文公開的核酸序列片段)的微陣列芯片分析例如基因表達在細胞和分子生物學(xué)領(lǐng)域中是序列片段的明確確定效用。固定在微陣列芯片上的序列片段的其它用途描述于以下中：gerhold等,trendsbiochem.sci.24:168-173(1999)以及zweiger,trendsbiotechnol.17:429-436(1999)；dnamicroarrays:apracticalapproach(practicalapproachseries),schena(編),oxforduniversitypress(1999)(isbn:0199637768)；naturegenet.21(1)(增刊):1-60(1999)；microarraybiochip:toolsandtechnology,schena(編),eatonpublishingcompany/biotechniquesbooksdivision(2000)(isbn:1881299376)。表達載體也提供一種或多種包含至少一種本文公開的核酸分子的載體，包括表達載體，如本文進一步所述。在一些實施方案中，載體包含至少一種編碼如本文公開的蛋白質(zhì)的分離的核酸分子。在替代性實施方案中，載體包含可操作地連接于一種或多種表達控制序列的這種核酸分子。載體可因此用于在重組微生物宿主細胞中表達至少一種重組蛋白。在一些方面，一個載體或一組載體可包括編碼例如用以導(dǎo)致本文公開的蛋白質(zhì)分泌的信號肽的核酸序列。對于對信號肽和分泌的進一步討論，參見下文。適于在微生物中表達核酸的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。適用于藍細菌中的載體例如描述于heidorn等,“syntheticbiologyincyanobacteria:engineeringandanalyzingnovelfunctions,”methodsinenzymology,第497卷,第24章(2011)中?？捎糜诠こ谈脑烊绫疚墓_的藍細菌的示例性復(fù)制型載體包括ppmqak1、psl1211、pfc1、psb2a、pscr119/202、psun119/202、prl2697、prl25c、prl1050、psg111m和ppbh201。也可使用能夠接受本文公開的核酸序列的其它載體，諸如pjb161。諸如pjb161的載體包含與某些光合微生物內(nèi)源性質(zhì)粒(例如某些聚球藻屬(synechococcus)物種的質(zhì)粒paq1、paq3和paq4)中存在的序列同源的序列。所述載體的實例以及如何使用它們在本領(lǐng)域中是已知的，并且例如提供于xu等,“expressionofgenesincyanobacteria:adaptationofendogenousplasmidsasplatformsforhigh-levelgeneexpressioninsynechococcussp.pcc7002,”第21章,robertcarpentier(編),“photosynthesisresearchprotocols,”methodsinmolecularbiology,第684卷,2011中，所述文獻據(jù)此以引用的方式并入本文。在pjb161與內(nèi)源性質(zhì)粒之間進行體內(nèi)重組產(chǎn)生從它們的內(nèi)源性質(zhì)粒表達目標基因的工程改造的微生物?；蛘?，載體可被工程改造來與宿主細胞染色體重組，或載體可被工程改造來獨立于宿主細胞染色體或任何宿主細胞的內(nèi)源性質(zhì)粒來復(fù)制和表達目標基因。適于重組蛋白產(chǎn)生的載體的另一實例是pet系統(tǒng)這個系統(tǒng)已被廣泛表征以用于大腸桿菌和其它微生物中。在這個系統(tǒng)中，將靶標基因在強噬菌體t7轉(zhuǎn)錄和(任選)翻譯信號控制下克隆在pet質(zhì)粒中；通過在宿主細胞中提供t7rna聚合酶的來源來誘導(dǎo)表達。t7rna聚合酶具有如此選擇性和活性以致當被充分誘導(dǎo)時，幾乎所有微生物的資源都被轉(zhuǎn)向靶標基因表達；在誘導(dǎo)之后數(shù)小時，所需產(chǎn)物可占總細胞蛋白質(zhì)的50％以上。也有可能僅通過降低誘導(dǎo)劑的濃度來減弱表達水平。降低表達水平可增強一些靶標蛋白質(zhì)的可溶性產(chǎn)率。在一些實施方案中，這個系統(tǒng)也允許維持靶標基因處于轉(zhuǎn)錄沉默未誘導(dǎo)狀態(tài)。在使用這個系統(tǒng)的一些實施方案中，靶標基因是使用不含有t7rna聚合酶基因的宿主來克隆，由此減輕與歸因于產(chǎn)生對宿主細胞具有潛在毒性的蛋白質(zhì)的質(zhì)粒不穩(wěn)定性相關(guān)的潛在問題。一旦在非表達宿主中建立，靶標蛋白質(zhì)表達即可通過用λce6(一種攜帶在λpl和pi啟動子控制下的t7rna聚合酶基因的噬菌體)感染宿主，或通過將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有在lacuv5控制下的t7rna聚合酶基因的染色體拷貝的表達宿主中來引發(fā)。在第二種情況下，表達是通過向細菌培養(yǎng)物中添加iptg或乳糖或使用自身誘導(dǎo)培養(yǎng)基來誘導(dǎo)。由lac操縱子控制，但不需要t7rna聚合酶基因而依賴于大腸桿菌的天然rna聚合酶的其它質(zhì)粒系統(tǒng)包括ptrc質(zhì)粒套件(invitrogen)或pqe質(zhì)粒套件(qiagen)。在其它實施方案中，有可能直接克隆至表達宿主中。在它們抑制基礎(chǔ)表達水平的嚴格性方面不同的兩種類型的t7啟動子和若干宿主是可用的，從而提供優(yōu)化廣泛多種靶標基因的表達的極大靈活性和能力。適于在哺乳動物細胞中表達核酸的載體通常包含由病毒調(diào)控元件提供的控制功能。舉例來說，通常使用的啟動子源于多形瘤病毒、腺病毒2、巨細胞病毒或猿猴病毒40。啟動子適用于表達本文所述的重組基因的啟動子包括組成性啟動子與誘導(dǎo)性/阻遏性啟動子兩者。誘導(dǎo)性/阻遏性啟動子的實例包括鎳誘導(dǎo)性啟動子(例如pnrsa、pnrsb；參見例如lopez-mauy等,cell(2002)第43卷:247-256)和尿素阻遏性啟動子，諸如pnira(例如描述于qi等,appliedandenvironmentalmicrobiology(2005)第71卷:5678-5684中)。誘導(dǎo)性/阻遏性啟動子的其它實例包括pnira(驅(qū)動nira基因的表達的啟動子，由硝酸鹽誘導(dǎo)，并且由尿素阻遏)和psuf(驅(qū)動sufb基因的表達的啟動子，由鐵應(yīng)激誘導(dǎo))。組成性啟動子的實例包括pcpc(驅(qū)動cpc操縱元的表達的啟動子)、prbc(驅(qū)動二磷酸核酮糖羧化酶氧合酶(rubisco)的表達的啟動子)、ppsbaii(驅(qū)動ppsbaii的表達的啟動子)、pcro(驅(qū)動cro的表達的λ噬菌體啟動子)。在其它實施方案中，paphil和/或laclq-ptrc啟動子可用于控制表達。當在工程改造的微生物中表達多種重組基因時，不同基因可由不同啟動子或由單獨操縱元中的相同啟動子控制，或兩種或更多種基因的表達可由作為操縱元的一部分的單一啟動子控制。誘導(dǎo)性啟動子的其它非限制性實例可包括但不限于通過表達外源性蛋白質(zhì)(例如t7rna聚合酶、sp6rna聚合酶)，通過存在小分子(例如iptg、半乳糖、四環(huán)素、類固醇激素、脫落酸(abscisicacid))，通過不存在小分子(例如co2、鐵、氮)，通過金屬或金屬離子(例如銅、鋅、鎘、鎳)，以及通過環(huán)境因素(例如熱、冷、應(yīng)激、光、黑暗)和通過生長期加以誘導(dǎo)的那些。在一些實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子受嚴密調(diào)控以使在不存在誘導(dǎo)下，大致上無轉(zhuǎn)錄通過啟動子被引發(fā)。在一些實施方案中，誘導(dǎo)啟動子不實質(zhì)上改變通過其它啟動子進行的轉(zhuǎn)錄。此外，一般來說，誘導(dǎo)誘導(dǎo)性啟動子的化合物或條件不天然存在于尋求表達所處的生物體或環(huán)境中。在一些實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子是通過限制向藍細菌培養(yǎng)物供給co2來誘導(dǎo)。非限制性地舉例來說，誘導(dǎo)性啟動子可為在co2限制條件下被上調(diào)的集胞藻屬(synechocystis)pcc6803諸如cmp基因、ntp基因、ndh基因、sbt基因、chp基因和rbc基因或其變體或片段的啟動子序列。在一些實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子是通過鐵饑餓或通過進入穩(wěn)定生長期來誘導(dǎo)。在一些實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子可為在fe饑餓條件下被上調(diào)的藍細菌基因(諸如isia)或當培養(yǎng)物進入穩(wěn)定生長期時被上調(diào)的藍細菌基因(諸如isia、phra、sigc、sigb和sigh基因或其變體或片段)的啟動子序列的變異序列。在一些實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子由金屬或金屬離子誘導(dǎo)。非限制性地舉例來說，誘導(dǎo)性啟動子可由銅、鋅、鎘、汞、鎳、金、銀、鈷和鉍或其離子誘導(dǎo)。在一些實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子由鎳或鎳離子誘導(dǎo)。在一些實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子由諸如ni2+的鎳離子誘導(dǎo)。在另一示例性實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子是來自集胞藻屬pcc6803的鎳誘導(dǎo)性啟動子。在另一實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子可由銅或銅離子誘導(dǎo)。在另一實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子可由鋅或鋅離子誘導(dǎo)。在另一實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子可由鎘或鎘離子誘導(dǎo)。在另一實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子可由汞或汞離子誘導(dǎo)。在一替代性實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子可由金或金離子誘導(dǎo)。在另一替代性實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子可由銀或銀離子誘導(dǎo)。在另一替代性實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子可由鈷或鈷離子誘導(dǎo)。在另一替代性實施方案中，誘導(dǎo)性啟動子可由鉍或鉍離子誘導(dǎo)。在一些實施方案中，啟動子是通過使包含誘導(dǎo)性啟動子的細胞暴露于金屬或金屬離子來誘導(dǎo)。可通過向微生物生長培養(yǎng)基中添加金屬來使細胞暴露于金屬或金屬離子。在某些實施方案中，添加至微生物生長培養(yǎng)基中的金屬或金屬離子可從培養(yǎng)基高效回收。在其它實施方案中，在回收之后剩余在培養(yǎng)基中的金屬或金屬離子不實質(zhì)上阻礙對培養(yǎng)基或細菌基因產(chǎn)物的下游處理。組成性啟動子的其它非限制性實例包括來自革蘭氏陰性細菌(gram-negativebacteria)或在革蘭氏陰性細菌中增殖的噬菌體的組成性啟動子。舉例來說，可使用編碼高度表達的革蘭氏陰性基因產(chǎn)物的基因的啟動子，諸如lpp、ompa、rrna和核糖體蛋白質(zhì)的啟動子?；蛘?，可調(diào)控啟動子可用于缺乏那個啟動子的調(diào)控蛋白的菌株中。舉例來說，plac、ptac和ptrc可用作缺乏lacl的菌株中的組成性啟動子。類似地，p22pr和pl可用于缺乏λc2阻遏蛋白的菌株中，并且λpr和pl可用于缺乏λc1阻遏蛋白的菌株中。在一個實施方案中，組成性啟動子來自噬菌體。在另一實施方案中，組成性啟動子來自沙門氏菌屬(salmonella)噬菌體。在另一實施方案中，組成性啟動子來自藍綠藻噬菌體。在一些實施方案中，組成性啟動子是集胞藻屬啟動子。舉例來說，組成性啟動子可為ppsball啟動子或它的變異序列、prbc啟動子或它的變異序列、pcpc啟動子或它的變異序列、以及prnpb啟動子或它的變異序列。宿主也提供用本文公開的核酸分子或載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞及其后代。在一些實施方案中，宿主細胞是微生物細胞。在一些實施方案中，宿主細胞攜帶在可為但無需為自由復(fù)制載體的載體上的核酸序列。在其它實施方案中，核酸已整合至宿主細胞的基因組中和/或宿主細胞的內(nèi)源性質(zhì)粒中。轉(zhuǎn)化的宿主細胞例如適用于產(chǎn)生本文公開的重組蛋白。多種宿主微生物可用本文公開的核酸序列轉(zhuǎn)化，并且在一些實施方案中，可用于產(chǎn)生本文公開的重組蛋白。適合宿主微生物包括自養(yǎng)性微生物與異養(yǎng)性微生物兩者。在一些應(yīng)用中，自養(yǎng)性微生物允許降低為制備由引入宿主微生物中的重組核酸序列編碼的蛋白質(zhì)所需的化石燃料和/或電輸入量。在一些應(yīng)用中，這轉(zhuǎn)而降低產(chǎn)生蛋白質(zhì)的成本和/或環(huán)境影響，和/或相較于制造替代性蛋白質(zhì)(諸如乳清、蛋和大豆)的成本和/或環(huán)境影響，降低成本和/或環(huán)境影響。舉例來說，在一些實施方案中，使用如本文公開的宿主微生物制備本文公開的蛋白質(zhì)的成本和/或環(huán)境影響低于通過加工牛奶以適于人消耗的形式制備乳清蛋白質(zhì)的成本和/或環(huán)境影響。異養(yǎng)生物的非限制性實例包括大腸桿菌(escherichiacoli)、鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)、谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)、天藍色鏈霉菌(streptomycescoelicolor)、變鉛青鏈霉菌(streptomyceslividans)、委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(streptomycesvanezuelae)、玫瑰孢鏈霉菌(streptomycesroseosporus)、弗雷德氏鏈霉菌(streptomycesfradiae)、灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)、棒狀鏈霉菌(streptomycescalvuligerus)、吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)、普拉特鏈霉菌(streptomycesplatensis)、糖多孢紅霉菌(saccharopolysporaerythraea)、谷氨酸棒桿菌、黑曲霉(aspergillusniger)、構(gòu)巢曲霉(aspergillusnidulans)、米曲霉(aspergillusoryzae)、土曲霉(aspergillusterreus)、醬油曲霉(aspergillussojae)、產(chǎn)黃青霉(penicilliumchrysogenum)、里氏木霉(trichodermareesei)、丙酮丁醇棱菌(clostridiumacetobutylicum)、貝季爾林斯基梭菌(clostridiumbeijerinckii)、熱纖梭菌(clostridiumthermocellum)、fusibacterpaucivorans、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、布拉迪酵母(saccharomycesboulardii)、巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)和樹干畢赤酵母(pichiastipitis)。光合自養(yǎng)性微生物包括真核藻類以及原核藍細菌、綠色硫細菌、綠色非硫細菌、紫色硫細菌和紫色非硫細菌。極端生物也涵蓋為適合生物體。提供所述生物體，例如混合營養(yǎng)性生物體也是適合生物體。藻類和藍細菌被涵蓋為適合生物體。參見例如公開于2013年3月15日提交的pct/us2013/032232、2013年3月15日提交的pct/us2013/032180、2013年3月15日提交的pct/us2013/032225、2013年3月15日提交的pct/us2013/032218、2013年3月15日提交的pct/us2013/032212、2013年3月15日提交的pct/us2013/032206和2013年4月29日提交的pct/us2013/038682中的生物體。其它適合生物體包括如venter等美國專利公布號2007/0264688中所述的合成細胞或由合成基因組產(chǎn)生的細胞、以及如glass等美國專利公布號2007/0269862中所述的細胞樣系統(tǒng)或合成細胞。其它適合生物體包括大腸桿菌、醋酸桿菌(acetobacteraceti)、枯草芽孢桿菌、酵母和真菌，諸如揚氏梭菌(clostridiumljungdahlii)、熱纖梭菌(clostridiumthermocellum)、產(chǎn)黃青霉、巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)或運動發(fā)酵單胞菌(zymomonasmobilis)。在一些實施方案中，那些生物體被工程改造來固定二氧化碳，而在其它實施方案中，它們不被工程改造。在一些實施方案中，諸如昆蟲細胞或哺乳動物細胞(諸如人細胞)的真核細胞用作宿主細胞。熟知用于所述細胞的載體和表達控制序列，包括啟動子和增強子。適用于這個目的的哺乳動物宿主細胞系的實例是由sv40轉(zhuǎn)化的猴腎cv1株系(cos-7，atcccrl1651)；人胚腎株系(293細胞或被亞克隆來達成懸浮培養(yǎng)生長的293細胞，graham等,j.genvirol.36:59(1977))；幼小倉鼠腎細胞(bhk，atccccl10)；中國倉鼠卵巢細胞/-dhfr(cho，urlaub等,proc.natl.acad.sci.usa77:4216(1980))；小鼠塞爾托利細胞(sertolicell)(tm4，mather,biol.reprod.23:243-251(1980))；猴腎細胞(cv1atccccl70)；非洲綠猴腎細胞(vero-76，atcccrl-1587)；人宮頸癌細胞(hela，atccccl2)；犬腎細胞(mdck，atccccl34)；水牛大鼠肝細胞(brl3a，atcccrl1442)；人肺細胞(w138，atccccl75)；人肝細胞(hepg2，hb8065)；小鼠乳腺腫瘤(mmt060562，atccccl51)；tri細胞(mather等,annalsn.y.acad.sci.383:44-68(1982))；mrc5細胞；fs4細胞；和人肝細胞瘤株系(hepg2)。轉(zhuǎn)染可使用例如如本領(lǐng)域中熟知的重組dna技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合在宿主細胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)(例如morrison,s.(1985)science229:1202)。對于蛋白質(zhì)的表達，通過標準技術(shù)來將編碼蛋白質(zhì)的表達載體轉(zhuǎn)染至宿主細胞中。術(shù)語轉(zhuǎn)染的各種形式意圖涵蓋通常用于將外源性dna引入原核或真核宿主細胞中的廣泛多種技術(shù)，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、deae-右旋糖苷轉(zhuǎn)染等。產(chǎn)生熟練技術(shù)人員了解可用于培養(yǎng)重組細胞以產(chǎn)生(以及任選分泌)如本文公開的蛋白質(zhì)，以及用于純化和/或分離表達的蛋白質(zhì)的許多適合方法。選擇用于蛋白質(zhì)純化的方法取決于許多變量，包括目標蛋白質(zhì)的性質(zhì)、它在細胞內(nèi)的位置和形式、載體、宿主菌株背景和表達的蛋白質(zhì)的預(yù)定應(yīng)用。培養(yǎng)條件也可對給定靶標蛋白質(zhì)的溶解度和定位具有影響。許多方法可用于純化在如本文公開的重組微生物細胞中表達的靶標蛋白質(zhì)，所述方法包括不限于離子交換和凝膠過濾。在一些實施方案中，添加肽融合標簽至重組蛋白中，從而使得有可能使用利用肽融合標簽的多種親和純化方法。在一些實施方案中，使用親和方法使得能夠在一步中將靶標蛋白質(zhì)純化至接近均質(zhì)。純化可包括用例如腸激酶、因子xa、凝血酶或hrv3c蛋白酶裂解融合標簽的一部分或全部。在一些實施方案中，在表達的靶標蛋白質(zhì)的純化或活性測量之前，對靶標蛋白質(zhì)的表達水平、細胞定位和溶解度進行初步分析。靶標蛋白質(zhì)可見于任何或全部以下部分中：可溶性或不溶性細胞質(zhì)部分、周質(zhì)或培養(yǎng)基。視預(yù)定應(yīng)用而定，在一些實施方案中，優(yōu)先定位于包涵體、培養(yǎng)基或周質(zhì)間隙可有利于通過相對簡單程序達成快速純化。盡管大腸桿菌被廣泛認為是用于異源性蛋白質(zhì)表達的強力宿主，但也廣泛已知在這個宿主中過度表達許多蛋白質(zhì)傾向于以不溶性包涵體形式聚集。一種用于挽救包涵體形成或改進蛋白質(zhì)自身的滴度的最通常使用的方法在于包括融合于目標蛋白質(zhì)的氨基末端麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)(austinbp,nallamsettys,waughds.hexahistidine-taggedmaltose-bindingproteinasafusionpartnerfortheproductionofsolublerecombinantproteinsinescherichiacoli.methodsmolbiol.2009；498:157-72)、或小泛素相關(guān)的修飾因子(sumo)(saitohh,uwadaj,azusak.strategiesfortheexpressionofsumo-modifiedtargetproteinsinescherichiacoli.methodsmolbiol.2009；497:211-21；malakhovmp,matternmr,malakhovaoa,drinkerm,weekssd,butttr.sumofusionsandsumo-specificproteaseforefficientexpressionandpurificationofproteins.jstructfunctgenomics.2004；5(1-2):75-86；panavast,sandersc,butttr.sumofusiontechnologyforenhancedproteinproductioninprokaryoticandeukaryoticexpressionsystems.methodsmolbiol.2009；497:303-17)。這兩種蛋白質(zhì)在大腸桿菌中極其良好，并且以可溶性形式表達以使目標蛋白質(zhì)也以可溶性形式有效產(chǎn)生?？赏ㄟ^在目標蛋白質(zhì)與融合蛋白之間設(shè)計位點特異性蛋白酶識別序列(諸如煙草蝕刻病毒(tev)蛋白酶)來裂解目標蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，目標蛋白質(zhì)可存在于包涵體中；在一些方面，包涵體可被配制以向受試者遞送。以下進一步詳細討論配制。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)初始未正確折疊或不可溶。熟知用于再折疊不溶性蛋白質(zhì)的多種方法。大多數(shù)方案包括依次通過離心和在變性條件下溶解來分離不溶性包涵體。蛋白質(zhì)接著被透析或稀釋至非變性緩沖液中，在所述緩沖液中發(fā)生再折疊。因為每種蛋白質(zhì)都具有獨特折疊性質(zhì)，所以用于任何給定蛋白質(zhì)的最優(yōu)再折疊方案可由熟練技術(shù)人員憑經(jīng)驗確定。最優(yōu)再折疊條件可例如通過矩陣方法在小規(guī)模上快速確定，在所述方法中，測試諸如蛋白質(zhì)濃度、還原劑、氧化還原處理、二價陽離子等的變量。一旦得到最優(yōu)濃度，它們即可被應(yīng)用于靶標蛋白質(zhì)的較大規(guī)模溶解和再折疊。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)不包含三級結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)中小于半數(shù)氨基酸參與三級結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)不包含二級結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)中小于半數(shù)氨基酸參與二級結(jié)構(gòu)。重組蛋白可從以包含這些結(jié)構(gòu)特征中的一個或多個的狀態(tài)表達它們的細胞的培養(yǎng)物分離。在一些實施方案中，在蛋白質(zhì)從產(chǎn)生它的培養(yǎng)物分離之后，重組蛋白的三級結(jié)構(gòu)被減小或消除。在一些實施方案中，在蛋白質(zhì)從產(chǎn)生它的培養(yǎng)物分離之后，重組蛋白的二級結(jié)構(gòu)被減小或消除。在一些實施方案中，在堿性ph下的caps緩沖液與n-月桂?；“彼岬慕M合用于實現(xiàn)包涵體溶解，隨后在dtt存在下透析以促進再折疊。視靶標蛋白質(zhì)、表達條件和預(yù)定應(yīng)用而定，從洗滌的包涵體溶解的蛋白質(zhì)可為>90％均質(zhì)，并且可不需要進一步純化。使用融合蛋白和固定金屬親和色譜法有可能在完全變性條件下(在再折疊之前)進行純化。此外，使用6m尿素從包涵體溶解的s·tagtm、和ii融合蛋白可通過稀釋以獲得2m尿素(s·tag和t7·tag)或1m尿素(strep·tagii)，隨后在適當樹脂上進行色譜法來在部分變性條件下純化。再折疊的融合蛋白可使用his·tag、s·tag、strep·tagii和其它適當親和標簽(例如gst·tagtm和t7·tag)在非變性條件下親和純化。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)是用于表達它的宿主細胞的內(nèi)源性蛋白質(zhì)。也就是說，宿主細胞的細胞基因組包含編碼重組蛋白的開放閱讀框。在一些實施方案中，將足以增加蛋白質(zhì)的表達的調(diào)控序列插入宿主細胞基因組中，并且操作性地連接于內(nèi)源性開放閱讀框以使所述調(diào)控序列驅(qū)動從重組核酸過度表達重組蛋白。在一些實施方案中，使異源性核酸序列融合于蛋白質(zhì)的內(nèi)源性開放閱讀框，并且導(dǎo)致合成包含異源性氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述異源性氨基酸序列改變重組蛋白的細胞遷移，諸如將它引導(dǎo)至細胞器或分泌路徑中。在一些實施方案中，將編碼內(nèi)源性宿主細胞蛋白質(zhì)的開放閱讀框于質(zhì)粒上引入宿主細胞中，所述質(zhì)粒進一步包含操作性地連接于所述開放閱讀框的調(diào)控序列。在一些實施方案中，重組宿主細胞表達的重組蛋白比由在類似條件下生長的類似宿主細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量多至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍或至少100倍。在植物中產(chǎn)生重組蛋白營養(yǎng)性多肽可重組產(chǎn)生于植物，包括但不限于2013年3月15日提交的pct/us2013/032232、2013年3月15日提交的pct/us2013/032180、2013年3月15日提交的pct/us2013/032225、2013年3月15日提交的pct/us2013/032218、2013年3月15日提交的pct/us2013/032212、2013年3月15日提交的pct/us2013/032206和2013年4月29日提交的pct/us2013/038682中公開的那些生物體和產(chǎn)生方法、以及本領(lǐng)域中已知的任何在系統(tǒng)發(fā)生方面相關(guān)的生物體和其它產(chǎn)生方法。純化分泌通常認識到幾乎所有分泌細菌蛋白質(zhì)和那些來自其它單細胞宿主的蛋白質(zhì)以含有稱為信號肽的n末端序列的前蛋白質(zhì)形式被合成。這些信號肽影響蛋白質(zhì)的最終目的地和它們被轉(zhuǎn)運所依的機理。大多數(shù)信號肽可基于它們的易位機理(例如sec或tat介導(dǎo))和用于從前蛋白質(zhì)裂解信號肽的信號肽酶的類型而被置于四個組中的一個中。也提供含有脂蛋白信號肽的n末端信號肽。盡管攜帶這個類型的信號的蛋白質(zhì)通過sec易位酶加以轉(zhuǎn)運，但它們的肽信號傾向于短于正常sec信號，并且它們在c結(jié)構(gòu)域中在-3至+1位置處含有稱為脂框(l(as)(ga)c)的不同序列基序。在+1位置處的半胱氨酸在易位之后被脂質(zhì)修飾，據(jù)此信號序列由ii型信號肽酶裂解。也提供iv型或前菌毛素(prepilin)信號肽，其中iv型肽酶裂解結(jié)構(gòu)域位于n結(jié)構(gòu)域與h結(jié)構(gòu)域之間而非其它信號肽中常見的c結(jié)構(gòu)域中。如本文所提供，可使信號肽連接于含有營養(yǎng)性多肽的異源性多肽序列(即不同于信號肽所源于或獲得于的蛋白質(zhì))以產(chǎn)生重組營養(yǎng)性多肽序列。或者，如果營養(yǎng)性多肽在宿主生物體中被天然分泌，那么可為足夠的是使用天然信號序列或引導(dǎo)分泌的多種信號序列。在營養(yǎng)性多肽的一些實施方案中，連接于信號肽的羧基末端的異源性營養(yǎng)性多肽序列是可食用物種真核蛋白質(zhì)、其突變蛋白或衍生物、或多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域。在多肽的其它實施方案中，連接于信號肽的羧基末端的異源性營養(yǎng)性多肽序列是可食用物種細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、其突變蛋白或衍生物、或多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域。營養(yǎng)性多肽的純化。也提供用于從培養(yǎng)基回收分泌營養(yǎng)性多肽的方法。在一些實施方案中，在指數(shù)生長期期間或在指數(shù)生長期之后(例如在靜止期前或靜止期)從培養(yǎng)基回收分泌營養(yǎng)性多肽。在一些實施方案中，在靜止期期間從培養(yǎng)基回收分泌營養(yǎng)性多肽。在一些實施方案中，在第一時間點從培養(yǎng)基回收分泌營養(yǎng)性多肽，在足以由微生物產(chǎn)生和分泌重組營養(yǎng)性多肽的條件下繼續(xù)培養(yǎng)，并且在第二時間點從培養(yǎng)基回收重組營養(yǎng)性多肽。在一些實施方案中，通過連續(xù)方法來從培養(yǎng)基回收分泌營養(yǎng)性多肽。在一些實施方案中，通過批式方法來從培養(yǎng)基回收分泌營養(yǎng)性多肽。在一些實施方案中，通過半連續(xù)方法來從培養(yǎng)基回收分泌營養(yǎng)性多肽。在一些實施方案中，通過補料批式方法來從培養(yǎng)基回收分泌營養(yǎng)性多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員了解可用于培養(yǎng)重組細胞以產(chǎn)生(以及任選分泌)如本文公開的重組營養(yǎng)性多肽，以及用于純化和/或分離表達的重組多肽的許多適合方法。選擇用于多肽純化的方法取決于許多變量，包括目標多肽的性質(zhì)。本領(lǐng)域中已知各種純化方法，包括透濾、沉淀和色譜法。非分泌在一些方面，可在不存在分泌下分離蛋白質(zhì)。舉例來說，可使具有蛋白質(zhì)(例如在細胞表面上或細胞內(nèi))的細胞溶解，并且可使用諸如色譜法或基于抗體的蛋白質(zhì)分離的標準方法從溶解產(chǎn)物純化蛋白質(zhì)。在一些方面，可從表面酶促裂解細胞表面表達的蛋白質(zhì)。從來自可食用物種的生物物質(zhì)分離營養(yǎng)性多肽在一些實施方案中，從食物來源，或從來自可食用物種的生物物質(zhì)分離或純化具有任選存在于所需氨基酸序列中的一種所需氨基酸或多種氨基酸的營養(yǎng)性多肽。舉例來說，植物的生物物質(zhì)包括堅果仁、種子、葉和根；哺乳動物的生物物質(zhì)包括奶、肌肉、血清和肝。分離方法包括溶解、色譜法和沉淀。通過特異性溶解靶標營養(yǎng)性多肽來從生物物質(zhì)分離營養(yǎng)性多肽。使生物物質(zhì)在溶解溶液中混懸和均質(zhì)化?；跔I養(yǎng)性多肽生理化學(xué)性質(zhì)選擇溶解溶液。溶解溶液的組成是水、去污劑、鹽、ph、離液劑、親液劑和/或有機溶劑的混合物。舉例來說，已知富含脯氨酸的蛋白質(zhì)可溶于乙醇溶液中(dickey,l.c.等industrialcropsandproducts10.2(1999):137-143.)。通過在液體與生物物質(zhì)的比率(w/w)1:1、2:1、3:1、4:1或本領(lǐng)域中認可的其它比率下將生物物質(zhì)混懸于乙醇中來選擇和分離脯氨酸含量較高的營養(yǎng)性多肽。摻合混懸液，并且通過離心來移除不溶性物質(zhì)。乙醇可溶性營養(yǎng)性多肽被可溶性純化于乙醇部分中。通過使靶標營養(yǎng)性多肽沉淀或使其它蛋白質(zhì)沉淀來從生物物質(zhì)分離營養(yǎng)性多肽。沉淀劑包括鹽、ph、熱量、絮凝劑、離液劑、親液劑和有機溶劑。基于蛋白質(zhì)生理化學(xué)性質(zhì)選擇用于給定營養(yǎng)性多肽的沉淀模式。舉例來說，通過如本文所述的低溶合評分和低聚集評分來選擇在ph7下熱穩(wěn)定的營養(yǎng)性多肽。為純化這個蛋白質(zhì)，將生物物質(zhì)混懸于中性ph水溶液中并均質(zhì)化。通過離心從溶液移除不溶性物質(zhì)。為從其它蛋白質(zhì)純化營養(yǎng)性多肽，將上清液加熱至90℃，持續(xù)10分鐘。通過離心來移除不溶性物質(zhì)。通過使用3kda膜進行透析來從上清液移除小分子，從而產(chǎn)生純凈營養(yǎng)性多肽。通過各種色譜方法來從生物物質(zhì)分離營養(yǎng)性多肽。選擇以供使用的色譜模式取決于靶標營養(yǎng)性多肽的物理化學(xué)性質(zhì)。帶電荷的營養(yǎng)性多肽通過靜電相互作用結(jié)合離子交換色譜樹脂。疏水性營養(yǎng)性多肽通過疏水性締合結(jié)合疏水性相互作用色譜樹脂?；旌夏Ｊ缴V法可用于多種營養(yǎng)性多肽，并且可通過多種相互作用來起作用。金屬親和色譜法可用于結(jié)合金屬離子的營養(yǎng)性多肽。舉例來說，選擇營養(yǎng)性多肽以在ph4下具有較高的每個氨基酸電荷以使它緊密結(jié)合陽離子交換樹脂。將生物物質(zhì)添加至低離子強度ph4水溶液中并均質(zhì)化。通過離心來移除不溶性物質(zhì)。將可溶性物質(zhì)添加至陽離子交換樹脂，諸如來自lifetechnologies的xs強陽離子交換樹脂中，并且用低離子強度ph4溶液洗滌。通過添加高離子強度(例如500mmnacl)ph4溶液來從樹脂洗脫營養(yǎng)性多肽，從而產(chǎn)生純化營養(yǎng)性多肽。合成營養(yǎng)性多肽氨基酸組合物在一些實施方案中，本公開的組合物含有代表存在于所選營養(yǎng)性多肽中的多種氨基酸的摩爾比的多種游離氨基酸，在本文中稱為“營養(yǎng)性多肽摻合物”。在某些實施方案中，組合物包括游離氨基酸與營養(yǎng)性多肽兩者。如本文在這些實施方案中所用，對營養(yǎng)性多肽和含有所述營養(yǎng)性多肽的組合物和制劑的公開包括對營養(yǎng)性多肽摻合物和含有所述營養(yǎng)性多肽摻合物的組合物和制劑、以及其中第一量的氨基酸以營養(yǎng)性多肽的形式存在，并且第二量的氨基酸以游離氨基酸形式存在的組合物的公開。合成產(chǎn)生方法在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)是在不使用重組產(chǎn)生系統(tǒng)下化學(xué)合成。可使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)在液相系統(tǒng)中或在固相系統(tǒng)中進行蛋白質(zhì)合成(參見例如atherton,e.,sheppard,r.c.(1989).solidphasepeptidesynthesis:apracticalapproach.oxford,england:irlpress；stewart,j.m.,young,j.d.(1984).solidphasepeptidesynthesis(第2版).rockford:piercechemicalcompany)。肽化學(xué)和合成方法在本領(lǐng)域中是熟知的，并且本公開的蛋白質(zhì)可使用本領(lǐng)域中已知的任何方法制備。這種方法的一非限制性實例是合成樹脂結(jié)合的肽(包括用于氨基酸脫保護的方法、用于從樹脂裂解肽以及用于它的純化的方法)。舉例來說，可用于合成肽的fmoc保護的氨基酸衍生物是推薦的標準物：fmoc-ala-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-his(trt)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh和fmoc-val-oh(由例如anaspec、bachem、irisbiotech或novabiochem供應(yīng))。例如使用基于fmoc的化學(xué)，在來自proteintechnologies的prelude固相肽合成儀(tucson,ariz.85714u.s.a.)上進行樹脂結(jié)合的肽合成。適于制備c末端羧酸的樹脂是可從novabiochem獲得的預(yù)裝載低載量wang樹脂(例如低載量fmoc-thr(tbu)-wang樹脂，ll，0.27mmol/g)。適于合成具有c末端酰胺的肽的樹脂是可從matrix-innovation獲得的pal-chemmatrix樹脂。n末端α氨基用boc保護?？捎煤?0％哌啶的nmp持續(xù)2x3分鐘來實現(xiàn)fmoc脫保護。偶聯(lián)化學(xué)是用dic/hoat/可力丁(collidine)在nmp中來達成。添加氨基酸/hoat溶液(0.3m/0.3m于nmp中，在摩爾過量3-10倍下)至樹脂中，隨后依次添加相同摩爾當量的dic(3m于nmp中)和可力丁(3m于nmp中)。舉例來說，對于以下規(guī)模反應(yīng)，每次偶聯(lián)使用以下量的0.3m氨基酸/hoat溶液：規(guī)模/ml，0.05mmol/1.5ml、0.10mmol/3.0ml、0.25mmol/7.5ml。偶聯(lián)時間是2x30分鐘或1x240分鐘。在合成之后，樹脂用dcm洗滌，并且通過用tfa/tis/水(95/2.5/2.5)處理2-3小時，隨后用乙醚沉淀來從樹脂裂解肽。沉淀用乙醚洗滌。將粗肽溶解于水和mecn的適合混合物(諸如水/mecn(4:1))中，并且通過反相制備型hplc(watersdeltaprep4000或gilson)在含有c18硅膠的管柱上純化。用mecn于含有0.1％tfa的水中的遞增梯度進行洗脫。通過分析型hplc或uplc來檢查相關(guān)洗脫份。混合含有純凈靶標肽的洗脫份并在減壓下濃縮。分析(hplc、lcms)所得溶液，并且使用化學(xué)發(fā)光氮特異性hplc檢測器(antek8060hplc-clnd)或通過測量280nm下的uv吸收來定量產(chǎn)物。將產(chǎn)物分配至玻璃小瓶中。小瓶用millipore玻璃纖維預(yù)過濾器封蓋。冷凍干燥提供呈白色固體狀的肽三氟乙酸鹽?？衫缡褂帽绢I(lǐng)域中已知的標準方法，利用lcms和/或uplc來檢測和表征所得肽。可在由watersacquityuplc系統(tǒng)和來自micromass的lctpremierxe質(zhì)譜儀組成的裝備上進行l(wèi)cms。uplc泵連接于兩個含有以下的洗脫劑儲集器：a)含0.1％甲酸的水；和b)含0.1％甲酸的乙腈。分析通過將適當體積的樣品(優(yōu)選2-10μl)注射于用a和b的梯度洗脫的管柱上來在室溫下進行。uplc條件、檢測器設(shè)置和質(zhì)譜儀設(shè)置是：管柱：watersacquityuplcbeh，c-18，1.7μm，2.1mmx50mm。梯度：在4.0分鐘(或者8.0分鐘)期間，線性5％-95％乙腈，在0.4ml/min下。檢測：214nm(來自tuv(可調(diào)諧uv檢測器)的模擬輸出)。ms離子化模式：api-es掃描：100-2000amu(或者500-2000amu)，步進0.1amu。uplc方法是熟知的?？墒褂玫姆椒ǖ姆窍拗菩詫嵗枋鲈诶?013年2月28日公開的us2013/0053310a1的第16-17頁處。使酶活性失活在一些方面，蛋白質(zhì)是酶或具有酶活性。在一些方面，可合乎需要的是使酶的酶活性失活或降低。本領(lǐng)域中已知用于達成酶失活的各種方法，包括施加熱量，施加一種或多種去污劑，施加一種或多種金屬螯合劑，還原，氧化，施加一種或多種離液劑，共價修飾，例如通過酶促或化學(xué)改變來改變翻譯后修飾，改變ph(酸性和堿性)，或改變鹽濃度。舉例來說，熱失活通常在某一溫度下進行某一時間量，例如通過在65℃下孵育20分鐘來使大多數(shù)核酸內(nèi)切酶失活。在一些方面，可例如通過使酶錯誤折疊來使酶突變以消除或降低酶活性。此外，高壓二氧化碳(hpcd)已被證明是一種有效用于使酶失活的非熱處理技術(shù)。參見hu等,enzymeinactivationinfoodprocessingusinghighpressurecarbondioxidetechnology；criticalreviewinfoodscienceandnutrition；第52卷,第2期,2013。本領(lǐng)域中已知各種其它形式的酶失活，其參數(shù)可根據(jù)需要加以調(diào)整以相應(yīng)改變酶活性。各種酶失活方法和賦形劑諸如氧化，例如漂白，h2o2和氧化乙烯；還原二硫化物，例如dtt、bme和tcep；使用na2co3、tris堿或na2hpo4達成高ph；使用檸檬酸、硼酸、乙酸或trishcl達成低ph；使用溫度30℃-100℃在一段時期內(nèi)加熱；用諸如硫氰酸鹽、尿素、鹽酸胍或cacl2的離液劑使蛋白質(zhì)展開；用諸如mpd、triton(非離子)、chaps(兩性離子)或吐溫(tween)(非離子)的表面活性劑(例如去污劑)使蛋白質(zhì)展開或用edta或檸檬酸鹽螯合金屬。細胞增殖測定細胞增殖測定可用于測量蛋白質(zhì)或其部分對增殖過程的相對重要性。在一些方面，可在饑餓條件下在存在或不存在目標蛋白質(zhì)下測量細胞增殖。舉例來說，可在組織培養(yǎng)孵育器中用具有或缺乏各相應(yīng)目標蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基在一段時期(例如48小時)內(nèi)使細胞饑餓。在孵育之后，可添加諸如alamarblue的檢測劑，并且將熒光測量為增殖輸出。在一些方面，細胞增殖可被測量為對目標蛋白質(zhì)的劑量應(yīng)答的一部分。舉例來說，可在組織培養(yǎng)孵育器中在具有或缺乏各相應(yīng)目標蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中使細胞饑餓。在饑餓之后，可接著用不同濃度的在初始培養(yǎng)中于缺乏相應(yīng)蛋白質(zhì)的相同來源培養(yǎng)基中缺乏的蛋白質(zhì)(例如0、20、100或1000μm)處理細胞?？山又诮M織培養(yǎng)孵育器中再次孵育細胞。在孵育之后，可添加諸如alamarblue的檢測劑，并且讀取熒光。過敏原性測定對于一些實施方案，優(yōu)選的是蛋白質(zhì)不展現(xiàn)不適當較高的過敏原性。因此，在一些實施方案中，評估蛋白質(zhì)的潛在過敏原性。這可通過本領(lǐng)域中已知的任何適合方法進行。在一些實施方案中，計算過敏原性評分。過敏原性評分是一種基于who推薦(fao.org/ag/agn/food/pdf/allergygm.pdf)的以一級序列為基礎(chǔ)的用于評估蛋白質(zhì)與任何已知過敏原的類似程度的量度，其中主要預(yù)測是靶標與已知過敏原之間的高同一性百分比可能指示交叉反應(yīng)性。對于給定蛋白質(zhì)，可通過一對基于序列同源性的互補測試中的一個或兩個來評估引發(fā)過敏應(yīng)答的可能性。第一測試通過使用采用blosum50取代矩陣、空位開放罰分10和空位延伸罰分2的fasta算法，與某一數(shù)據(jù)庫的已知過敏原進行整體-整體序列比對來確定蛋白質(zhì)跨越整個序列的同一性百分比。已表明整體同源性小于50％的蛋白質(zhì)不可能具有過敏原性(goodmanr.e.等allergenicityassessmentofgeneticallymodifiedcrops—whatmakessense？nat.biotech.26,73-81(2008)；aalberser.c.structuralbiologyofallergens.j.allergyclin.immunol.106,228-238(2000))。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)與用于分析的數(shù)據(jù)庫中任何已知過敏原具有小于50％整體同源性。在一些實施方案中，使用小于40％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用小于30％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用小于20％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用小于10％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用40％至50％的截斷值。在一些實施方案中，使用30％至50％的截斷值。在一些實施方案中，使用20％至50％的截斷值。在一些實施方案中，使用10％至50％的截斷值。在一些實施方案中，使用5％至50％的截斷值。在一些實施方案中，使用0％至50％的截斷值。在一些實施方案中，使用與用于分析的數(shù)據(jù)庫中任何已知過敏原的整體同源性大于50％的截斷值。在一些實施方案中，使用50％至60％的截斷值。在一些實施方案中，使用50％至70％的截斷值。在一些實施方案中，使用50％至80％的截斷值。在一些實施方案中，使用50％至90％的截斷值。在一些實施方案中，使用55％至60％的截斷值。在一些實施方案中，使用65％至70％的截斷值。在一些實施方案中，使用70％至75％的截斷值。在一些實施方案中，使用75％至80％的截斷值。第二測試通過使用采用blosum50取代矩陣、空位開放罰分10和空位延伸罰分2的fasta算法，將各片段與某一數(shù)據(jù)庫的已知過敏原進行整體-局部序列比對以確定所有可能的連續(xù)80個氨基酸的片段的局部過敏原性來沿蛋白質(zhì)序列評估局部過敏原性。任何80個氨基酸的窗口與任何過敏原的最高同一性百分比被取作目標蛋白質(zhì)的最終評分。who指導(dǎo)方針關(guān)于這個片段測試建議使用35％同一性截斷值。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，蛋白質(zhì)的所有可能的片段都與用于使用這個測試進行分析的數(shù)據(jù)庫中任何已知過敏原具有小于35％局部同源性。在一些實施方案中，使用小于30％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用30％至35％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用25％至30％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用20％至25％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用15％至20％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用10％至15％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用5％至10％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用0％至5％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用大于35％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至40％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用40％至45％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用45％至50％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用50％至55％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用55％至60％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用65％至70％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用70％至75％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用75％至80％同源性的截斷值。熟練技術(shù)人員能夠出于這個目的鑒定和使用已知過敏原的適合數(shù)據(jù)庫。在一些實施方案中，數(shù)據(jù)庫是通過從一個以上數(shù)據(jù)庫來源選擇蛋白質(zhì)加以定制。在一些實施方案中，定制數(shù)據(jù)庫包含由食物過敏研究和資源程序(foodallergyresearchandresourceprogram)(allergenonline.org/)、uniprot注釋(uniprotannotations)(uniprot.org/docs/allergen)和過敏原性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(sdap，fermi.utmb.edu/sdap/sdap_lnk.html)收集的匯合過敏原清單。這個數(shù)據(jù)庫包括由國際免疫學(xué)聯(lián)合會(internationalunionofimmunologicalsocieities)(iuis，allergen.org/)當前認可的所有過敏原以及尚末官方命名的許多其它過敏原。在一些實施方案中，數(shù)據(jù)庫包含可在已知數(shù)據(jù)庫中獲得的一小組已知過敏原蛋白質(zhì)；也就是說數(shù)據(jù)庫是一小組定制選擇的已知過敏原蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，已知過敏原的數(shù)據(jù)庫包含至少10種蛋白質(zhì)、至少20種蛋白質(zhì)、至少30種蛋白質(zhì)、至少40種蛋白質(zhì)、至少50種蛋白質(zhì)、至少100種蛋白質(zhì)、至少200種蛋白質(zhì)、至少300種蛋白質(zhì)、至少400種蛋白質(zhì)、至少500種蛋白質(zhì)、至少600種蛋白質(zhì)、至少700種蛋白質(zhì)、至少800種蛋白質(zhì)、至少900種蛋白質(zhì)、至少1,000種蛋白質(zhì)、至少1,100種蛋白質(zhì)、至少1,200種蛋白質(zhì)、至少1,300種蛋白質(zhì)、至少1,400種蛋白質(zhì)、至少1,500種蛋白質(zhì)、至少1,600種蛋白質(zhì)、至少1,700種蛋白質(zhì)、至少1,800種蛋白質(zhì)、至少1,900種蛋白質(zhì)或至少2,000種蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，已知過敏原的數(shù)據(jù)庫包含100至500種蛋白質(zhì)、200至1,000種蛋白質(zhì)、500至1,000種蛋白質(zhì)、500至1,000種蛋白質(zhì)或1,000至2,000種蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，相對于過敏原數(shù)據(jù)庫測試蛋白質(zhì)的所有(或一小組選擇的)具有不同長度的連續(xù)氨基酸窗口(例如70、60、50、40、30、20、10、8或6個氨基酸的窗口)，并且鑒定具有100％同一性、95％或高于95％同一性、90％或高于90％同一性、85％或高于85％同一性、80％或高于80％同一性、75％或高于75％同一性、70％或高于70％同一性、65％或高于65％同一性、60％或高于60％同一性、55％或高于55％同一性、或50％或高于50％同一性匹配的肽序列以進一步考查潛在過敏原性。預(yù)測蛋白質(zhì)的過敏原性的另一方法在于評估所述蛋白質(zhì)與人來源的蛋白質(zhì)的同源性。人免疫系統(tǒng)被定期暴露于眾多可能的過敏原性蛋白質(zhì)，并且具有在宿主身體的蛋白質(zhì)與外源性蛋白質(zhì)之間進行區(qū)分的固有能力。這個能力的精確本質(zhì)并非總是明確的，并且存在由于身體未能區(qū)分自身與非自身而產(chǎn)生的許多疾病(例如關(guān)節(jié)炎)。盡管如此，基本分析是與人蛋白質(zhì)共有一定程度的序列同源性的蛋白質(zhì)引發(fā)免疫應(yīng)答的可能性較小。特定來說，已顯示對于一些具有已知過敏原性成員的蛋白質(zhì)家族(原肌凝蛋白、小白蛋白、酪蛋白)，相對于已知過敏原性蛋白質(zhì)，攜帶與它們的人對應(yīng)物的更大序列同源性的那些蛋白質(zhì)不被認為具有過敏原性(jenkinsj.a.等evolutionarydistancefromhumanhomologsreflectsallergenicityofanimcalfoodproteins.j.allergyclinimmunol.120(2007):1399-1405)。對于給定蛋白質(zhì)，人同源性評分是通過由使用采用blosum50取代矩陣、空位開放罰分10和空位延伸罰分2的fasta算法進行整體-局部比對以確定所述蛋白質(zhì)與某一數(shù)據(jù)庫(例如uniprot數(shù)據(jù)庫)的人蛋白質(zhì)的最大同一性百分比來測量。根據(jù)jenkins等(jenkinsj.a.等evolutionarydistancefromhumanhomologsreflectsallergenicityofanimalfoodproteins.j.allergyclinimmunol.120(2007):1399-1405)，與人蛋白質(zhì)的序列同一性高于約62％的蛋白質(zhì)具有過敏原性的可能性較小。熟練技術(shù)人員能夠出于這個目的鑒定和使用已知人蛋白質(zhì)的適合數(shù)據(jù)庫，例如通過搜索uniprot數(shù)據(jù)庫(uniprot.org)。在一些實施方案中，數(shù)據(jù)庫是通過從一個以上數(shù)據(jù)庫來源選擇蛋白質(zhì)加以定制。當然，數(shù)據(jù)庫可為但無需為全面的。在一些實施方案中，數(shù)據(jù)庫包含一小組人蛋白質(zhì)；也就是說數(shù)據(jù)庫是一小組定制選擇的人蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，人蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫包含至少10種蛋白質(zhì)、至少20種蛋白質(zhì)、至少30種蛋白質(zhì)、至少40種蛋白質(zhì)、至少50種蛋白質(zhì)、至少100,種蛋白質(zhì)、至少200種蛋白質(zhì)、至少300種蛋白質(zhì)、至少400種蛋白質(zhì)、至少500種蛋白質(zhì)、至少600種蛋白質(zhì)、至少700種蛋白質(zhì)、至少800種蛋白質(zhì)、至少900種蛋白質(zhì)、至少1,000種蛋白質(zhì)、至少2,000種蛋白質(zhì)、至少3,000種蛋白質(zhì)、至少4,000種蛋白質(zhì)、至少5,000種蛋白質(zhì)、至少6,000種蛋白質(zhì)、至少7,000種蛋白質(zhì)、至少8,000種蛋白質(zhì)、至少9,000種蛋白質(zhì)或至少10,000種蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，數(shù)據(jù)庫包含100至500種蛋白質(zhì)、200至1,000種蛋白質(zhì)、500至1,000種蛋白質(zhì)、500至1,000種蛋白質(zhì)、1,000至2,000種蛋白質(zhì)、1,000至5,000種蛋白質(zhì)、或5,000至10,000種蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，數(shù)據(jù)庫包含所有已知人蛋白質(zhì)中的至少90％、至少95％或至少99％。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)與人蛋白質(zhì)至少20％同源。在一些實施方案中，使用至少30％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用至少40％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用至少50％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用至少60％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用至少70％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用至少80％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用至少62％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用至少20％同源性至至少30％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用至少30％同源性至至少40％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用至少50％同源性至至少60％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用至少60％同源性至至少70％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用至少70％同源性至至少80％同源性的截斷值。熱穩(wěn)定性測定如本文所用，“穩(wěn)定”蛋白質(zhì)是抵抗改變目標蛋白質(zhì)的生物物理(例如溶解度)、生物(例如可消化性)或組成(例如亮氨酸氨基酸的比例)性狀的變化(例如展開、氧化、聚集、水解等)的蛋白質(zhì)?？墒褂帽绢I(lǐng)域中已知的各種測定來測量蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，并且可選擇本文公開并具有高于閾值的穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，選擇顯示的熱穩(wěn)定性類似于或好于乳清蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)。熱穩(wěn)定性是可幫助預(yù)測蛋白質(zhì)的儲存期限的性質(zhì)。在測定的一些實施方案中，蛋白質(zhì)樣品的穩(wěn)定性是通過在暴露于極端溫度之后使用尺寸排阻色譜法(sec)監(jiān)測聚集體形成來測定。將待測試的蛋白質(zhì)的水性樣品放置在90℃下的加熱塊中，并且在0、1、5、10、30和60分鐘之后取樣以進行sec分析。蛋白質(zhì)是通過監(jiān)測214nm下的吸光度來檢測，并且聚集體被表征為洗脫快于目標蛋白質(zhì)的峰。峰面積無總體變化指示在熱處理期間無蛋白質(zhì)沉淀。當在這種測定中暴露于90℃時，乳清蛋白質(zhì)已顯示快速形成約80％聚集體。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是通過在結(jié)合隨溫度增加而作為蛋白質(zhì)變性物形成的聚集蛋白質(zhì)的疏水性染料(例如熱漂移穩(wěn)定性測定試劑盒，enzolifesciences)存在下將樣本從25℃緩慢加熱至95℃來測定(niesen,f.h.,berglund,h.和vadadi,m.,2007.theuseofdifferentialscanningfluorimetrytodetectligandinteractionsthatpromoteproteinstability.natureprotocols,第2卷,第2212-2221頁)。在結(jié)合后，染料的熒光顯著增加，此由rtpcr儀器記錄并表示為蛋白質(zhì)的熔解曲線(lavinder,j.j.,hari,s.b.,suillivan,b.j.和magilery,t.j.,2009.high-throughputthermalscanning:ageneral,rapiddye-bindingthermalshiftscreenforproteinengineering.journaloftheamericanchemicalsociety,第3794-3795頁)。在完成熱漂移之后，考查樣品的不溶性沉淀，并且由分析型尺寸排阻色譜法(sec)進一步分析。溶解度測定在本文公開的蛋白質(zhì)的一些實施方案中，蛋白質(zhì)是可溶性的。溶解度可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法來測量。在一些實施方案中，溶解度通過離心濃縮，隨后進行蛋白質(zhì)濃度測定來考查。根據(jù)使用兩種方法的方案測試蛋白質(zhì)于20mmhepes(ph7.5)中的樣品的蛋白質(zhì)濃度，所述方法是coomassie加強型(bradford)蛋白質(zhì)測定(thermoscientific)和二喹啉甲酸(bca)蛋白質(zhì)測定(sigmadaldrich)。基于這些測量結(jié)果，添加10mg蛋白質(zhì)至amiconultra3kda離心過濾器(millipore)中。樣品通過在10,000xg下離心30分鐘來濃縮?？疾樽罱K現(xiàn)時濃縮的樣品的蛋白質(zhì)沉淀，接著如上使用兩種方法(bradford和bca)測試蛋白質(zhì)濃度。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)在生理ph下具有的最終溶解度限度是至少5g/l、10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l或100g/l。在一些實施方案中，在生理ph下在濃度大于5g/l、或10g/l、或20g/l、或30g/l、或40g/l、或50g/l、或100g/l下，大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％、大于99％或大于99.5％的蛋白質(zhì)可溶，其中未觀察到蛋白質(zhì)沉淀。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)的溶解度高于通常在考查乳清(12.5g/l；pelegrine等,lebensm.-wiss.u.-technol.38(2005)77-80)和大豆(10g/l；lee等,jaocs80(1)(2003)85-90)的溶解度限度的研究中報道的溶解度。真核蛋白質(zhì)常被糖基化，并且連接于蛋白質(zhì)的碳水化合物鏈發(fā)揮各種功能。n連接和o連接的糖基化是存在于蛋白質(zhì)中的兩種最常見形式的糖基化。n連接的糖基化是糖分子連接于蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基中的氮原子。n連接的糖基化存在于天冬酰胺和精氨酸殘基處。o連接的糖基化是糖分子連接于蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基中的氧原子。o連接的糖基化存在于蘇氨酸和絲氨酸殘基處。糖基化蛋白質(zhì)常比它們的未糖基化形式更可溶。就蛋白質(zhì)藥物而言，適當糖基化通常賦予高活性、適當抗原結(jié)合性、在血液中的更好穩(wěn)定性等。然而，糖基化必定意指蛋白質(zhì)“攜帶”糖部分。所述糖部分可降低包括重組蛋白的本公開的蛋白質(zhì)的適用性。舉例來說，如實施例中所證明，將相同蛋白質(zhì)的糖基化形式和非糖基化形式的消化進行比較顯示非糖基化形式比糖基化形式更快速被消化。出于這些原因，在一些實施方案中，本公開的營養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含較低糖基化或不包含糖基化。舉例來說，在一些實施方案中，蛋白質(zhì)包含的非糖基化氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率是至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)不包含任何糖基化。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)在它被產(chǎn)生之后或在它被分離之后被去糖基化?？赏ㄟ^本領(lǐng)域中已知的任何方法制備低糖基化或無糖基化蛋白質(zhì)。舉例來說，可使用酶促方法和/或化學(xué)方法(biochem.j.(2003)376,第339-350頁.)。酶是在研究規(guī)模上商業(yè)產(chǎn)生以移除n連接和o連接的寡糖?；瘜W(xué)方法包括使用三氟甲烷磺酸來選擇性斷裂n連接和o連接的肽-糖鍵。這個方法產(chǎn)生的去糖基化常比使用酶促方法達成的去糖基化更完全。在其它實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)是由宿主生物體在低糖基化或無糖基化下產(chǎn)生。大多數(shù)細菌和其它原核生物具有極其有限的使蛋白質(zhì)(尤其是異源性蛋白質(zhì))糖基化的能力。因此，在本公開的一些實施方案中，蛋白質(zhì)是在微生物中重組制備以使重組蛋白的糖基化水平較低或無糖基化。在一些實施方案中，重組蛋白的糖基化水平低于如它所源于的生物體中存在的蛋白質(zhì)的糖基化水平。蛋白質(zhì)的糖基化可基于宿主生物體而變化，換句話說，一些宿主相對于一種或多種其它宿主將產(chǎn)生更大程度的糖基化；而其它宿主相對于一種或多種其它宿主將產(chǎn)生更小程度的糖基化?？苫诶绱嬖诘奶腔|(zhì)量和/或存在的糖基化位點總數(shù)測量糖基化在量方面的差異。毒性和抗營養(yǎng)性測定對于大多數(shù)實施方案，優(yōu)選的是蛋白質(zhì)不展現(xiàn)不適當較高的毒性。因此，在一些實施方案中，評估蛋白質(zhì)的潛在毒性。這可通過本領(lǐng)域中已知的任何適合方法進行。在一些實施方案中，毒性評分是通過確定蛋白質(zhì)與各數(shù)據(jù)庫的已知毒性蛋白質(zhì)(例如從uniprot數(shù)據(jù)庫鑒定的毒性蛋白質(zhì))的同一性百分比來計算。目標蛋白質(zhì)相對于數(shù)據(jù)庫的已知毒素的整體-整體比對是使用采用blosum50取代矩陣、空位開放罰分10和空位延伸罰分2的fasta算法來進行。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，蛋白質(zhì)與已知毒素小于35％同源。在一些實施方案中，使用小于35％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用30％至35％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用25％至35％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用20％至35％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用15％至35％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用10％至35％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用5％至35％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用0％至35％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用大于35％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至40％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至45％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至50％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至55％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至60％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至70％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至75％同源性的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至80％同源性的截斷值。熟練技術(shù)人員能夠出于這個目的鑒定和使用已知毒素的適合數(shù)據(jù)庫，例如通過搜索uniprot數(shù)據(jù)庫(uniprot.org)。在一些實施方案中，數(shù)據(jù)庫是通過從一個以上數(shù)據(jù)庫來源選擇鑒定為毒素的蛋白質(zhì)加以定制。在一些實施方案中，數(shù)據(jù)庫包含一小組已知毒性蛋白質(zhì)；也就是說數(shù)據(jù)庫是一小組定制選擇的已知毒性蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，毒性蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫包含至少10種蛋白質(zhì)、至少20種蛋白質(zhì)、至少30種蛋白質(zhì)、至少40種蛋白質(zhì)、至少50種蛋白質(zhì)、至少100,種蛋白質(zhì)、至少200種蛋白質(zhì)、至少300種蛋白質(zhì)、至少400種蛋白質(zhì)、至少500種蛋白質(zhì)、至少600種蛋白質(zhì)、至少700種蛋白質(zhì)、至少800種蛋白質(zhì)、至少900種蛋白質(zhì)、至少1,000種蛋白質(zhì)、至少2,000種蛋白質(zhì)、至少3,000種蛋白質(zhì)、至少4,000種蛋白質(zhì)、至少5,000種蛋白質(zhì)、至少6,000種蛋白質(zhì)、至少7,000種蛋白質(zhì)、至少8,000種蛋白質(zhì)、至少9,000種蛋白質(zhì)或至少10,000種蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，數(shù)據(jù)庫包含100至500種蛋白質(zhì)、200至1,000種蛋白質(zhì)、500至1,000種蛋白質(zhì)、500至1,000種蛋白質(zhì)、1,000至2,000種蛋白質(zhì)、1,000至5,000種蛋白質(zhì)、或5,000至10,000種蛋白質(zhì)?？範I養(yǎng)性和抗營養(yǎng)物對于一些實施方案，優(yōu)選的是蛋白質(zhì)不展現(xiàn)抗營養(yǎng)活性(“抗營養(yǎng)性”)，即蛋白質(zhì)具有阻止從食物吸收營養(yǎng)物的潛力。導(dǎo)致所述抗營養(yǎng)性的抗營養(yǎng)性序列的實例包括蛋白酶抑制劑，其抑制腸中胰蛋白酶、胃蛋白酶和其它蛋白酶的作用，從而阻止蛋白質(zhì)的消化和隨后吸收。本文公開含有大致上不含抗營養(yǎng)性序列的分離的營養(yǎng)性多肽的制劑。在一些實施方案中，營養(yǎng)性多肽具有的抗營養(yǎng)性類似性評分低于約1，低于約0.5，或低于約0.1。營養(yǎng)性多肽以大于約10g的量存在于制劑中，并且制劑大致上不含抗營養(yǎng)性因子。制劑以不大于約500ml的體積以液體、半液體或凝膠形式，或以不大于約200g的質(zhì)量以固體或半固體形式存在。營養(yǎng)性多肽可與蛋白酶抑制劑(諸如絲氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin)多肽家族的成員)具有低同源性，例如小于90％同一，或小于85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或小于5％同一。因此，在一些實施方案中，評估蛋白質(zhì)的潛在抗營養(yǎng)性。這可通過本領(lǐng)域中已知的任何適合方法進行。在一些實施方案中，抗營養(yǎng)性評分是通過確定蛋白質(zhì)與各數(shù)據(jù)庫的已知蛋白酶抑制劑(例如從uniprot數(shù)據(jù)庫鑒定的蛋白酶抑制劑)的同一性百分比來計算。目標蛋白質(zhì)相對于數(shù)據(jù)庫的已知蛋白酶抑制劑的整體-整體比對是使用采用blosum50取代矩陣、空位開放罰分10和空位延伸罰分2的fasta算法來進行，以鑒定蛋白質(zhì)是否與已知抗蛋白質(zhì)同源。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，蛋白質(zhì)與用于分析的數(shù)據(jù)庫中任何已知抗蛋白質(zhì)(例如任何已知蛋白酶抑制劑)具有小于35％整體同源性。在一些實施方案中，使用小于35％同一性的截斷值。在一些實施方案中，使用30％至35％的截斷值。在一些實施方案中，使用25％至35％的截斷值。在一些實施方案中，使用20％至35％的截斷值。在一些實施方案中，使用15％至35％的截斷值。在一些實施方案中，使用10％至35％的截斷值。在一些實施方案中，使用5％至35％的截斷值。在一些實施方案中，使用0％至35％的截斷值。在一些實施方案中，使用大于35％同一性的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至40％的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至45％的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至50％的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至55％的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至60％的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至70％的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至75％的截斷值。在一些實施方案中，使用35％至80％的截斷值。熟練技術(shù)人員能夠出于這個目的鑒定和使用已知蛋白酶抑制劑的適合數(shù)據(jù)庫，例如通過搜索uniprot數(shù)據(jù)庫(uniprot.org)。在一些實施方案中，數(shù)據(jù)庫是通過從一個以上數(shù)據(jù)庫來源選擇鑒定為蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)加以定制。在一些實施方案中，數(shù)據(jù)庫包含可在數(shù)據(jù)庫中獲得的一小組已知蛋白酶抑制劑；也就是說數(shù)據(jù)庫是一小組定制選擇的已知蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，已知蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫包含至少10種蛋白質(zhì)、至少20種蛋白質(zhì)、至少30種蛋白質(zhì)、至少40種蛋白質(zhì)、至少50種蛋白質(zhì)、至少100種蛋白質(zhì)、至少200種蛋白質(zhì)、至少300種蛋白質(zhì)、至少400種蛋白質(zhì)、至少500種蛋白質(zhì)、至少600種蛋白質(zhì)、至少700種蛋白質(zhì)、至少800種蛋白質(zhì)、至少900種蛋白質(zhì)、至少1,000種蛋白質(zhì)、至少1,100種蛋白質(zhì)、至少1,200種蛋白質(zhì)、至少1,300種蛋白質(zhì)、至少1,400種蛋白質(zhì)、至少1,500種蛋白質(zhì)、至少1,600種蛋白質(zhì)、至少1,700種蛋白質(zhì)、至少1,800種蛋白質(zhì)、至少1,900種蛋白質(zhì)或至少2,000種蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，已知蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫包含100至500種蛋白質(zhì)、200至1,000種蛋白質(zhì)、500至1,000種蛋白質(zhì)、500至1,000種蛋白質(zhì)、或1,000至2,000種蛋白質(zhì)、或2,000至3,000種蛋白質(zhì)。在其它實施方案中，使用展現(xiàn)某一程度的蛋白酶抑制劑活性的蛋白質(zhì)。舉例來說，在一些實施方案中，這種蛋白質(zhì)可為適用的，因為當營養(yǎng)性蛋白質(zhì)被消耗時，它延遲蛋白酶消化以使蛋白質(zhì)在被消化之前在胃腸道內(nèi)穿過較大距離，由此延遲吸收。舉例來說，在一些實施方案中，蛋白質(zhì)抑制胃消化而非腸消化。delaneyb.等(evaluationofproteinsafetyinthecontextofagriculturalbiotechnology.food.chem.toxicol.46(2008:s71-s97))建議當評估可能的食物蛋白質(zhì)的安全性時，應(yīng)避免已知毒性蛋白質(zhì)與抗蛋白質(zhì)兩者。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，蛋白質(zhì)與某一數(shù)據(jù)庫的已知毒性蛋白質(zhì)具有有利較低水平的整體同源性和/或與某一數(shù)據(jù)庫的已知抗營養(yǎng)性蛋白質(zhì)(例如蛋白酶抑制劑)具有有利較低水平的整體同源性，如本文所定義?？範I養(yǎng)物。提供缺乏抗營養(yǎng)物(anti-nutrient/antinutrient)的營養(yǎng)性組合物?？範I養(yǎng)物是通常除蛋白質(zhì)以外的化合物，其通常見于植物性食物中，并且已被發(fā)現(xiàn)具有不利作用與在一些情況下某些健康益處兩者。舉例來說，已顯示植酸(phyticacid)、凝集素、酚類化合物、皂素(saponin)和酶抑制劑會降低營養(yǎng)物的可用性，并且導(dǎo)致生長抑制，并且植物雌激素和木酚素(lignan)已與不育問題相關(guān)聯(lián)。另一方面，已顯示植酸、凝集素、酚類化合物、淀粉酶抑制劑和皂素會降低對淀粉食物的血糖和胰島素應(yīng)答和/或血漿膽固醇和甘油三酯。此外，植酸、酚類物質(zhì)、皂素、蛋白酶抑制劑、植物雌激素和木酚素已與癌癥風(fēng)險降低相關(guān)聯(lián)。提供用于通過以下方式來降低食物產(chǎn)品中的抗營養(yǎng)性因子的量的方法：以包括溫度大于約90℃的蒸汽或熱空氣的熱處理來處理所述食物產(chǎn)品至少1分鐘，使處理的食物產(chǎn)品與含有分離的營養(yǎng)性多肽的組合物組合。任選地，熱處理步驟使至少一種抗營養(yǎng)性因子(諸如皂素、凝集素和谷醇溶蛋白、蛋白酶抑制劑或植酸)降解。如下在蛋白質(zhì)組合物中檢測抗營養(yǎng)性因子。植酸：wheeler和ferrel(wheeler,e.l.,ferrel,r.e.,cerealchem.1971,48,312)的程序用于測定于3％三氯乙酸中提取的植酸。棉子糖家族寡糖：蛋白質(zhì)樣品用70％乙醇，使用soxhlet裝置提取6-8小時，并且薄層色譜法用于根據(jù)tanaka等(tanaka,m.,thananunkul,d.,lee,t.c.,chichester,c.o.,j.foodsci.1975,40,1087-1088)的程序來定量測定提取物中的棉子糖和水蘇糖。胰蛋白酶抑制劑：kakade等(kakade,m.l.,rackis,j.j.,mcghee,j.e.,puski,g.,cerealchem.1974,51,376-82)的方法用于測定原始樣品和處理樣品中的胰蛋白酶抑制劑活性。一個胰蛋白酶抑制劑單位(tiu)定義為在10分鐘內(nèi)在410nm下的吸光度降低0.01，并且數(shù)據(jù)表示為tiu*mg-1。淀粉酶抑制劑：根據(jù)baker等(baker,j.e.,woo,s.m.,throne,j.e.,finny,p.l.,environm.entomol.1991,20,53±60)的程序于0.15mnacl中提取抑制劑，并且通過huesing等(huesing,j.e.,shade,r.e.,chrispeels,m.j.,murdok,l.l.,plantphysiol.1991,96,993±996)的方法來測定。一個淀粉酶抑制劑單位(aiu)定義為對每分鐘產(chǎn)生1mg麥芽糖單水合物的淀粉酶部分產(chǎn)生50％抑制的量。凝集素：paredes-lopez等(paredes-lopez,o.,schevenin,m.l.,guevara-lara,f.,foodchem.1989,31,129-137)的程序應(yīng)用于使用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)提取凝集素。根據(jù)kortt(kortt,a.a.(編),eur.j.biochem.1984,138,519)測定樣品提取物中的凝集素的血凝素活性(ha)。根據(jù)lis和sharon(lis,h.,sharon,n.,methodsenzymol.1972,28,360±368)制備用胰蛋白酶處理的人紅血細胞(a、b和o)混懸液。ha被表示為產(chǎn)生陽性凝集的最高稀釋度的倒數(shù)。丹寧：根據(jù)aoac(helrich,k.(編),aoac,officialmethodsofanalysis,associationofofficialanalyticalchemists,arlington,va1990)的程序，通過folin-denis試劑將丹寧含量測定為丹寧酸。電荷測定和溶合評分可增強蛋白質(zhì)的效用的一個特征是它的電荷(或每個氨基酸電荷)。在一些實施方案中，電荷較高的蛋白質(zhì)可展現(xiàn)合乎需要的特征，諸如增加的溶解度、增加的穩(wěn)定性、抗聚集性和合乎需要的味道分布。舉例來說，展現(xiàn)溶解度增強的帶電荷蛋白質(zhì)可被配制成呈相對較低體積的溶液形式的包括高濃度蛋白質(zhì)的飲料或液體制劑，由此遞送每單位體積較大劑量的蛋白質(zhì)營養(yǎng)。展現(xiàn)溶解度增強的帶電荷蛋白質(zhì)可例如適用于其中使用者(例如運動員)想要在身體活動之前、期間或之后攝取蛋白質(zhì)的運動飲料或恢復(fù)飲料中。展現(xiàn)溶解度增強的帶電荷蛋白質(zhì)也可特別適用于其中受試者(例如患者或年長人士)需要蛋白質(zhì)營養(yǎng)，但不能攝取固體食物或大體積的液體的臨床環(huán)境中。舉例來說，多肽在ph7下的凈電荷(電荷p)可使用下式來計算：電荷p＝-0.002–(c)(0.045)–(d)(0.999)–(e)(0.998)+(h)(0.091)+(k)(1.0)+(r)(1.0)–(y)(-0.001)其中c是所述多肽中的半胱氨酸殘基的數(shù)目，d是天冬氨酸殘基的數(shù)目，e是谷氨酸殘基的數(shù)目，h是組氨酸殘基的數(shù)目，k是賴氨酸殘基的數(shù)目，r是精氨酸殘基的數(shù)目，并且y是酪氨酸殘基的數(shù)目。多肽的每個氨基酸電荷(電荷a)可通過用凈電荷(電荷p)除以氨基酸殘基的數(shù)目(n)來計算，即電荷a＝電荷p/n。(參見bassis(2007),“aprimeronpythonforlifescienceresearchers.”ploscomputbiol3(11):e199.doi:10.1371/journal.pcbi.0030199)。一種用于評估給定蛋白質(zhì)的親水性和潛在溶解度的量度是溶合評分。如果各殘基都獨立地溶合，那么溶合評分定義為所有氨基酸側(cè)鏈的用序列中的殘基總數(shù)加以標準化的總?cè)芎献杂赡?即與從氣相轉(zhuǎn)移至稀釋溶液相關(guān)的自由能變化)。側(cè)鏈溶合自由能是通過計算真空介電常數(shù)1與水介電常數(shù)80之間的靜電能量差異(通過解析poisson-boltzmann等式)，以及使用線性溶劑可及表面積模型計算非極性vanderwaals能量來計算得到(d.sitkoff,k.a.sharp,b.honig.“accuratecalculationofhydrationfreeenergiesusingmacroscopicsolventmodels”.j.phys.chem.98,1994)。對于具有可離子化側(cè)鏈的氨基酸(arg、asp、cys、glu、his、lys和tyr)，平均溶合自由能是基于在指定ph下各離子化狀態(tài)的相對概率加以使用。溶合評分開始于0并繼續(xù)以變?yōu)樨撝?，并且溶合評分負性越大，預(yù)測蛋白質(zhì)的親水性和潛在可溶性越大。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在ph7下具有溶合評分-10或小于-10。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在ph7下具有溶合評分-15或小于-15。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在ph7下具有溶合評分-20或小于-20。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在ph7下具有溶合評分-25或小于-25。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在ph7下具有溶合評分-30或小于-30。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在ph7下具有溶合評分-35或小于-35。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在ph7下具有溶合評分-40或小于-40。由于如由henderson-hasselbalch等式所定義，ph依賴于未解離弱酸([ha])與共軛堿([a-])的摩爾比，所以溶合評分隨ph而變：所有弱酸相較于它們的共軛堿都具有不同溶合自由能，并且當計算給定ph下的溶合評分時用于給定殘基的溶合自由能是那兩個值的加權(quán)平均值。因此，在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在酸性ph下具有溶合評分-10或小于-10。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在酸性ph下具有溶合評分-15或小于-15。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在酸性ph下具有溶合評分-20或小于-20。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在酸性ph下具有溶合評分-25或小于-25。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在酸性ph下具有溶合評分-30或小于-30。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在酸性ph下具有溶合評分-35或小于-35。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在酸性ph下具有溶合評分-40或小于-40。因此，在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在堿性ph下具有溶合評分-10或小于-10。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在堿性ph下具有溶合評分-15或小于-15。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在堿性ph下具有溶合評分-20或小于-20。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在堿性ph下具有溶合評分-25或小于-25。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在堿性ph下具有溶合評分-30或小于-30。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在堿性ph下具有溶合評分-35或小于-35。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在堿性ph下具有溶合評分-40或小于-40。因此，在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在選自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范圍下具有溶合評分-10或小于-10。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在選自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范圍下具有溶合評分-15或小于-15。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在選自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范圍下具有溶合評分-20或小于-20。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在選自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范圍下具有溶合評分-25或小于-25。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在選自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范圍下具有溶合評分-30或小于-30。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在選自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范圍下具有溶合評分-35或小于-35。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)在選自2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10、10-11、和11-12的ph范圍下具有溶合評分-40或小于-40。聚集測定和聚集評分在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)顯示抗聚集性，展現(xiàn)例如在高溫(例如50℃、60℃、70℃、80℃、85℃、90℃或95℃)下小于80％聚集、10％聚集，或不展現(xiàn)可檢測聚集。如本文公開的穩(wěn)定蛋白質(zhì)的一個益處是它們在使用之前可能夠儲存延長時期，在一些情況下無需冷藏或冷卻。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)被加工成干燥形式(例如通過凍干)。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)在凍干后是穩(wěn)定的。在一些實施方案中，所述凍干的蛋白質(zhì)在復(fù)原(例如液體制劑)后維持它們的穩(wěn)定性。聚集評分是用于評估給定蛋白質(zhì)的疏水性和聚集可能性的基于一級序列的量度。使用賦予疏水性殘基正值并賦予親水性殘基負值的kyte和doolittle疏水性量表(kytej,doolittlerf(1982年5月)“asimplemethodfordisplayingthehydropathiccharacterofaprotein”.j.mol.biol.157(1):105-32)，利用五個殘基的移動平均值計算蛋白質(zhì)序列的平均疏水性。聚集評分是通過確定大于零的數(shù)值的曲線下面積以及通過蛋白質(zhì)的總長度進行標準化來從所得繪圖獲取。潛伏觀點是聚集是兩個或更多個疏水性片塊集合以排除水并降低表面暴露的結(jié)果，并且蛋白質(zhì)將聚集的可能性隨它的疏水性(即聚集傾向性)殘基被密集壓緊程度而變。聚集評分開始于0并繼續(xù)以變?yōu)檎?，并且聚集評分越小，預(yù)測蛋白質(zhì)的疏水性越小，并且聚集傾向潛在越小。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有聚集評分2或小于2。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有聚集評分1.5或小于1.5。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有聚集評分1或小于1。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有聚集評分0.9或小于0.9。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有聚集評分0.8或小于0.8。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有聚集評分0.7或小于0.7。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有聚集評分0.6或小于0.6。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有聚集評分0.5或小于0.5。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有聚集評分0.4或小于0.4。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有聚集評分0.3或小于0.3。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有聚集評分0.2或小于0.2。在蛋白質(zhì)的一些實施方案中，所述蛋白質(zhì)具有聚集評分0.1或小于0.1。在一些情況下，可溶性表達是合乎需要的，因為它可增加蛋白質(zhì)的量和/或產(chǎn)率，并且有助于蛋白質(zhì)的分離和純化中的一個或多個。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)在宿主生物體中可溶性表達。溶合評分和聚集評分可用于預(yù)測重組蛋白在宿主生物體中的可溶性表達。如實施例8中所示，本公開提供證據(jù)表明溶合評分≤-20，并且聚集評分≤0.75的蛋白質(zhì)更可能在特定大腸桿菌表達系統(tǒng)中重組表達。此外，數(shù)據(jù)也表明溶合評分≤-20，并且聚集評分≤0.5的蛋白質(zhì)更可能在這個系統(tǒng)中可溶性表達。因此，在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)具有溶合評分-20或小于-20。在一些實施方案中，營養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有聚集評分0.75或小于0.75。在一些實施方案中，營養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有聚集評分0.5或小于0.5。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)具有溶合評分-20或小于-20和聚集評分0.75或小于0.75。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)具有溶合評分-20或小于-20和聚集評分0.5或小于0.5。味道和口腔特征已知某些游離氨基酸和游離氨基酸的混合物具有苦味或另外不合意味道。此外，常見蛋白質(zhì)(例如乳清和大豆)的水解產(chǎn)物常具有苦味或不合意味道。在一些實施方案中，本文公開和所述的蛋白質(zhì)不具有苦味或另外不合意味道。在一些實施方案中，本文公開和所述的蛋白質(zhì)相較于游離氨基酸、游離氨基酸的混合物和/或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中的至少一個具有更可接受的味道。在一些實施方案中，本文公開和所述的蛋白質(zhì)具有的味道等于或超過至少一種乳清蛋白質(zhì)。已知蛋白質(zhì)具有涵蓋以下五種確定味道形式的味道：甜味、酸味、苦味、咸味和鮮味。脂肪可被視為第六味道。特定蛋白質(zhì)的味道(或所述蛋白質(zhì)缺乏所述味道)可歸因于若干因素，包括一級結(jié)構(gòu)、存在帶電荷側(cè)鏈、以及蛋白質(zhì)的電子和構(gòu)象特征。在一些實施方案中，本文公開和所述的蛋白質(zhì)被設(shè)計以具有所需味道(例如甜味、咸味、鮮味)和/或不具有非所需味道(例如苦味、酸味)。在這個情形下，“設(shè)計”包括例如選擇體現(xiàn)實現(xiàn)所需味道性質(zhì)的特征的可食用物種蛋白質(zhì)，以及產(chǎn)生可食用物種多肽的具有所需味道性質(zhì)的突變蛋白。舉例來說，蛋白質(zhì)可被設(shè)計以與特定味道受體，諸如甜味受體(t1r2-t1r3異二聚體)或鮮味受體(t1r1-t1r3異二聚體、mglur4和/或mglur1)相互作用。此外，蛋白質(zhì)可被設(shè)計以不與其它味道受體(諸如苦味受體(t2r受體))相互作用或與其它味道受體具有減弱的相互作用。本文公開和所述的蛋白質(zhì)在被攝取時也可在口腔中引發(fā)不同體感，有時稱為“口感”。蛋白質(zhì)的口感可歸因于一種或多種因素，包括一級結(jié)構(gòu)、存在帶電荷側(cè)鏈、以及蛋白質(zhì)的電子和構(gòu)象特征。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)在被攝取時引發(fā)黃油或脂肪樣口感。營養(yǎng)性組合物和制劑至少一種本文公開的蛋白質(zhì)可與至少一種第二組分組合以形成組合物。在一些實施方案中，組合物中唯一氨基酸來源是至少一種本文公開的蛋白質(zhì)。在所述實施方案中，組合物的氨基酸組成將與至少一種本文公開的蛋白質(zhì)的氨基酸組成相同。在一些實施方案中，組合物包含至少一種本文公開的蛋白質(zhì)和至少一種第二蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，至少一種第二蛋白質(zhì)是本文公開的第二蛋白質(zhì)，而在其它實施方案中，至少一種第二蛋白質(zhì)不是本文公開的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，組合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20種或大于20種本文公開的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，組合物包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20種或大于20種不是本文公開的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，組合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20種或大于20種蛋白質(zhì)，并且組合物包含0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20種或大于20種不是本文公開的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)。也提供含有本文所述的營養(yǎng)性多肽的制劑。在一個方面，提供一種含有單細胞生物體分泌多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域的制劑。舉例來說，多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域含有n末端氨基酸不對應(yīng)于構(gòu)成含有多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域的單細胞生物體分泌多肽的氨基酸序列的n末端氨基酸的氨基酸序列。在一些實施方案中，構(gòu)成單細胞生物體分泌多肽的氨基酸序列是可食用物種多肽序列，并且n末端氨基酸是常見可食用物種氨基酸。此外或在替代方案中，多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域含有c末端氨基酸不對應(yīng)于構(gòu)成含有多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域的單細胞生物體分泌多肽的氨基酸序列的c末端氨基酸的氨基酸序列。在一些實施方案中，構(gòu)成單細胞生物體分泌多肽的氨基酸序列是可食用物種多肽序列，并且c末端氨基酸是常見可食用物種氨基酸。因此，在一些實施方案中，分泌多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域比同源性可食用物種多肽短至少一個氨基酸。營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域可為同源性可食用物種肽的長度的約99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或小于5％。在其它實施方案中，多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域由含有多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域的單細胞生物體分泌多肽的約1％至約99％組成。如本文所述，多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域相對于含有多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域的較大多肽通常是優(yōu)選的。多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域基于質(zhì)量可含有比包括多肽的較大物更多的營養(yǎng)。在一些實施方案中，當相較于包括多肽的較大物時，多肽營養(yǎng)性結(jié)構(gòu)域可提供合乎需要的特征，諸如增加的溶解度和更好儲存期限穩(wěn)定性。在一些實施方案中，如先前段落中所述的組合物進一步包含至少一種多肽、至少一種肽和至少一種游離氨基酸中的至少一個。在一些實施方案中，組合物包含至少一種多肽和至少一種肽。在一些實施方案中，組合物包含至少一種多肽和至少一種游離氨基酸。在一些實施方案中，組合物包含至少一種肽和至少一種游離氨基酸。在一些實施方案中，至少一種多肽、至少一種肽和/或至少一種游離氨基酸包含選自1)支鏈氨基酸，2)亮氨酸，和3)必需氨基酸的氨基酸。在一些實施方案中，至少一種多肽、至少一種肽和/或至少一種游離氨基酸由選自1)支鏈氨基酸，2)亮氨酸，和3)必需氨基酸的氨基酸組成。在一些實施方案中，組合物包含至少一種修飾的氨基酸或非標準氨基酸。修飾的氨基酸包括具有對羧基末端、氨基末端和/或側(cè)鏈中的一個或多個的修飾的氨基酸。非標準氨基酸可選自通過翻譯后修飾蛋白質(zhì)所形成的那些，例如羧化谷氨酸、羥基脯氨酸或尾下素(hypusine)。其它非標準氨基酸不見于蛋白質(zhì)中。實例包括羊毛硫氨酸(lanthionine)、2-氨基異丁酸、脫氫丙氨酸、γ-氨基丁酸、鳥氨酸和瓜氨酸。在一些實施方案中，組合物包含一種或多種d-氨基酸。在一些實施方案中，組合物包含一種或多種l-氨基酸。在一些實施方案中，組合物包含一種或多種d-氨基酸和一種或多種l-氨基酸的混合物。通過添加多肽、肽和游離氨基酸中的至少一個至組合物中，組合物中存在的支鏈氨基酸、亮氨酸和必需氨基酸中的至少一個與總氨基酸的比例可得以增加。在一些實施方案中，組合物包含至少一種碳水化合物?！疤妓衔铩笔侵柑腔蛱堑木酆衔?。術(shù)語“糖”、“多糖”、“碳水化合物”和“寡糖”可互換使用。大多數(shù)碳水化合物是具有許多羥基的醛或酮，通常在分子的各碳原子上具有一個羥基。碳水化合物通常具有分子式cnh2non。碳水化合物可為單糖、二糖、三糖、寡糖或多糖。大多數(shù)基礎(chǔ)碳水化合物是單糖，諸如葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖和果糖。二糖是兩個接合的單糖。示例性二糖包括蔗糖、麥芽糖、纖維二糖和乳糖。通常，寡糖包括三個與六個之間的單糖單元(例如棉子糖、水蘇糖)，而多糖包括六個或大于六個單糖單元。示例性多糖包括淀粉、糖原和纖維素。碳水化合物可含有修飾的糖單元，諸如2’-脫氧核糖(其中羥基被移除)、2’-氟代核糖(其中羥基被氟置換)、或n-乙酰基葡萄糖胺、含氮形式的葡萄糖(例如2’-氟代核糖、脫氧核糖和己糖)。碳水化合物可以許多不同形式存在，例如構(gòu)象異構(gòu)體、環(huán)狀形式、無環(huán)形式、立體異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、端基異構(gòu)體和異構(gòu)體。在一些實施方案中，組合物包含至少一種脂質(zhì)。如本文所用，“脂質(zhì)”包括脂肪、油、甘油三酯、膽固醇、磷脂、呈任何形式的脂肪酸，包括游離脂肪酸。脂肪、油和脂肪酸可為飽和的、不飽和的(順式或反式)或部分不飽和的(順式或反式)。在一些實施方案中，脂質(zhì)包含至少一種選自以下的脂肪酸：月桂酸(12:0)、肉豆蔻酸(14:0)、棕櫚酸(16:0)、棕櫚油酸(16:1)、十七酸(17:0)、十七碳烯酸(17:1)、硬脂酸(18:0)、油酸(18:1)、亞麻油酸(linoleicacid)(18:2)、次亞麻油酸(18:3)、十八碳四烯酸(18:4)、花生酸(20:0)、二十烯酸(20:1)、二十碳二烯酸(20:2)、二十碳四烯酸(20:4)、二十碳五烯酸(20:5)(epa)、二十二酸(22:0)、二十二烯酸(22:1)、二十二碳五烯酸(22:5)、二十二碳六烯酸(22:6)(dha)和二十四酸(24:0)。在一些實施方案中，組合物包含至少一種修飾的脂質(zhì)，例如已通過烹調(diào)來修飾的脂質(zhì)。在一些實施方案中，組合物包含至少一種補充性礦物質(zhì)或礦物質(zhì)來源。礦物質(zhì)的實例包括不限于：氯化物、鈉、鈣、鐵、鉻、銅、碘、鋅、鎂、錳、鉬、磷、鉀和硒。任何前述礦物質(zhì)的適合形式包括可溶性礦物鹽、微溶性礦物鹽、不溶性礦物鹽、螯合礦物質(zhì)、礦物質(zhì)復(fù)合物、非反應(yīng)性礦物質(zhì)(諸如羰基礦物質(zhì))和還原的礦物質(zhì)及其組合。在一些實施方案中，組合物包含至少一種補充性維生素。至少一種維生素可為脂溶性或水溶性維生素。適合維生素包括但不限于維生素c、維生素a、維生素e、維生素b12、維生素k、核黃素、煙酸、維生素d、維生素b6、葉酸、吡哆辛(pyridoxine)、硫胺、泛酸和生物素。任何前述維生素的適合形式是維生素的鹽、維生素的衍生物、具有維生素的相同或類似活性的化合物、和維生素的代謝物。在一些實施方案中，組合物包含至少一種生物體。適合實例在本領(lǐng)域中是熟知的，并且包括益生菌(例如乳酸桿菌屬(lactobacillus)或雙歧桿菌屬(bifidobacterium)的物種)、螺旋藻屬(spirulina)、小球藻屬(chlorella)和紫菜屬(porphyra)。在一些實施方案中，組合物包含至少一種膳食補充劑。適合實例在本領(lǐng)域中是熟知的，并且包括草本制劑、植物制劑和某些激素。非限制性實例包括銀杏、人參和褪黑素(melatonin)。在一些實施方案中，組合物包含賦形劑。適合賦形劑的非限制性實例包括促味劑、香料、緩沖劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、粘合劑、壓緊劑、潤滑劑、分散增強劑、崩解劑、調(diào)味劑、甜味劑、著色劑。在一些實施方案中，賦形劑是緩沖劑。適合緩沖劑的非限制性實例包括檸檬酸鈉、碳酸鎂、碳酸氫鎂、碳酸鈣和碳酸氫鈣。在一些實施方案中，賦形劑包括防腐劑。適合防腐劑的非限制性實例包括抗氧化劑，如α-生育酚和抗壞血酸；以及抗微生物劑，如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。在一些實施方案中，組合物包含粘合劑作為賦形劑。適合粘合劑的非限制性實例包括淀粉、預(yù)膠凝淀粉、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、聚丙烯酰胺、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯醇、c12-c18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、寡糖及其組合。在一些實施方案中，組合物包含潤滑劑作為賦形劑。適合潤滑劑的非限制性實例包括硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、硬脂酸鋅、氫化植物油、sterotex、聚氧乙烯單硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸鈉、月桂基硫酸鈉、月桂基硫酸鎂和輕質(zhì)礦物油。在一些實施方案中，組合物包含分散增強劑作為賦形劑。適合分散劑的非限制性實例包括淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜爾膠(guargum)、高嶺土、膨潤土、純化木纖維素、淀粉乙醇酸鈉、同形硅酸鹽和微晶纖維素作為高hlb乳化劑表面活性劑。在一些實施方案中，組合物包含崩解劑作為賦形劑。在一些實施方案中，崩解劑是非泡騰性崩解劑。適合非泡騰性崩解劑的非限制性實例包括淀粉(諸如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、其預(yù)凝膠化和改性淀粉)、甜味劑、粘土(諸如膨潤土)、微晶纖維素、海藻酸鹽、淀粉乙醇酸鈉、膠狀物(諸如瓊脂、瓜爾膠、刺槐豆膠、刺梧桐膠、果膠和黃蓍膠)。在一些實施方案中，崩解劑是泡騰性崩解劑。適合泡騰性崩解劑的非限制性實例包括碳酸氫鈉與檸檬酸組合、以及碳酸氫鈉與酒石酸組合。在一些實施方案中，賦形劑包括調(diào)味劑。并入外層中的調(diào)味劑可選自合成調(diào)味油和調(diào)味香料；天然油；來自植物、葉、花和果實的提取物；及其組合。在一些實施方案中，調(diào)味劑選自肉桂油；冬青油；胡椒薄荷油；三葉草油；干草油；茴香油；桉樹；香草；柑桔油，諸如檸檬油、橙油、葡萄和葡萄柚油；以及水果香精，包括蘋果、桃子、梨、草莓、樹莓、櫻桃、李子、菠蘿和杏。在一些實施方案中，賦形劑包括甜味劑。適合甜味劑的非限制性實例包括葡萄糖(玉米糖漿)、右旋糖、轉(zhuǎn)化糖、果糖及其混合物(當不用作載體時)；糖精和它的各種鹽，諸如鈉鹽；二肽甜味劑，諸如阿斯巴甜；二氫查耳酮(dihydrochalcone)化合物、甘草甜(glycyrrhizin)；甜菊(steviarebaudiana)(甜菊苷(stevioside))；蔗糖的氯代衍生物，諸如蔗糖素(sucralose)；以及糖醇，諸如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇等。也涵蓋氫化淀粉水解產(chǎn)物和合成甜味劑3,6-二氫-6-甲基-1,2,3-噁噻嗪-4-酮-2,2-二氧化物，特別是其鉀鹽(安賽蜜(acesulfame-k))以及鈉鹽和鈣鹽。在一些實施方案中，組合物包含著色劑。適合著色劑的非限制性實例包括食物、藥物和化妝品著色劑(fd和c)、藥物和化妝品著色劑(d和c)、以及外部藥物和化妝品著色劑(ext.d和c)。著色劑可用作染料或它們的相應(yīng)色淀。制劑中的賦形劑或賦形劑的組合的重量分數(shù)通常是組合物中的氨基酸的總重量的約50％或小于50％、約45％或小于45％、約40％或小于40％、約35％或小于35％、約30％或小于30％、約25％或小于25％、約20％或小于20％、約15％或小于15％、約10％或小于10％、約5％或小于5％、約2％或小于2％、或約1％或小于1％。本文公開的蛋白質(zhì)和組合物可被配制成多種形式，并且通過許多不同手段來施用。組合物可以根據(jù)需要含有常規(guī)可接受的載體、佐劑和媒介物的制劑形式口服、經(jīng)直腸或胃腸外施用。如本文所用的術(shù)語“胃腸外”包括皮下、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或胸骨內(nèi)注射和輸注技術(shù)。在一示例性實施方案中，口服施用蛋白質(zhì)或組合物。用于口服施用的固體劑型包括膠囊、片劑、囊片、丸劑、錠劑、糖錠、粉末和顆粒劑。膠囊通常包含包括蛋白質(zhì)或組合物的核心材料和囊封所述核心材料的殼壁。在一些實施方案中，核心材料包括固體、液體和乳液中的至少一個。在一些實施方案中，殼壁材料包括軟質(zhì)明膠、硬質(zhì)明膠和聚合物中的至少一個。適合聚合物包括但不限于：纖維素聚合物，諸如羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基甲基纖維素(hpmc)、甲基纖維素、乙基纖維素、乙酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、乙酸偏苯三甲酸纖維素、鄰苯二甲酸羥丙基甲基纖維素、丁二酸羥丙基甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉；丙烯酸聚合物和共聚物，諸如由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸銨、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯形成的那些(例如在商標名“eudragit”下銷售的那些共聚物)；乙烯基聚合物和共聚物，諸如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙酸鄰苯二甲酸乙烯酯、乙酸乙烯酯巴豆酸共聚物、和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；以及蟲膠(純化紫膠)。在一些實施方案中，至少一種聚合物充當味道掩蔽劑。片劑、丸劑等可被壓制、多重壓制、多重層化、和/或包覆。包覆可為單一的或多重的。在一個實施方案中，包覆材料包括從植物、真菌和微生物中的至少一個提取的糖、多糖和糖蛋白中的至少一個。非限制性實例包括玉米淀粉、小麥淀粉、馬鈴薯淀粉、木薯淀粉、纖維素、半纖維素、右旋糖苷、麥芽糖糊精、環(huán)糊精、菊糖、果膠、甘露聚糖、阿拉伯膠、刺槐豆膠、牧豆樹膠、瓜爾膠、刺梧桐膠、印度膠、黃蓍膠、海蘿、卡拉膠、瓊脂、海藻酸鹽、殼聚糖或結(jié)冷膠。在一些實施方案中，包覆材料包括蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，包覆材料包括脂肪和油中的至少一個。在一些實施方案中，脂肪和油中的至少一個具有高溫熔化性。在一些實施方案中，脂肪和油中的至少一個被氫化或部分氫化。在一些實施方案中，脂肪和油中的至少一個源于植物。在一些實施方案中，脂肪和油中的至少一個包括甘油酯、游離脂肪酸和脂肪酸酯中的至少一個。在一些實施方案中，包覆材料包括至少一種可食用蠟?？墒秤孟灴稍从趧游铩⒗ハx或植物。非限制性實例包括蜂蠟、羊毛脂、楊梅蠟、巴西棕櫚蠟和米糠蠟?？闪硗庵苽渚哂心c溶包衣的片劑和丸劑?；蛘撸蓪疚墓_的蛋白質(zhì)和組合物的粉末或顆粒并入食物產(chǎn)品中。在一些實施方案中，食物產(chǎn)品是用于口服施用的飲料。適合飲料的非限制性實例包括果汁、果汁飲料、人工調(diào)味飲料、人工增甜飲料、碳酸飲料、運動飲料、液體乳制品、攪合飲料、含酒精飲料、含咖啡因飲料、嬰兒配方飲料等。用于口服施用的其它適合手段包括水性和非水性溶液、乳膏劑、糊劑、乳液、混懸液和漿液，其各自可任選也含有適合溶劑、防腐劑、乳化劑、混懸劑、稀釋劑、甜味劑、著色劑、促味劑、香料和調(diào)味劑中的至少一個。在一些實施方案中，食物產(chǎn)品是固體食料。固體食料的適合實例包括不限于成塊食物、成塊點心、曲奇餅、核仁巧克力餅、松餅、脆餅、餅干、奶油或面團、成塊冰淇淋、成塊冷凍酸奶等。在一些實施方案中，將本文公開的蛋白質(zhì)和組合物并入治療性食物中。在一些實施方案中，治療性食物是任選含有一些或全部必需大量營養(yǎng)物和微量營養(yǎng)物的備用食物。在一些實施方案中，將本文公開的蛋白質(zhì)和組合物并入被設(shè)計以摻合至現(xiàn)存餐食中的補充性食物中。在一些實施方案中，補充性食物含有一些或全部必需大量營養(yǎng)物和微量營養(yǎng)物。在一些實施方案中，將本文公開的蛋白質(zhì)和組合物與現(xiàn)存食物摻合或添加至現(xiàn)存食物中以加強所述食物的蛋白質(zhì)營養(yǎng)。實例包括食物主要成分(谷物、鹽、糖、烹調(diào)油、人造黃油)、飲料(咖啡、茶、蘇打水、啤酒、蒸餾酒、運動飲料)、點心、甜食和其它食物。本文公開的組合物可在方法中用于增加例如肌肉質(zhì)量、強度和身體功能、產(chǎn)熱、代謝消耗、飽腹感、線粒體生物發(fā)生、重量或脂肪損失、以及瘦性身體組成中的至少一個。制劑可在所述制劑中含有多達約每100千卡25g(25g/100kcal)的營養(yǎng)性多肽，此意味著存在于所述制劑中的所有或基本上所有能量都呈所述營養(yǎng)性多肽的形式。更通常地，存在于制劑中的能量的約99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或小于5％呈營養(yǎng)性多肽形式。在其它制劑中，營養(yǎng)性多肽以足以提供等于或大于參照每日多肽攝取值的至少約0.1％的營養(yǎng)性益處的量存在。蛋白質(zhì)的適合參照每日攝取值在本領(lǐng)域中是熟知的。參見例如dietaryreferenceintakesforenergy,carbohydrate,fiber,fat,fattyacids,cholesterol,proteinandaminoacids,instituteofmedicineofthenationalacademies,2005,nationalacademiespress,washingtondc。蛋白質(zhì)的參照每日攝取值是這樣的范圍，其中10-35％的每日卡路里由蛋白質(zhì)和分離的氨基酸提供。以每天的蛋白質(zhì)克數(shù)的形式提供基于年齡的另一參照每日攝取值：年齡1-3歲的兒童：13g，年齡4-8歲的兒童：19g，年齡9-13歲的兒童：34g，年齡14-18歲的女孩：46，年齡14-18歲的男孩：52，年齡19-70+歲的婦女：46，以及年齡19-70+歲的男子：56。在其它制劑中，營養(yǎng)性多肽以足以向罹患蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良或特征在于蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良的疾病、病癥或病狀的人受試者提供營養(yǎng)性益處的量存在。蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良通常是一種出生前或兒童期病狀。能量攝取足夠的蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良稱為夸休可爾或低白蛋白血癥性營養(yǎng)不良，而呈包括蛋白質(zhì)攝取不足的所有形式的能量攝取不足稱為消瘦。營養(yǎng)充足的個體可由于消耗太少蛋白質(zhì)或消耗的蛋白質(zhì)缺乏營養(yǎng)性氨基酸而顯現(xiàn)肌肉減少癥。出生前蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良可通過向妊娠母親施用本文所述的營養(yǎng)性多肽來預(yù)防、治療或減輕，而新生兒蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良可通過向泌乳母親施用本文所述的營養(yǎng)性多肽來預(yù)防、治療或減輕。在成人中，蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良通常繼發(fā)于癌癥、慢性腎病，并且發(fā)生在年長者中。另外，蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良可為慢性的或急性的。急性蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良的實例發(fā)生在諸如敗血癥的急性病或疾病期間，或在從諸如手術(shù)的創(chuàng)傷性損傷、諸如灼燒的熱損傷、或?qū)е聦嵸|(zhì)性組織重塑的類似事件恢復(fù)期間?？赏ㄟ^本文所述的方法和組合物治療的其它急性疾病包括肌肉減少癥、惡病質(zhì)、糖尿病、胰島素抗性和肥胖癥。制劑可以當由人受試者消耗時足以提供飽腹感的量含有營養(yǎng)性多肽，此意味著所述受試者感覺饑餓感減輕或不存在饑餓或進食意愿?；谙嗟瓤防铮@種制劑通常比富含碳水化合物的食物具有更高飽腹感指數(shù)。制劑可以基于營養(yǎng)性多肽的濃度(例如基于重量對重量)的某一量含有營養(yǎng)性多肽，以使所述營養(yǎng)性多肽占所述制劑的重量的多達100％，此意味著存在于所述制劑中的所有或基本上所有物質(zhì)都呈所述營養(yǎng)性多肽的形式。更通常地，存在于制劑中的重量的約99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或小于5％呈營養(yǎng)性多肽形式。在一些實施方案中，制劑含有10mg、100mg、500mg、750mg、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9、10g、15g、20g、25g、30g、35g、40g、45g、50g、60g、70g、80g、90g、100g或超過100g營養(yǎng)性多肽。優(yōu)選地，本文提供的制劑大致上不含非可食產(chǎn)品。非可食產(chǎn)品常見于先前技術(shù)的由酵母、細菌、藻類、昆蟲、哺乳動物或其它表達系統(tǒng)產(chǎn)生的重組蛋白的制劑中。示例性非可食產(chǎn)品包括表面活性劑、聚乙烯醇、丙二醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、非可食多元酸或多元醇、脂肪醇、烷基苯甲基磺酸鹽、烷基糖苷或?qū)αu基苯甲酸甲酯。在各個方面，提供的制劑含有其它物質(zhì)，諸如促味劑、營養(yǎng)性碳水化合物和/或營養(yǎng)性脂質(zhì)。此外，制劑可包括增積劑、質(zhì)地成構(gòu)劑和填充劑。在優(yōu)選實施方案中，本文提供的營養(yǎng)性多肽是分離的和/或大致上純化的。本文提供的營養(yǎng)性多肽以及組合物和制劑大致上不含非蛋白質(zhì)組分。所述非蛋白質(zhì)組分通常存在于含有大量與多肽復(fù)合，并且導(dǎo)致蛋白質(zhì)在胃腸道中的消化延遲和不完全的碳水化合物和脂質(zhì)的的蛋白質(zhì)制劑，諸如乳清、酪蛋白、蛋和大豆制劑中。所述非蛋白質(zhì)組分也可包括dna。因此，營養(yǎng)性多肽、組合物和制劑的特征在于相較于食物源性多肽和多肽混合物，可消化性改進，并且過敏原性降低。此外，這些制劑和組合物的特征在于根據(jù)某一時間的可消化性和/或以給定單位時間為基礎(chǔ)的消化產(chǎn)物更可重現(xiàn)。在某些實施方案中，相對于參照多肽或參照多肽混合物，營養(yǎng)性多肽在脂質(zhì)和/或碳水化合物以及任選一種或多種降低可消化性和/或增加過敏原性的其它物質(zhì)方面降低至少10％，例如降低20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％。在某些實施方案中，營養(yǎng)性制劑含有可由于可消化性和/或降低的過敏原性而選擇的營養(yǎng)性碳水化合物和/或營養(yǎng)性脂質(zhì)。使用方法在一些實施方案中，向患者或使用者(有時總稱為“受試者”)施用本文公開的蛋白質(zhì)和組合物。如本文所用，“施用(administer/administration)”涵蓋其中一個人指導(dǎo)另一人以某一方式和/或出于某一目的消耗蛋白質(zhì)或組合物的實施方案，并且也涵蓋其中使用者不依賴于從第二人接收的任何指導(dǎo)或以所述任何指導(dǎo)的變化形式，以某一方式和/或出于某一目的使用蛋白質(zhì)或組合物的情況。其中一個人指導(dǎo)另一人以某一方式和/或出于某一目的消耗蛋白質(zhì)或組合物的實施方案的非限制性實例包括當醫(yī)師對患者指定執(zhí)行和/或治療過程時，當教練員建議使用者(諸如運動員)遵循特定執(zhí)行和/或治療過程時，以及當制造商、分銷商或商人向終端使用者推薦使用條件時，例如通過廣告或在包裝上或在與產(chǎn)品的出售或銷售相伴提供的其它材料上進行標記。在一些實施方案中，以某一劑型提供蛋白質(zhì)或組合物。在一些實施方案中，設(shè)計用于施用至少一種本文公開的蛋白質(zhì)的劑型，其中施用的蛋白質(zhì)的總量選自0.1g至1g、1g至5g、2g至10g、5g至15g、10g至20g、15g至25g、20g至40g、25-50g、以及30-60g。在一些實施方案中，設(shè)計用于施用至少一種本文公開的蛋白質(zhì)的劑型，其中施用的蛋白質(zhì)的總量選自約0.1g、0.1g-1g、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、15g、20g、25g、30g、35g、40g、45g、50g、55g、60g、65g、70g、75g、80g、85g、90g、95g和100g。在一些實施方案中，設(shè)計用于施用至少一種本文公開的蛋白質(zhì)的劑型，其中施用的必需氨基酸的總量選自0.1g至1g、1g至5g、2g至10g、5g至15g、10g至20g、以及1-30g。在一些實施方案中，設(shè)計用于施用至少一種本文公開的蛋白質(zhì)的劑型，其中施用的蛋白質(zhì)的總量選自約0.1g、0.1-1g、1g、2g、3g、4g、5g、6g、7g、8g、9g、10g、15g、20g、25g、30g、35g、40g、45g、50g、55g、60g、65g、70g、75g、80g、85g、90g、95g和100g。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)或組合物是在1天0.1g至1g、1天1g至5g、1天2g至10g、1天5g至15g、1天10g至20g、1天15g至30g、1天20g至40g、1天25g至50g、1天40g至80g、1天50g至100g、或大于1天100g的速率下被消耗。在一些實施方案中，在由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量中，由受試者在膳食時期內(nèi)達成的總蛋白質(zhì)攝取量的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或約100％由至少一種本公開的蛋白質(zhì)組成。在一些實施方案中，在由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量中，在膳食時期內(nèi)，由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的5％至100％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的5％至90％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的5％至80％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的5％至70％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的5％至60％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的5％至50％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的5％至40％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的5％至30％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的5％至20％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的5％至10％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的10％至100％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的10％至100％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的20％至100％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的30％至100％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的40％至100％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的50％至100％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的60％至100％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的70％至100％、由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的80％至100％、或由受試者達成的總蛋白質(zhì)攝取量的90％至100％由至少一種本公開的蛋白質(zhì)組成。在一些實施方案中，至少一種本公開的蛋白質(zhì)占受試者在膳食時期內(nèi)的卡路里攝取量的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。在一些實施方案中，至少一種本公開的蛋白質(zhì)包含至少2種本公開的蛋白質(zhì)、至少3種本公開的蛋白質(zhì)、至少4種本公開的蛋白質(zhì)、至少5種本公開的蛋白質(zhì)、至少6種本公開的蛋白質(zhì)、至少7種本公開的蛋白質(zhì)、至少8種本公開的蛋白質(zhì)、至少9種本公開的蛋白質(zhì)、至少10種本公開的蛋白質(zhì)、或大于10種本公開的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，膳食時期是1餐、2餐、3餐、至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1個月、至少2個月、至少3個月、至少4個月、至少5個月、至少6個月或至少1年。在一些實施方案中，膳食時期是1天至1周、1周至4周、1個月至3個月、3個月至6個月、或6個月至1年。臨床研究提供證據(jù)表明蛋白質(zhì)會防止歸因于衰老或廢用(諸如由于不活動或長期臥床休息)的肌肉損失。特定來說，研究已顯示蛋白質(zhì)補充會增加長期臥床休息期間的肌肉分數(shù)合成速率(fsr)，維持長期臥床休息期間的腿部質(zhì)量和強度，增加瘦性身體質(zhì)量，改進步態(tài)和平衡的功能性量度，并且可充當用于由于不活動或長期臥床休息而處于肌肉減少癥的風(fēng)險下的個體的可行性干預(yù)。參見例如paddon-jonesd等jclinendocrinolmetab2004,89:4351–4358；ferrando,a等clinicalnutrition20091-6；katsanosc等amjphysiolendocrinolmetab.2006,291:381-387。在運動員中進行的關(guān)于增加肌肉蛋白質(zhì)合成代謝的研究已顯示在運動之后提供的蛋白質(zhì)促進肌肉肥大的程度大于由單獨運動實現(xiàn)的肌肉肥大。也已顯示在運動之后提供的蛋白質(zhì)支持蛋白質(zhì)合成而不使蛋白質(zhì)分解有任何增加，從而導(dǎo)致凈正性蛋白質(zhì)平衡和肌肉質(zhì)量堆積。盡管肌肉蛋白質(zhì)合成似乎以劑量-應(yīng)答方式對必需氨基酸補充起應(yīng)答，但并非所有蛋白質(zhì)在構(gòu)建肌肉方面都等同。舉例來說，氨基酸亮氨酸是刺激肌肉蛋白質(zhì)合成的重要因素。參見例如borscheime等amjphysiolendocrinolmetab2002,283:e648-e657；borsheime等clinnutr.2008,27:189-95；esmarckb等jphysiol2001,535:301-311；moored等amjclinnutr2009,89:161-8)。在另一方面，本公開提供維持或增加受試者的肌肉質(zhì)量、肌肉強度和功能性能中的至少一個的方法。在一些實施方案中，方法包括向受試者提供足量的本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物。在一些實施方案中，受試者處于以下至少一種狀態(tài)下：年長、患有醫(yī)學(xué)上危急疾病、以及罹患蛋白質(zhì)-能量營養(yǎng)不良。在一些實施方案中，足量的本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者在與進行運動配合下消耗。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者通過口服、經(jīng)腸或胃腸外途徑消耗。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者通過口服途徑消耗。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者通過經(jīng)腸途徑消耗。在另一方面，本公開提供維持或?qū)崿F(xiàn)受試者的合乎需要的身體質(zhì)量指數(shù)的方法。在一些實施方案中，方法包括向受試者提供足量的本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物。在一些實施方案中，受試者處于以下至少一種狀態(tài)下：年長、患有醫(yī)學(xué)上危急疾病、以及罹患蛋白質(zhì)-能量營養(yǎng)不良。在一些實施方案中，足量的本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者在與進行運動配合下消耗。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者通過口服、經(jīng)腸或胃腸外途徑消耗。在另一方面，本公開提供向患有蛋白質(zhì)-能量營養(yǎng)不良的受試者提供蛋白質(zhì)的方法。在一些實施方案中，方法包括向受試者提供足量的本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者通過口服、經(jīng)腸或胃腸外途徑消耗。已建議需要在癌癥患者和罹患肌肉損耗和惡病質(zhì)的其它患者中補充必需氨基酸。在小鼠中進行的膳食研究已顯示通過用必需氨基酸進行膳食性干預(yù)，對惡病質(zhì)癌癥攜帶小鼠具有存活性和功能性益處。除癌癥之外，必需氨基酸補充也已在具有運動困難，并且因此遭受肌肉衰退的罹患其它疾病(諸如慢性阻塞性肺病、慢性心臟衰竭、hiv和其它疾病狀態(tài))的患者中顯示各種益處，諸如肌肉功能和肌肉增加得以改進。研究已顯示特定氨基酸有利于管理惡病質(zhì)。膳食中的bcaa和leu的含量相對較高被認為通過發(fā)出使翻譯增加的信號，增強胰島素釋放以及抑制蛋白質(zhì)降解來促進總蛋白質(zhì)合成而在惡病質(zhì)中具有積極作用。因此，消耗的膳食性bcaa(一般來說)和/或leu(特定來說)增加將積極促進降低或逆轉(zhuǎn)惡病質(zhì)的影響。因為氮平衡在對抗惡病質(zhì)的潛伏病因方面是重要的，所以認為消耗的膳食性谷氨酰胺和/或精氨酸增加將積極促進降低或逆轉(zhuǎn)惡病質(zhì)的影響。參見例如opdenkampc,langenr,haegensa,scholsa.“muscleatrophyincachexia:candietaryproteintipthebalance？”currentopinioninclinicalnutritionandmetaboliccare2009,12:611–616；poonrt-p,yuw-c,fans-t等“l(fā)ong-termoralbranchedchainaminoacidsinpatientsundergoingchemoembolizationforhepatocellularcarcinoma:arandomizedtrial.”alimentpharmacolther2004；19:779–788；tayekja,bistrianbr,hehirdj,martinr,moldawerll,blackburngl.“improvedproteinkineticsandalbuminsynthesisbybranchedchainaminoacid-enrichedtotalparenteralnutritionincancercachexia.”cancer.1986；58:147–57；xip,jiangz,zhengc,liny,wug“regulationofproteinmetabolismbyglutamine:implicationsfornutritionandhealth.”frontbiosci.2011年1月1日；16:578-97。因此，本文也提供治療受試者的惡病質(zhì)的方法。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物足以用于患有惡病質(zhì)的受試者的量是以下量：由人攝取的所述量的本公開的蛋白質(zhì)滿足或超過代謝需要(所述需要常被提高)。每天每千克體重1.5g或總卡路里攝取量的15-20％的蛋白質(zhì)攝取量似乎是適于患有惡病質(zhì)的人士的目標。在一些實施方案中，由受試者消耗的所有蛋白質(zhì)都是本公開的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)與其它來源的蛋白質(zhì)和/或游離氨基酸組合以提供受試者的總蛋白質(zhì)攝取量。在一些實施方案中，受試者處于以下至少一種狀態(tài)下：年長、患有醫(yī)學(xué)上危急疾病、以及罹患蛋白質(zhì)-能量營養(yǎng)不良。在一些實施方案中，受試者罹患使得運動困難，并且因此導(dǎo)致肌肉退化的疾病，諸如慢性阻塞性肺病、慢性心臟衰竭、hiv、癌癥和其它疾病狀態(tài)。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者在與進行運動配合下消耗。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者通過口服、經(jīng)腸或胃腸外途徑消耗。肌肉減少癥是骨骼肌質(zhì)量(通常在25歲之后每年損失0.5-1％)、品質(zhì)和強度的與衰老相關(guān)的退化性損失。肌肉減少癥是虛弱綜合征的組成部分。歐洲關(guān)于年長人的肌肉減少癥的工作組(ewgsop)已建立針對年齡相關(guān)的肌肉減少癥的實際臨床規(guī)定和統(tǒng)一診斷準則。對于肌肉減少癥的診斷，工作組已提出使用存在低肌肉質(zhì)量與低肌肉功能(強度或性能)兩者。肌肉減少癥的特征首先在于肌肉萎縮(肌肉尺寸降低)，以及由諸如肌肉纖維被脂肪置換、纖維化增加、肌肉代謝變化、氧化應(yīng)激和神經(jīng)肌肉接點退化的因素引起的肌肉組織“品質(zhì)”降低。這些變化組合在一起導(dǎo)致肌肉功能進行性損失，并且最終導(dǎo)致虛弱。虛弱是一種在年長成人中常見的體現(xiàn)災(zāi)難性健康和功能衰退的風(fēng)險升高的老年綜合征。虛弱的因素可包括肌肉減少癥、骨質(zhì)疏松和肌肉衰弱。肌肉衰弱，也稱為肌肉疲勞(或“缺乏強度”)，是指不能用骨骼肌施加力量。衰弱常在肌肉萎縮和活動減少之后，諸如在由于疾病的一段長期臥床休息之后。也存在由于肌肉減少癥的肌肉衰弱逐漸發(fā)作。本公開的蛋白質(zhì)適用于一旦肌肉減少癥或虛弱在受試者中顯現(xiàn)時即對它進行治療或適用于預(yù)防作為風(fēng)險組的成員的受試者的肌肉減少癥或虛弱的發(fā)作。在一些實施方案中，由受試者消耗的所有蛋白質(zhì)都是本公開的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)與其它來源的蛋白質(zhì)和/或游離氨基酸組合以提供受試者的總蛋白質(zhì)攝取量。在一些實施方案中，受試者處于以下至少一種狀態(tài)下：年長、患有醫(yī)學(xué)上危急疾病、以及罹患蛋白質(zhì)-能量營養(yǎng)不良。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者在與進行運動配合下消耗。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者通過口服、經(jīng)腸或胃腸外途徑消耗。肥胖癥是一種與許多共病癥相關(guān)的多因性病癥，所述共病癥包括高血壓、2型糖尿病、血脂異常、冠心病、中風(fēng)、癌癥(例如子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌和結(jié)腸癌)、骨關(guān)節(jié)炎、睡眠呼吸暫停和呼吸道問題。在美國，定義為身體質(zhì)量指數(shù)>30kg/m2的肥胖癥的發(fā)病率已從15％(1976–1980)顯著增加至33％(2003–2004)，并且它會繼續(xù)增長。盡管促成肥胖癥的機理是復(fù)雜的，并且涉及行為組成部分與激素、遺傳和代謝過程的相互作用，但肥胖癥主要被視為一種取決于生活方式的病狀，具有2種主要病因：過度能量攝取和身體活動不足。關(guān)于能量攝取，有證據(jù)表明適度增加膳食中的蛋白質(zhì)的比例，同時控制總能量攝取可改進身體組成，促進脂肪損失，并且改進在重量減輕之后的體重維持。與膳食性蛋白質(zhì)增加相關(guān)的積極結(jié)果被認為主要歸因于與飽腹感增加相關(guān)的能量攝取降低、能量效率降低和/或產(chǎn)熱增加、對身體組成(具體來說瘦性肌肉質(zhì)量)的積極作用、以及血糖控制增強。膳食性蛋白質(zhì)在增加膳后能量消耗方面比等熱量攝取的碳水化合物或脂肪更有效(參見例如daunceym,binghams.“dependenceof24henergyexpenditureinmanoncompositionofthenutrientintake.”brjnutr1983,50:1-13；karsth等“diet-inducedthermogenesisinman:thermiceffectsofsingleproteins,carbohydratesandfatsdependingontheirenergyamount.”annnutrmetab.1984,28:245-52；tappyl等“thermiceffectofinfusedaminoacidsinhealthyhumansandinsubjectswithinsulinresistance.”amjclinnutr1993,57(6):912-6)。這個性質(zhì)以及其它性質(zhì)(飽腹感誘導(dǎo)；維持瘦性身體質(zhì)量)使得蛋白質(zhì)成為在重量管理時所針對的有吸引力的膳食組分。由所述膳食引起的能量消耗增加可部分歸因于消化和代謝蛋白質(zhì)的能量消耗高于其它卡路里來源的事實。包括蛋白質(zhì)合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換是一種能量消耗過程。此外，高蛋白質(zhì)膳食也可上調(diào)肝和棕色脂肪中的解偶聯(lián)蛋白質(zhì)，此與能量消耗增加正性相關(guān)。已推理不同蛋白質(zhì)可對能量消耗具有獨特影響。研究表明攝取蛋白質(zhì)(特別是eaa和/或bcaa含量較高的蛋白質(zhì))會對產(chǎn)熱和能量消耗產(chǎn)生不同影響(參見例如mikkelsenp.等“effectoffat-reduceddietson24henergyexpenditure:comparisonsbetweenanimalprotein,vegetableproteinandcarbohydrate.”amjclinnutr2000,72:1135-41；achesonk.等“proteinchoicestargetingthermogenesisandmetabolism.”amjclinnutr2011,93:525-34；alfenasr.等“effectsofproteinqualityonappetiteandenergymetabolisminnormalweightsubjects”argbrasendocrinolmetabol2010,54(1):45-51；lorenzenj.等“theeffectofmilkproteinsonappetiteregulationanddiet-inducedthermogenesis.”jclinnutr201266(5):622-7)。另外，l-酪氨酸已被鑒定為在產(chǎn)熱中起作用的氨基酸(參見例如belzaa.等“thebeta-adrenergicantagonistpropranololpartlyabolishesthermogenicresponsetobioactivefoodingredients.”metabolism2009,58(8):1137-44)。進一步研究表明亮氨酸和精氨酸補充似乎通過將底物引向瘦性身體質(zhì)量而非脂肪組織來改變能量代謝(dullooa.“thesearchforcompoundsthatstimulatethermogenesisinobesitymanagement:frompharmaceuticalstofunctionalfoodingredients.”obesrev201112:866-83)?？傊墨I表明不同蛋白質(zhì)類型對產(chǎn)熱產(chǎn)生不同影響。因為富含eaa、bcaa和/或tyr、arg和leu中的至少一個的蛋白質(zhì)或肽據(jù)信對產(chǎn)熱具有刺激作用，并且因為刺激產(chǎn)熱據(jù)信會對重量管理產(chǎn)生積極作用，所以本公開也提供適用于刺激產(chǎn)熱和/或一般來說對重量管理產(chǎn)生積極作用的產(chǎn)品和方法。更特定來說，本公開提供增加受試者的產(chǎn)熱的方法。在一些實施方案中，方法包括向受試者提供足量的本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物。在一些實施方案中，受試者是肥胖的。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者在與進行運動配合下消耗。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者通過口服、經(jīng)腸或胃腸外途徑消耗。在基本層面上，顯現(xiàn)超重病狀的原因是歸因于能量攝取與能量消耗之間的不平衡。試圖減少在任何特定時機(飽足)以及在進食時機之間(飽腹感)的食物已成為新近研究的主要焦點。由于在進餐期間感覺飽足以及在進餐之后感覺飽滿而降低的熱量攝取由內(nèi)部信號和外部信號的復(fù)雜相互作用所致。各種營養(yǎng)研究已證明改變食物性質(zhì)(諸如能量密度、內(nèi)含物、質(zhì)地和味道)會影響飽足與飽腹感兩者。存在遞送能量的三種大量營養(yǎng)物：脂肪、碳水化合物和蛋白質(zhì)。1克蛋白質(zhì)或碳水化合物提供4卡，而1克脂肪提供9卡。蛋白質(zhì)使飽腹感增加的程度通常大于碳水化合物或脂肪，并且因此可促進卡路里攝取降低。然而，有可觀證據(jù)指示蛋白質(zhì)的類型在誘導(dǎo)飽腹感方面具有重要性(參見例如w.l.hall等“caseinandwheyexertdifferenteffectsonplasmaaminoacidprofiles,gastrointestinalhormonesecretionandappetite.”brjnutr.2003年2月,89(2):239-48；r.abou-samra等“effectofdifferentproteinsourcesonsatiationandshort-termsatietywhenconsumedasastarter.”nutrj.2011年12月23日,10:139；t.akhavan等“effectofpremealconsumptionofwheyproteinanditshydrolysateonfoodintakeandpostmealglycemiaandinsulinresponsesinyoungadults.”amjclinnutr.2010年4月,91(4):966-75,電子出版2010年2月17日；maveldhorst“dose-dependentsatiatingeffectofwheyrelativetocaseinorsoy”physiolbehav.2009年3月23日,96(4-5):675-82)。證據(jù)指示富含亮氨酸的蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)飽腹感方面特別有效(參見例如fromenting等“peripheralandcentralmechanismsinvolvedinthecontroloffoodintakebydietaryaminoacidsandproteins.”nutrresrev201225:29-39)。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)與至少一種藥物或生物藥物產(chǎn)品同時由受試者消耗。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)和至少一種藥物或生物藥物產(chǎn)品的有益作用具有累加效應(yīng)，而在一些實施方案中，蛋白質(zhì)和至少一種藥物或生物藥物產(chǎn)品的有益作用具有協(xié)同效應(yīng)。可與本公開的蛋白質(zhì)一起施用的藥物或生物藥物產(chǎn)品的實例在本領(lǐng)域中是熟知的。舉例來說，當本公開的蛋白質(zhì)用于維持或增加受試者的肌肉質(zhì)量、肌肉強度和功能性能中的至少一個時，所述蛋白質(zhì)可與某一治療劑量方案的至少一種指示用以維持或增加受試者的肌肉質(zhì)量、肌肉強度和功能性能中的至少一個的藥物或生物藥物產(chǎn)品(諸如合成代謝類固醇)同時由受試者消耗。當本公開的蛋白質(zhì)用于維持或?qū)崿F(xiàn)受試者的合乎需要的身體質(zhì)量指數(shù)時，所述蛋白質(zhì)可與某一治療劑量方案的至少一種指示用以維持或?qū)崿F(xiàn)受試者的合乎需要的身體質(zhì)量指數(shù)的藥物或生物藥物產(chǎn)品(諸如奧利斯泰(orlistat)、氯卡色林(lorcaserin)、西布曲明(sibutramine)、利莫那班(rimonabant)、二甲雙胍(metformin)、艾塞那肽(exenatide)或普蘭林肽(pramlintide))同時由受試者消耗。當本公開的蛋白質(zhì)用于誘導(dǎo)受試者的飽足反應(yīng)和飽腹感反應(yīng)中的至少一個時，所述蛋白質(zhì)可與某一治療劑量方案的至少一種指示用以誘導(dǎo)受試者的飽足反應(yīng)和飽腹感反應(yīng)中的至少一個的藥物或生物藥物產(chǎn)品(諸如利莫那班、艾塞那肽或普蘭林肽)同時由受試者消耗。當本公開的蛋白質(zhì)用于治療受試者的惡病質(zhì)、肌肉減少癥和虛弱中的至少一個時，所述蛋白質(zhì)可與某一治療劑量方案的至少一種指示用以治療惡病質(zhì)、肌肉減少癥和虛弱中的至少一個的藥物或生物藥物產(chǎn)品(諸如ω-3脂肪酸或合成代謝類固醇)同時由受試者消耗。由于膳食性蛋白質(zhì)在誘導(dǎo)飽足和飽腹感方面的作用，本文公開的蛋白質(zhì)和組合物可用于誘導(dǎo)受試者的飽足反應(yīng)和飽腹感反應(yīng)中的至少一個。在一些實施方案中，方法包括向受試者提供足量的本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物。在一些實施方案中，受試者是肥胖的。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者在與進行運動配合下消耗。在一些實施方案中，本公開的蛋白質(zhì)、本公開的組合物或通過本公開的方法制備的組合物由受試者通過口服、經(jīng)腸或胃腸外途徑消耗。在一些實施方案中，將至少一種本公開的蛋白質(zhì)或組合物并入受試者的膳食中具有至少一種選自以下的作用：誘導(dǎo)餐后飽腹感(包括通過遏制饑餓)、誘導(dǎo)產(chǎn)熱、降低血糖應(yīng)答、積極影響能量消耗、積極影響瘦性身體質(zhì)量、降低由過度進食引起的重量增加、以及降低能量攝取。在一些實施方案中，將至少一種本公開的蛋白質(zhì)或組合物并入受試者的膳食中在所述受試者中具有至少一種選自以下的作用：增加身體脂肪損失、降低瘦性組織損失、改進脂質(zhì)分布、以及改進葡萄糖耐受性和胰島素敏感性。本文所述的技術(shù)和方案的實例可見于remington'spharmaceuticalsciences,第16版,osol,a.(編),1980中。實施例以下是用于進行本發(fā)明的特定實施方案的實施例。實施例僅出于說明性目的而提供，并且不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍。已努力確保關(guān)于所用數(shù)值(例如量、溫度等)的準確性，但當然應(yīng)允許一些實驗誤差和偏差。除非另外指示，否則本發(fā)明的實施將采用屬于本領(lǐng)域的技能的蛋白質(zhì)化學(xué)、生物化學(xué)、重組dna技術(shù)和藥理學(xué)的常規(guī)方法。所述技術(shù)充分說明于文獻中。參見例如t.e.creighton,proteins:structuresandmolecularproperties(w.h.freemanandcompany,1993)；a.l.lehninger,biochemistry(worthpublishers,inc.,當前版本)；sambrook等,molecularcloning:alaboratorymanual(第2版,1989)；methodsinenzymology(s.colowick和n.kaplan編,academicpress,inc.)；remington'spharmaceuticalsciences,第18版(easton,pennsylvania:mackpublishingcompany,1990)；carey和sundbergadvancedorganicchemistry第3版(plenumpress)第a和b卷(1992)。實施例1.使用質(zhì)譜測定分析來鑒定和選擇可食用物種的營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列。提供一種用于諸如從多肽或核酸文庫或從蛋白質(zhì)序列的相關(guān)數(shù)據(jù)庫鑒定一種或多種營養(yǎng)性多肽氨基酸序列的方法。在此處，通過對從可食用物種提取和純化的蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜分析來鑒定營養(yǎng)性多肽氨基酸序列。供質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)分離。從固體可食用來源提取蛋白質(zhì)。在分析中包括來自以下物種的樣品：美味獼猴桃(actinidiadeliciosa)、雙孢蘑菇雙孢變種(agaricusbisporusvar.bisporus)、鈍頂節(jié)旋藻(arthrospiraplatensis)、歐洲牛(bostaurus)、甘藍(brassicaoleracea)、大麻(cannabis)、昆諾藜(chenopodiumquinoa)、規(guī)則小球藻(chlorellaregularis)、多變小球藻(chlorellavariabilis)、鷹嘴豆(cicerarietinum)、筍瓜(cucurbitamaxima)、禾谷鐮刀菌(fusariumgraminearum)、鱈(大西洋鱈魚)、原雞(gallusgallus)、大豆(glycinemax)、嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus)、昆布目(laminariales)、亞麻(linumusitatissimum)、火雞(meleagrisgallopavo)、維吉尼亞鹿(odocoileusvirginianus)、尼羅羅非魚(oreochromisniloticus)、水稻(oryzasativa)、綿羊(ovisaries)、掌葉樹(palmariapalmata)、油梨(perseaamericana)、烏梅(prunusmume)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、鹽湖鮭魚(salmosalar)、番茄(solanumlycopesicum)、馬鈴薯(solanumtuberosum)、野豬(susscrofa)、金槍魚(thunnusthynnus)、高叢越橘(vacciniumcorymbosum)、葡萄(vitisvinifera)和玉米(zeamays)。首先將各樣品冷凍在-80c下，接著使用研缽和研杵研磨，隨后將50mg物質(zhì)稱入微量離心管中。接著將50mg樣品再混懸于1ml提取緩沖液(8.3m尿素、2m硫脲、2％w/vchaps、1％w/vdtt)中，并且攪拌30分鐘。添加500μl100μm鋯珠粒(opsdiagnostics)，繼之以再繼續(xù)攪拌30分鐘。在tissuelyserii(qiagen)上在30hz下操作樣品3分鐘，接著在臺式微量離心機(eppendorf)中在21,130g下離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移至清潔微量離心管中，等分成50μl等分試樣，并且儲存在-80℃下。通過coomassie加強型(bradford)蛋白質(zhì)測定(thermoscientific)來測量提取的可溶性蛋白質(zhì)的量。在10％10泳道bistrissds-page凝膠(invitrogen)上操作20ug蛋白質(zhì)，接著切除以通過lc/ms/ms進行分析。也從以下可食用生物體的液體培養(yǎng)物分離蛋白質(zhì)：黑曲霉、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)和解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)。如本文所述培養(yǎng)曲霉屬和芽孢桿菌屬生物體。通過離心(10,000xg)培養(yǎng)物10分鐘，隨后使用0.2μm過濾器過濾上清液來分離澄清上清液。通過coomassie加強型(bradford)蛋白質(zhì)測定(thermoscientific)來測量澄清上清液中可溶性蛋白質(zhì)的量。根據(jù)制造商方案在10％預(yù)澆制bistrissds-page凝膠(invitrogen)上操作蛋白質(zhì)樣品(20μg)。質(zhì)譜分析。對于lc/ms/ms分析，將各凝膠切成五個同等大小的碎片。使用機器人(progest,digilab)用以下方案進行胰蛋白酶消化：依次用25mm碳酸氫銨和乙腈洗滌，在60℃下用10mm二硫蘇糖醇還原，隨后在室溫下用50mm碘乙酰胺進行烷基化，在37℃下用胰蛋白酶(promega)消化4小時，用甲酸淬滅，并且上清液不經(jīng)進一步處理即直接分析。匯合各樣品的凝膠消化物，并且用聯(lián)接于thermofisherqexactive的watersnanoacquityhplc系統(tǒng)，通過納米lc/ms/ms來分析。將肽裝載于捕集柱上，并且歷經(jīng)75μm分析柱在350nl/min下洗脫；兩個柱均填充有jupiterproteo樹脂(phenomenex)。以數(shù)據(jù)依賴性模式操作質(zhì)譜儀，其中ms和ms/ms分別在70,000fwhm和17,500fwhm分辨率下在orbitrap中進行。15種最豐富的離子被選擇用于ms/ms。使用mascot用以下參數(shù)相對于uniprot和/或ncbi蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫根據(jù)相應(yīng)生物體搜索所得數(shù)據(jù)：酶-胰蛋白酶/p，固定修飾-脲基甲基(c)，可變修飾-氧化(m)、乙?；?蛋白質(zhì)n末端)、pyro-glu(n末端q)、脫酰胺(nq)，質(zhì)量值–單同位素，肽質(zhì)量容差-10ppm，片段質(zhì)量容差-0.015da，最大遺漏裂解數(shù)–2。將mascotdat文件解析至scaffold軟件中以進行驗證，過濾，并且創(chuàng)建每個樣品的非冗余清單。使用90％的最小蛋白質(zhì)值、50％的最小肽值(prophet評分)以及每種蛋白質(zhì)要求至少兩種獨特肽來過濾數(shù)據(jù)。通過光譜計數(shù)來確定所檢測蛋白質(zhì)的相對豐度，所述計數(shù)是對于各蛋白質(zhì)獲得的光譜數(shù)。光譜計數(shù)是一種通常由蛋白質(zhì)質(zhì)譜領(lǐng)域使用的無標記定量方法(liu,hongbin等analyticalchemistry76.14(2004):4193-4201)。為計算蛋白質(zhì)分離物中各蛋白質(zhì)的相對豐度，用蛋白質(zhì)光譜計數(shù)的數(shù)目除以總蛋白質(zhì)光譜計數(shù)。使用這個方法鑒定了seqid894-3415。同源物發(fā)現(xiàn)。對于鑒定的營養(yǎng)性多肽序列，如所述，從其它物種鑒定類似序列，通過這個方法鑒定的seqid-00093用于使用如本文所述的計算機程序blast搜索同源物。以這個方式鑒定的來自可食用數(shù)據(jù)庫的示例性營養(yǎng)性多肽同源物顯示于表e1a中。以這個方式鑒定的來自表達序列數(shù)據(jù)庫的示例性營養(yǎng)性多肽同源物顯示于表e1b中。表e1a.鑒定為seqid-00093的同源物的可食用序列。表e1b.鑒定為seqid-00093的同源物的表達序列實施例2.使用cdna文庫來鑒定和選擇可食用物種的營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列。在此處，通過對由從可食用物種提取和純化的核酸序列產(chǎn)生的蛋白質(zhì)進行分析來鑒定營養(yǎng)性多肽氨基酸序列。構(gòu)建cdna文庫。構(gòu)建來自12個可食用物種的cdna的文庫。12個可食用物種被分成5個種類以進行rna提取。以各可食用物種50mg使動物組織(包括絞細牛肉、豬肉、羊羔肉、雞肉、火雞肉和一部分羅非魚)組合。研磨來自葡萄和番茄的包括皮和果實的水果組織，并且以各物種2.5g進行組合。以各物種1g使稻和大豆的種子組合，并且研磨成粉末。使12ml釀酒酵母生長過夜，并且短暫離心以獲得110mg酵母細胞濕重。研磨1g蘑菇菌絲體，并且使用真菌rna提取方案處理。所有5個種類的樣品都以液氮快速冷凍，解凍，并且使用種類特異性rna提取方案進行溶解。提取來自不同食物種類的rna，并且組合成一個匯合樣品。使用寡dt作為引物，將rna的合并匯合物逆轉(zhuǎn)錄成cdna，從而產(chǎn)生長度在500bp至4kb之間的cdna。使銜接頭連接于cdna的各末端，并且用作用于擴增cdna文庫的pcr引物，并且也包括用于將文庫克隆至表達載體中的sfii限制消化位點。使cdna文庫變性并再退火，并且使用凝膠電泳選擇單鏈dna。這個過程從高度豐富rna物質(zhì)移除額外cdna以獲得標準化cdna文庫。使用乙醇沉淀法使標準化cdna文庫沉淀，隨后進行pcr擴增并克隆至表達載體中。表e2a.側(cè)接cdna的引物和適體序列。將cdna文庫克隆至大腸桿菌中以進行蛋白質(zhì)表達。將cdna文庫克隆至pet15b骨架載體中，所述載體用具有含有相應(yīng)sfii限制位點的突出部分(正向引物突出部分：tacgtgtatggccgcctcggcc；反向引物突出部分：tacgtgtatggccgtaatggcc)的引物擴增。pet15b含有pbr322復(fù)制起點、lac控制的t7啟動子、和賦予對羧芐青霉素(carbenicillin)的抗性的bla基因。cdna文庫與pcr擴增骨架兩者均用sfii切割，進行pcr純化，并且連接。將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化至10-β高效率感受態(tài)細胞(newenglandbiolabs)中，并且將轉(zhuǎn)化的細胞涂鋪于4個含有100mg/l羧芐青霉素的lb瓊脂板上。將各板在37℃下孵育過夜。在菌落已生長之后，添加2ml液體lb培養(yǎng)基至各板中。將細胞刮入液體中并混合在一起，并且制備混懸液以提取質(zhì)粒來形成多路cdna質(zhì)粒文庫。大腸桿菌cdna多路表達方法。4種菌株用于表達cdna文庫：來自newenglandbiolabs的t7express；以及來自emdmillipore的rosetta2(de3)、rosetta-gamib(de3)和rosetta-gami2(de3)。t7express是一種增強的bl21衍生物，其在lac操縱元中含有t7rna聚合酶，同時缺乏lon和ompt蛋白酶。t7express的基因型是：fhua2lacz::t7gene1[lon]omptgalsula11r(mcr-73::minitn10--tets)2[dcm]r(zgb-210::tn10--tets)enda1δ(mcrc-mrr)114::is10。rosetta2(de3)是一種供給用于7種稀有密碼子(aga、agg、aua、cua、gga、ccc、cgg)的trna的bl21衍生物。菌株是λde3的溶源菌，并且攜帶處于lacuv5啟動子之下的t7rna聚合酶基因。rosetta2(de3)的基因型是：f-ompthsdsb(rb-mb-)galdcm(de3)prare2(camr)。rosetta-gamib(de3)與rosetta2(de3)具有相同性質(zhì)，但包括增強在細胞質(zhì)中形成蛋白質(zhì)二硫鍵的特征。rosetta-gamib(de3)的基因型是f–ompthsdsb(rb–mb–)galdcmlacy1ahpc(de3)gor522::tn10trxbprare(camr,kanr,tetr)。類似于rosetta-gamib(de3)，rosetta-gami2(de3)緩和密碼子偏倚，增強二硫鍵形成，并且在染色體中具有處于lacuv5啟動子之下的t7rna聚合酶基因。rosetta-gami2(de3)的基因型是δ(ara-leu)7697δlacx74δphoapvuiiphorarad139ahpcgalegalkrpsl(de3)f′[lac+laciqpro]gor522::tn10trxbprare2(camr,strr,tetr)。將約200ng制備的cdna文庫轉(zhuǎn)化至4種背景菌株中：t7express、rosetta2(de3)、rosetta-gamib(de3)和rosetta-gami2(de3)感受態(tài)細胞。在轉(zhuǎn)化之后，將100μl各菌株涂鋪于4個含有100mg/l羧芐青霉素的lb(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨和5g/l酵母提取物)1.5％瓊脂板上，并且在37℃下孵育16小時。在孵育之后，添加2ml具有100mg/l羧芐青霉素的lb培養(yǎng)基至含有數(shù)千個轉(zhuǎn)化體的各板的表面，并且通過用細胞涂布器刮擦以及混合來將細胞混懸于表面培養(yǎng)基中。使來自各背景的4個平行測定板的混懸細胞組合以形成用于表達實驗的預(yù)接種物培養(yǎng)物。使用板讀取器，由再混懸細胞制得的預(yù)接種物培養(yǎng)物的od600被測量為在35與40之間(t7、rosetta2(de3))或在15與20之間(rosetta-gamib(de3)和2(de3))。對于4種背景菌株，對125ml含有10ml具有100mg/l羧芐青霉素的lb培養(yǎng)基的擋板振蕩燒瓶進行接種以獲得od6000.2來形成接種物培養(yǎng)物，并且在37℃下在250rpm下振蕩孵育約6小時。測量od600，并且接種物培養(yǎng)物用于在2l含有250ml具有100mg/l羧芐青霉素、600mu/l葡糖淀粉酶和0.01％消泡劑204的biosiltaenbase培養(yǎng)基的擋板振蕩燒瓶中接種表達培養(yǎng)物以獲得od6000.1。在30℃和250rpm下振蕩培養(yǎng)物18小時，并且用1mmiptg誘導(dǎo)，并補充以額外enbase培養(yǎng)基組分和另外600mu/l葡糖淀粉酶。在30℃和250rpm下進行異源性表達24小時，此時終止培養(yǎng)。測量終末細胞密度，并且通過離心(5000xg，10分鐘，室溫)來收集細胞。將細胞儲存在-80℃下，隨后根據(jù)制造商方案用b-per(pierce)溶解。在細胞溶解之后，對全細胞溶解產(chǎn)物取樣以進行分析。在rosetta(de3)菌株中，離心(3000xg，10分鐘，室溫)全細胞溶解產(chǎn)物，并且收集上清液作為溶解產(chǎn)物的可溶性部分。在sds-page凝膠上操作細胞溶解產(chǎn)物，分離成10個部分，接著使用ms-ms進行分析。將cdna文庫克隆至芽孢桿菌屬中以進行蛋白質(zhì)分泌。將cdna文庫克隆至pht43載體中以在枯草芽孢桿菌中進行蛋白質(zhì)分泌測定。來自mobitec的未修飾的pht43載體含有pgrac啟動子、samyq信號肽、amp和cm抗性基因、laci區(qū)域、repa區(qū)域和cole1復(fù)制起點。移除samyq信號肽。用具有含有相應(yīng)sfii限制位點的突出部分(正向引物突出部分：tacgtgtatggccgcctcggcc；反向引物突出部分：tacgtgtatggccgtaatggcc)的引物擴增不具有信號肽的pht43骨架載體以及grac啟動子被apre啟動子取代并且laci區(qū)域被移除的修飾形式。cdna文庫與兩種pcr擴增骨架兩者均用sfii切割并進行pcr純化。使cdna文庫插入物連接至各背景中。將連接反應(yīng)物轉(zhuǎn)化至10-β高效率感受態(tài)細胞(newenglandbiolabs)中，并且將各連接的細胞涂鋪于4個含有100mg/l羧芐青霉素的lb瓊脂板上。將各板在37℃下孵育過夜。在菌落已生長之后，添加2ml液體lb培養(yǎng)基至各板中。對于各連接，將細胞刮入液體中并混合在一起，并且制備混懸液以提取質(zhì)粒來形成多路cdna質(zhì)粒文庫(此后被稱為多路grac-cdna和apre-cdna文庫)。用于這個表達實驗中的表達菌株基于wb800n菌株(mobitec)。wb800n菌株具有以下基因型：npreapreeprbprmpr::blenprb::bsrvprwpra::hygcm::neo；neor。菌株cdna-1含有與papre啟動子協(xié)同的突變，并且除wb800n基因型之外也具有這些改變：pxyla-comk::erm,degu32(hy),sigf::str。菌株cdna-2相對于wb800n具有這些改變：pxyla-comk::erm。將約1μg多路grac-cdna文庫轉(zhuǎn)化至菌株cdna-1與菌株cdna-2兩者中，并且將1μg多路apre-cdna文庫轉(zhuǎn)化至菌株cdna-1中。在轉(zhuǎn)化之后，將100μl各菌株涂鋪于4個含有5mg/l氯霉素的lb(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨和5g/l酵母提取物)1.5％瓊脂板上，并且在37℃下孵育16小時。在孵育之后，添加2ml具有5mg/l氯霉素的lb培養(yǎng)基至含有數(shù)千個轉(zhuǎn)化體的各板的表面，并且通過用細胞涂布器刮擦以及混合來將細胞混懸于表面培養(yǎng)基中。使來自各轉(zhuǎn)化的4個平行測定板的混懸細胞組合以形成用于表達實驗的預(yù)接種物培養(yǎng)物。使用板讀取器，由再混懸細胞制得的預(yù)接種物培養(yǎng)物的od600被測量為約20-25。對于3種菌株(菌株cdna-1+多路grac-cdna、菌株cdna-1+多路apre-cdna、菌株cdna-2+grac-cdna)，對500ml含有50ml具有5mg/l氯霉素的2xmal培養(yǎng)基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨、10g/l酵母提取物、75g/ld-麥芽糖)的擋板振蕩燒瓶接種以獲得od600≈0.2來形成接種物培養(yǎng)物，并且在30℃下在250rpm下振蕩孵育約6小時。測量od600，并且接種物培養(yǎng)物用于在2l含有具有5mg/l氯霉素、1xteknova微量金屬和0.01％消泡劑204的2xmal培養(yǎng)基的擋板振蕩燒瓶中接種表達培養(yǎng)物以獲得od6000.1。在30℃和250rpm下振蕩菌株cdna-1+多路aprecdna培養(yǎng)物18小時，此時收集培養(yǎng)物。測量終末細胞密度，并且通過離心(5000xg，30分鐘，室溫)來收集細胞。在37℃和250rpm下振蕩菌株cdna-1+多路grac-cdna和菌株cdna-2+多路grac-cdna培養(yǎng)物4小時，并且用1mmiptg誘導(dǎo)。在37℃和250rpm下進行異源性表達4小時，此時收集培養(yǎng)物。再次，測量終末細胞密度，并且通過離心(5000xg，30分鐘，室溫)來收集細胞。收集上清液并在sds-page凝膠上操作，分離成10個部分，接著使用lc-ms/ms進行分析以鑒定分泌蛋白質(zhì)。質(zhì)譜測定法分析。使用lc-ms/ms分析全細胞溶解產(chǎn)物和可溶性溶解產(chǎn)物樣品的蛋白質(zhì)表達。為分析樣品，將10μg樣品裝載于10％sds-page凝膠(invitrogen)上，并且分離約5cm。將凝膠切成10個區(qū)段，并且通過依次用25mm碳酸氫銨和乙腈洗滌來處理凝膠切片。凝膠切片接著在60℃下用10mm二硫蘇糖醇還原，隨后在室溫下用50mm碘乙酰胺進行烷基化。最后，樣品用胰蛋白酶(promega)在37℃下消化4小時，并且以添加甲酸來使消化淬滅。上清液樣品接著用聯(lián)接于thermofisherqexactive的watersnanoacquityhplc系統(tǒng)，通過納米lc/ms/ms來分析。將肽裝載于捕集柱上，并且歷經(jīng)75μm分析柱在350nl/min下洗脫；兩個柱均填充有jupiterproteo樹脂(phenomenex)。采用1小時梯度。以數(shù)據(jù)依賴性模式操作質(zhì)譜儀，其中ms和ms/ms分別在70,000fwhm分辨率和17,500fwhm分辨率下在orbitrap中進行。15種最豐富的離子被選擇用于ms/ms。使用mascot相對于數(shù)據(jù)庫搜索數(shù)據(jù)以鑒定肽。通過組合來自包括歐洲牛、原雞、葡萄、綿羊、野豬、水稻、大豆、尼羅羅非魚、番茄、雙孢蘑菇雙孢變種、釀酒酵母和火雞的全部12個物種的完整蛋白質(zhì)組序列來構(gòu)建數(shù)據(jù)庫。將mascotdat文件解析至scaffold軟件中以進行驗證，過濾，并且創(chuàng)建每個樣品的非冗余清單。在1％蛋白質(zhì)和肽假發(fā)現(xiàn)率(fdr)以及每種蛋白質(zhì)要求至少兩種獨特肽下過濾數(shù)據(jù)。鑒定的表達蛋白質(zhì)。質(zhì)譜測定法分析鑒定各表達菌株的總計125種蛋白質(zhì)。報道與蛋白質(zhì)豐度相關(guān)的光譜計數(shù)以確認蛋白質(zhì)表達或分泌。53種蛋白質(zhì)鑒定于rosetta(de3)菌株的全細胞溶解產(chǎn)物中，46種鑒定于rosetta(de3)菌株的可溶性部分中，36種鑒定于rosetta-gamib(de3)中，10種鑒定于rosetta-gami2(de3)中，并且15種鑒定于枯草芽孢桿菌的分泌上清液中。在枯草芽孢桿菌的分泌上清液中檢測的營養(yǎng)性多肽是seqid-00718、seqid-00762、seqid-00763、seqid-00764、seqid-00765、seqid-00766、seqid-00767、seqid-00768、seqid-00769、seqid-00770、seqid-00771、seqid-00772、seqid-00773、seqid-00774、seqid-00775。在大腸桿菌rosetta(de3)菌株的全細胞溶解產(chǎn)物中檢測的營養(yǎng)性多肽是seqid-00716、seqid-00718、seqid-00720、seqid-00723、seqid-00724、seqid-00725、seqid-00729、seqid-00732、seqid-00737、seqid-00751、seqid-00776、seqid-00790、seqid-00797、seqid-00798、seqid-00799、seqid-00800、seqid-00801、seqid-00802、seqid-00803、seqid-00804、seqid-00805、seqid-00806、seqid-00807、seqid-00808、seqid-00809、seqid-00810、seqid-00811、seqid-00812、seqid-00813、seqid-00814、seqid-00815、seqid-00816、seqid-00817、seqid-00818、seqid-00819、seqid-00820、seqid-00821、seqid-00822、seqid-00823、seqid-00824、seqid-00825、seqid-00826、seqid-00827、seqid-00828、seqid-00829、seqid-00830、seqid-00831、seqid-00832、seqid-00833、seqid-00834、seqid-00835、seqid-00836、seqid-00837。在大腸桿菌rosetta(de3)菌株的可溶性溶解產(chǎn)物中檢測的營養(yǎng)性多肽是seqid-00716、seqid-00717、seqid-00718、seqid-00719、seqid-00720、seqid-00721、seqid-00722、seqid-00724、seqid-00725、seqid-00726、seqid-00727、seqid-00728、seqid-00729、seqid-00730、seqid-00731、seqid-00732、seqid-00733、seqid-00734、seqid-00735、seqid-00736、seqid-00737、seqid-00738、seqid-00739、seqid-00740、seqid-00741、seqid-00742、seqid-00743、seqid-00744、seqid-00745、seqid-00746、seqid-00747、seqid-00748、seqid-00749、seqid-00750、seqid-00751、seqid-00752、seqid-00753、seqid-00754、seqid-00755、seqid-00756、seqid-00757、seqid-00758、seqid-00759、seqid-00760、seqid-00761。在大腸桿菌rosetta-gamib(de3)菌株中檢測的營養(yǎng)性多肽是seqid-00003、seqid-00004、seqid-00005、seqid-00716、seqid-00718、seqid-00719、seqid-00720、seqid-00729、seqid-00730、seqid-00731、seqid-00732、seqid-00734、seqid-00736、seqid-00740、seqid-00743、seqid-00752、seqid-00760、seqid-00763、seqid-00764、seqid-00776、seqid-00777、seqid-00778、seqid-00779、seqid-00780、seqid-00781、seqid-00782、seqid-00783、seqid-00784、seqid-00785、seqid-00786、seqid-00787、seqid-00788、seqid-00789、seqid-00790、seqid-00791、seqid-00792。在大腸桿菌rosetta-gami2(de3)菌株中檢測的營養(yǎng)性多肽是seqid-00716、seqid-00737、seqid-00747、seqid-00763、seqid-00789、seqid-00790、seqid-00793、seqid-00794、seqid-00795、seqid-00796。實施例3.使用注釋蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫來鑒定和選擇可食用物種的營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列。構(gòu)建蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。uniprotkb/swiss-prot(歐洲生物信息學(xué)研究所和瑞士生物信息學(xué)研究所的合作)是手動策劃和復(fù)查的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，并且用作構(gòu)建蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的起始點。為構(gòu)建可食用物種的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，對uniprot數(shù)據(jù)庫進行來自如例如2013年3月15日提交的pct/us2013/032232、2013年3月15日提交的pct/us2013/032180、2013年3月15日提交的pct/us2013/032225、2013年3月15日提交的pct/us2013/032218、2013年3月15日提交的pct/us2013/032212以及2013年3月15日提交的pct/us2013/032206中公開的可食用物種的蛋白質(zhì)的搜索。為鑒定從微生物分泌的蛋白質(zhì)，搜索uniprot數(shù)據(jù)庫中來自如本文公開的微生物的物種以及用包括分泌、細胞外、細胞壁和外膜的關(guān)鍵詞或注解進行注釋的蛋白質(zhì)。為鑒定在人膳食中豐富的蛋白質(zhì)，從基因組數(shù)據(jù)庫匯編可食用物種的參照蛋白質(zhì)組。如本文所提供，對從各可食用物種提取的蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜測定法。將通過質(zhì)譜測定法鑒定的肽相對于參照蛋白質(zhì)組來定位，并且將與參照蛋白質(zhì)序列相關(guān)的肽的光譜計數(shù)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)蛋白質(zhì)在食物中的豐度的量度。以高置信度在高于截斷光譜計數(shù)下檢測的所有蛋白質(zhì)都被匯編至數(shù)據(jù)庫中。這些數(shù)據(jù)庫用于鑒定源于可食用物種，被分泌，和/或在人膳食中豐富的蛋白質(zhì)。用于選擇氨基酸序列的方法。一種用于挑選一種蛋白質(zhì)或一組蛋白質(zhì)的方法可包括鑒定一組對有興趣發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的類別、用以從其進行搜索的蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫進行限定的約束條件，以及進行實際搜索。蛋白質(zhì)類別準則可通過營養(yǎng)文獻(即先前已被鑒定為有效的蛋白質(zhì)類別)、所需生理化學(xué)性狀(例如可表達、可溶、非過敏原性、無毒、可消化等)和其它特征來限定?？捎糜谒阉髂康牡南嚓P(guān)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫可由本文公開的序列產(chǎn)生?？杀凰阉鞯牡鞍踪|(zhì)的一個實例是用于肌肉合成代謝/免疫健康/糖尿病治療的高度可溶性類別的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)通常是可溶性表達的，在純化/分離后高度可溶，非過敏原性的，無毒的，快速消化的，并且滿足一定基本營養(yǎng)準則(例如[eaa]>0.3，[bcaa]>0.15，[亮氨酸或谷氨酰胺或精氨酸]>0.08，eaa全面)。使用基于與蛋白質(zhì)序列的親水性和疏水性相關(guān)的兩種參數(shù)：溶合評分和聚集評分的二元分類模型來對可表達、可溶性蛋白質(zhì)進行搜索(對于所述模型的功效的這兩種量度和度量的各種描述，參見以下實施例)?；蛘?，可對具有指示每個氨基酸負電荷或正電荷的凈過量的較高(或較低)每個氨基酸凈電荷的高度帶電荷蛋白質(zhì)進行搜索(對于其它描述，參見以下實施例)。通過基于一級序列計算所有相關(guān)氨基酸的質(zhì)量分數(shù)，營養(yǎng)準則得以滿足。對于其中需要匹配已知臨床有效氨基酸摻合物的情況，可使用加權(quán)euclidean距離方法(參見以下實施例)。如本文所提供，使用基于序列的同源性評估來搜索過敏原性/毒性/非過敏原性/抗營養(yǎng)性準則，其中將各候選序列與已知過敏原、毒素、非過敏原或抗營養(yǎng)性(例如蛋白酶抑制性)蛋白質(zhì)(參見本文實例)的文庫進行比較。一般來說，<50％整體或<35％局部(在任何給定80aa窗口內(nèi))同源性(同一性百分比)的截斷值可用于過敏原性篩選，并且<35％整體可用于毒性和抗營養(yǎng)性篩選。在所有情況下，較小值都暗示過敏原性/毒性/抗營養(yǎng)性較小。非過敏原性篩選通常較少用作截斷，但可使用>62％作為截斷值(較大值暗示更具非過敏原性)。這些篩選使清單縮減為符合目標準則的一個較小子組的被富化的蛋白質(zhì)。接著使用多種聚合目標函數(shù)對這個清單分級，并且從這個分級排序清單進行選擇。實施例4.選擇氨基酸序列以說明營養(yǎng)性多肽的氨基酸藥理學(xué)。鑒定用于治療肌肉減少癥的富含亮氨酸和必需氨基酸的蛋白質(zhì)。如本文所述，肌肉減少癥是骨骼肌質(zhì)量(通常在25歲之后每年損失0.5-1％)、品質(zhì)和強度的與衰老相關(guān)的退化性損失。肌肉減少癥的特征首先在于肌肉萎縮(肌肉尺寸降低)，以及由諸如肌肉纖維被脂肪置換、纖維化增加、肌肉代謝變化、氧化應(yīng)激和神經(jīng)肌肉接點退化的因素引起的肌肉組織“品質(zhì)”降低。這些變化組合在一起導(dǎo)致肌肉功能進行性損失，并且最終導(dǎo)致虛弱。已顯示在年長肌肉減少癥個體中補充必需氨基酸可對肌肉質(zhì)量具有合成代謝作用和/或節(jié)約作用。此外，這個補充也可轉(zhuǎn)變成患者強度和肌肉品質(zhì)的改進。參見例如paddon-jonesd等jclinendocrinolmetab2004,89:4351–4358；ferrando,a等clinicalnutrition20091-6；katsanosc等amjphysiolendocrinolmetab.2006,291:381-387。也已顯示必需氨基酸亮氨酸是刺激肌肉蛋白質(zhì)合成的特別重要因素。參見例如borscheime等amjphysiolendocrinolmetab2002,283:e648-e657；borsheime等clinnutr.2008,27:189-95；esmarckb等jphysiol2001,535:301-311；moored等amjclinnutr2009,89:161-8)?？赏ㄟ^選擇以質(zhì)量計富含亮氨酸和其它必需氨基酸的蛋白質(zhì)來鑒定有益于罹患肌肉減少癥的個體的營養(yǎng)性多肽。使用源于如本文所述的可食用物種的所有蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫，鑒定富含亮氨酸(≥15質(zhì)量％)和必需氨基酸(≥40質(zhì)量％)的候選序列，并且根據(jù)它們的相對于總氨基酸質(zhì)量的總亮氨酸加必需氨基酸質(zhì)量來分級排序。為增加這些蛋白質(zhì)可溶性表達以及在ph7下在聚集傾向降低下高度可溶的概率，應(yīng)用-20kcal/mol/aa和0.5的溶合評分和聚集評分上界。為降低這些蛋白質(zhì)將引發(fā)過敏原性應(yīng)答的可能性，整體過敏原同源性和過敏原性評分的上界被分別設(shè)置為50％和35％。為降低這些蛋白質(zhì)將在攝取后具有毒性作用的可能性，毒性評分的上界被設(shè)置為35％。為降低這些蛋白質(zhì)將充當消化性蛋白酶的抑制劑的可能性，抗營養(yǎng)性評分的上界被設(shè)置為35％。富含亮氨酸(≥15質(zhì)量％)和必需氨基酸(≥40質(zhì)量％)，并且滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上提及的截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e4a中。表e4a.seqideaalseqid-035520.560.21seqid-035810.600.15seqid-035320.580.16seqid-034750.560.17seqid-034990.580.15seqid-034940.540.18seqid-034600.540.17seqid-034850.540.16seqid-035130.540.15seqid-034910.520.17來自表達蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的富含亮氨酸(≥15質(zhì)量％)和必需氨基酸(≥40質(zhì)量％)的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e4b中。表e4b.seqideaalseqid-001620.640.34seqid-001320.600.32seqid-001660.650.26seqid-001690.600.25seqid-001370.640.20seqid-001340.580.24seqid-001750.630.19seqid-001940.540.26seqid-001930.530.26seqid-001950.520.26實施例5.選擇富含必需氨基酸以及在各種個別目標氨基酸方面增濃或降低的營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列。使用源于如本文所述的可食用物種的所有蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫，鑒定富含必需氨基酸，各氨基酸的量升高或降低的候選序列。為增加這些蛋白質(zhì)將可溶性表達以及在ph7下在聚集傾向降低下高度可溶的概率，應(yīng)用-20kcal/mol/aa和0.5的溶合評分和聚集評分上界。為降低這些蛋白質(zhì)將引發(fā)過敏原性應(yīng)答的可能性，整體過敏原同源性和過敏原性評分的上界被分別設(shè)置為50％和35％。為降低這些蛋白質(zhì)將在攝取后具有毒性作用的可能性，毒性評分的上界被設(shè)置為35％。為降低這些蛋白質(zhì)將充當消化性蛋白酶的抑制劑的可能性，抗營養(yǎng)性評分的上界被設(shè)置為35％。當搜索在給定氨基酸方面增濃或降低的蛋白質(zhì)時，應(yīng)用上述截斷值，并且根據(jù)它們的所需氨基酸的計算氨基酸質(zhì)量分數(shù)，接著根據(jù)它們的必需氨基酸含量來將蛋白質(zhì)分級排序。富含丙氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5a中。丙氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5b中。表e5a.seqideaaaseqid-036780.460.18seqid-036820.440.18seqid-036460.460.18seqid-036530.390.16seqid-037170.380.16seqid-036860.410.15seqid-038070.460.15seqid-038640.440.15seqid-036630.350.15seqid-037770.460.14表e5b.富含精氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5c中。精氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5d中。表e5c.seqideaarseqid-034730.060.72seqid-038550.090.65seqid-037270.100.63seqid-037670.170.62seqid-037040.170.60seqid-034590.100.60seqid-037310.160.48seqid-036980.470.40seqid-036870.370.38seqid-037320.190.38表e5d.seqideaarseqid-037440.600.00seqid-037700.560.00seqid-038800.520.00seqid-037360.490.00seqid-037060.490.00seqid-038810.490.00seqid-036680.490.00seqid-037330.460.00seqid-037640.460.00seqid-038320.440.00富含天冬酰胺，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5e中。天冬酰胺降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5f中。表e5eseqideaanseqid-037230.390.15seqid-037210.390.15seqid-038030.420.15seqid-038010.380.15seqid-037140.400.14seqid-037420.410.14seqid-037240.380.14seqid-038840.420.14seqid-037780.390.13seqid-037460.410.13表e5fseqideaanseqid-038740.620.00seqid-037930.590.00seqid-037890.570.00seqid-038690.570.00seqid-038090.570.00seqid-036620.560.00seqid-038500.550.00seqid-037830.550.00seqid-037530.540.00seqid-036770.530.00富含天冬氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5g中。天冬氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5h中。表e5g表e5hseqideaadseqid-037950.620.00seqid-034680.620.00seqid-036720.620.00seqid-036560.610.00seqid-035170.600.00seqid-034930.600.00seqid-038160.600.00seqid-037960.590.00seqid-038680.590.00seqid-037400.590.00富含半胱氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5i中。半胱氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5j中。表e5iseqideaacseqid-034950.240.30seqid-035140.240.30seqid-035710.240.28seqid-034300.360.27seqid-034190.370.16seqid-034780.290.16seqid-035230.330.16seqid-035040.350.16seqid-034770.280.16seqid-034590.100.16表e5j富含谷氨酰胺，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5k中。谷氨酰胺降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5l中。表e5kseqideaaqseqid-036760.290.19seqid-037200.290.19seqid-036830.330.19seqid-037820.460.18seqid-036810.460.18seqid-038520.460.18seqid-036710.430.17seqid-005150.250.17seqid-038660.400.17seqid-038240.360.16表e5lseqideaaqseqid-036360.650.00seqid-037950.620.00seqid-034680.620.00seqid-034840.620.00seqid-035700.590.00seqid-034220.580.00seqid-034320.580.00seqid-035900.580.00seqid-035150.580.00seqid-034990.580.00富含組氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5m中。組氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5n中。表e5mseqideaahseqid-037440.600.25seqid-035510.480.24seqid-037450.560.19seqid-037930.590.19seqid-034680.620.15seqid-037430.380.13seqid-037110.560.12seqid-038470.580.12seqid-036370.430.12seqid-037390.520.12表e5nseqideaahseqid-037950.620.00seqid-038740.620.00seqid-036560.610.00seqid-035170.600.00seqid-034930.600.00seqid-038160.600.00seqid-037960.590.00seqid-037400.590.00seqid-038140.580.00seqid-038370.570.00富含異亮氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5o中。異亮氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5p中。表e5oseqideaaiseqid-037220.400.15seqid-038050.380.15seqid-034350.400.15seqid-038380.420.15seqid-036550.540.15seqid-038280.490.15seqid-035930.390.15seqid-038180.510.15seqid-038410.490.15seqid-038430.480.14表e5pseqideaaiseqid-035810.600.00seqid-036850.570.00seqid-037050.560.00seqid-036600.550.00seqid-037790.530.00seqid-037810.520.00seqid-036470.510.00seqid-037850.500.00seqid-038650.500.00seqid-038020.490.00富含亮氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5q中。亮氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5r中。表e5q表e5rseqideaalseqid-036610.530.00seqid-038490.520.00seqid-036440.420.00seqid-038780.390.00seqid-036520.380.00seqid-034190.370.00seqid-036540.360.00seqid-038040.360.00seqid-035040.350.00seqid-034770.280.00富含賴氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5s中。賴氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5t中。表e5sseqideaakseqid-036480.520.36seqid-037970.560.34seqid-038300.520.31seqid-038290.540.30seqid-035810.600.30seqid-035200.360.30seqid-034570.370.30seqid-034710.360.29seqid-038590.530.29seqid-034560.340.29表e5t富含甲硫氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5u中。精氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5v中。表e5useqideaamseqid-005520.450.16seqid-038700.520.15seqid-036800.490.15seqid-038880.390.13seqid-037380.370.13seqid-036980.470.13seqid-035840.530.12seqid-034870.530.11seqid-038580.490.11seqid-037870.460.11表e5vseqideaamseqid-037010.490.00seqid-038610.490.00seqid-037030.490.00seqid-037020.470.00seqid-037730.460.00seqid-037070.450.00seqid-037260.410.00seqid-037250.390.00seqid-037340.390.00seqid-037000.370.00富含苯丙氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5w中。苯丙氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5x中。表e5wseqideaafseqid-037610.480.14seqid-038310.560.14seqid-038360.550.13seqid-034370.410.13seqid-037490.410.13seqid-035580.440.13seqid-037910.490.13seqid-037290.500.12seqid-038460.400.12seqid-038620.500.12表e5xseqideaafseqid-035810.600.00seqid-034410.570.00seqid-036850.570.00seqid-035730.550.00seqid-036610.530.00seqid-038590.530.00seqid-036880.530.00seqid-036750.530.00seqid-036090.530.00seqid-035840.530.00富含脯氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5y中。脯氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5z中。表e5y表e5zseqideaapseqid-036360.650.00seqid-034680.620.00seqid-037900.570.00seqid-034860.570.00seqid-036650.560.00seqid-038330.560.00seqid-035880.560.00seqid-038080.560.00seqid-037190.560.00seqid-038150.550.00富含絲氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5aa中。絲氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5ab中。表e5aa表e5abseqideaasseqid-034410.570.00seqid-038670.550.00seqid-036450.430.00seqid-034550.350.00seqid-037750.300.00seqid-037710.280.00seqid-037720.280.00seqid-037160.260.00seqid-038730.260.00seqid-035080.410.01富含蘇氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5ac中。蘇氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5ad中。表e5acseqideaatseqid-037180.420.16seqid-037770.460.14seqid-037130.420.12seqid-038710.440.12seqid-038670.550.12seqid-038190.480.12seqid-038200.410.11seqid-036530.390.11seqid-037170.380.11seqid-038770.450.11表e5ad富含色氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5ae中。色氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5af中。表e5aeseqideaawseqid-035830.420.15seqid-036350.400.13seqid-035550.500.11seqid-036790.480.09seqid-034400.440.09seqid-034390.450.09seqid-034680.620.08seqid-015460.510.08seqid-035760.420.08seqid-038210.440.08表e5afseqideaawseqid-036720.620.00seqid-035120.610.00seqid-036060.600.00seqid-037440.600.00seqid-035810.600.00seqid-038680.590.00seqid-037620.590.00seqid-038570.590.00seqid-037930.590.00seqid-037690.590.00富含酪氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5ag中。酪氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5ah中。表e5agseqideaayseqid-038480.320.16seqid-038310.560.15seqid-038760.260.15seqid-003250.420.14seqid-037940.430.14seqid-038260.380.14seqid-036590.460.14seqid-037860.350.14seqid-037840.380.14seqid-038230.390.14表e5ahseqideaayseqid-034680.620.00seqid-034420.610.00seqid-034170.610.00seqid-035630.610.00seqid-036060.600.00seqid-034690.600.00seqid-034430.600.00seqid-035810.600.00seqid-037960.590.00seqid-037620.590.00富含纈氨酸，滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5ai中。纈氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5aj中。表e5ai表e5ajseqideaavseqid-038790.560.00seqid-035520.560.00seqid-038350.540.00seqid-038510.530.00seqid-037570.530.00seqid-036480.520.00seqid-037660.500.00seqid-037100.460.00seqid-037640.460.00seqid-005520.450.00選擇富含必需氨基酸以及在各種個別氨基酸方面增濃或降低的表達蛋白質(zhì)。使用本文所述的所有表達蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫，鑒定富含必需氨基酸，各氨基酸的量升高或降低的候選序列。當搜索在給定氨基酸方面增濃或降低的蛋白質(zhì)時，根據(jù)它們的所需氨基酸的計算氨基酸質(zhì)量分數(shù)，接著根據(jù)它們的必需氨基酸含量來將蛋白質(zhì)分級排序。富含丙氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5ak中。丙氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5al中。表e5ak表e5alseqideaaaseqid-001400.700.00seqid-000570.410.00seqid-006520.280.00seqid-001990.520.00seqid-001980.530.00seqid-001970.520.00seqid-001960.530.00seqid-007220.530.01seqid-002040.510.01seqid-002030.510.01富含精氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5am中。精氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5an中。表e5amseqideaarseqid-005400.410.23seqid-005670.420.22seqid-006360.470.22seqid-005560.330.22seqid-006370.420.22seqid-005750.330.22seqid-004920.420.21seqid-006310.380.21seqid-005510.410.21seqid-003280.450.20表e5an富含天冬酰胺的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5ao中。天冬酰胺降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5ap中。表e5aoseqideaanseqid-001950.520.14seqid-001940.540.14seqid-001930.530.12seqid-038720.470.12seqid-013880.360.12seqid-005520.450.12seqid-001690.600.11seqid-001960.530.10seqid-001970.520.10seqid-036930.340.10表e5apseqideaanseqid-005360.580.00seqid-002840.540.00seqid-002120.510.00seqid-001010.510.00seqid-002190.500.00seqid-006340.500.00seqid-006240.490.00seqid-006390.460.00seqid-005970.450.00seqid-005270.400.00富含天冬氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5aq中。天冬氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5ar中。表e5aqseqideaadseqid-005620.400.19seqid-038530.340.17seqid-001160.320.16seqid-001020.450.16seqid-001150.320.16seqid-004840.380.16seqid-001000.460.15seqid-002200.520.15seqid-000980.500.15seqid-000780.460.14表e5arseqideaadseqid-001660.650.00seqid-000510.590.00seqid-000520.590.00seqid-000530.570.00seqid-000540.550.00seqid-000550.550.00seqid-005230.510.00seqid-006350.460.00seqid-002300.450.00seqid-006370.420.00富含半胱氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5as中。半胱氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5at中。表e5as表e5atseqideaacseqid-001660.650.00seqid-001370.640.00seqid-005250.640.00seqid-001620.640.00seqid-032970.620.00seqid-001690.600.00seqid-001320.600.00seqid-002980.590.00seqid-005360.580.00seqid-002970.580.00富含谷氨酰胺的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5au中。谷氨酰胺降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5av中。表e5auseqideaaqseqid-007430.290.22seqid-005130.330.17seqid-036950.380.17seqid-005220.400.17seqid-005150.250.17seqid-036920.440.14seqid-036660.350.13seqid-006130.360.13seqid-005850.440.13seqid-002230.500.13表e5avseqideaaqseqid-001430.650.00seqid-001370.640.00seqid-005250.640.00seqid-001340.580.00seqid-001940.540.00seqid-001930.530.00seqid-001950.520.00seqid-006500.500.00seqid-005630.500.00seqid-005980.490.00富含組氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5aw中。組氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5ax中。表e5awseqideaahseqid-005360.580.23seqid-005600.550.18seqid-011620.480.12seqid-005850.440.10seqid-002980.590.10seqid-006150.400.10seqid-005250.640.10seqid-002970.580.10seqid-007640.560.09seqid-001280.530.08表e5axseqideaahseqid-000430.570.00seqid-005310.550.00seqid-005920.530.00seqid-002240.530.00seqid-000240.520.00seqid-006250.520.00seqid-002330.520.00seqid-005870.510.00seqid-002130.510.00seqid-002140.510.00富含異亮氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5ay中。異亮氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5az中。表e5ayseqideaaiseqid-005610.680.18seqid-001340.580.14seqid-001750.630.14seqid-001620.640.14seqid-002340.510.13seqid-002330.520.13seqid-001690.600.13seqid-000250.480.13seqid-000430.570.12seqid-005840.500.12表e5azseqideaaiseqid-007620.560.00seqid-007640.560.00seqid-005710.540.00seqid-002120.510.00seqid-002370.480.00seqid-002360.450.00seqid-005510.410.00seqid-005150.250.01seqid-001280.530.01seqid-006510.390.01富含亮氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5ba中。亮氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5bb中。表e5ba表e5bbseqideaalseqid-005530.390.00seqid-007430.290.00seqid-005220.400.01seqid-005540.380.01seqid-005850.440.01seqid-005600.550.01seqid-005290.380.01seqid-005520.450.01seqid-005470.490.01seqid-005750.330.01富含賴氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5bc中。賴氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5bd中。表e5bcseqideaakseqid-005600.550.26seqid-005730.540.23seqid-006190.510.23seqid-005530.390.23seqid-005720.540.23seqid-006230.540.23seqid-036910.520.23seqid-005030.490.22seqid-005640.510.22seqid-005170.490.22表e5bd富含甲硫氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5be中。精氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5bf中。表e5beseqideaamseqid-005520.450.16seqid-005130.330.13seqid-005290.380.09seqid-005260.410.09seqid-008680.480.09seqid-005950.440.09seqid-005840.500.09seqid-004860.560.09seqid-000920.420.08seqid-000740.420.08表e5bfseqideaamseqid-001320.600.00seqid-000510.590.00seqid-000520.590.00seqid-000430.570.00seqid-000530.570.00seqid-000550.550.00seqid-000540.550.00seqid-002240.530.00seqid-000240.520.00seqid-002200.520.00富含苯丙氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5bg中。苯丙氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5bh中。表e5bgseqideaafseqid-001500.670.13seqid-005950.440.13seqid-005610.680.13seqid-001180.510.12seqid-005970.450.12seqid-005070.510.12seqid-005940.440.12seqid-005010.500.12seqid-001750.630.11seqid-004850.460.11表e5bhseqideaafseqid-001620.640.00seqid-005600.550.00seqid-002240.530.00seqid-002200.520.00seqid-001950.520.00seqid-002410.520.00seqid-002150.510.00seqid-002130.510.00seqid-002140.510.00seqid-002120.510.00富含脯氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5bi中。脯氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5bj中。表e5bi表e5bjseqideaapseqid-001500.670.00seqid-001370.640.00seqid-002870.590.00seqid-005480.590.00seqid-001420.560.00seqid-005600.550.00seqid-002240.530.00seqid-002200.520.00seqid-002410.520.00seqid-002160.520.00富含絲氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5bk中。絲氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5bl中。表e5bkseqideaasseqid-034470.300.27seqid-004830.420.16seqid-005350.300.16seqid-006300.350.14seqid-001340.580.14seqid-005570.470.13seqid-037600.390.12seqid-036420.370.12seqid-006520.280.12seqid-005770.470.12表e5bl富含蘇氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5bm中。蘇氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5bn中。表e5bmseqideaatseqid-004040.490.14seqid-005470.490.13seqid-005220.400.13seqid-005690.560.13seqid-005280.530.11seqid-005040.470.11seqid-037680.420.11seqid-005230.510.11seqid-036490.490.11seqid-001160.320.11表e5bnseqideaatseqid-005600.550.00seqid-000570.410.00seqid-005420.410.00seqid-000590.410.00seqid-000150.300.00seqid-000140.300.00seqid-000130.280.00seqid-000070.280.00seqid-000070.280.00seqid-006210.390.01富含色氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5bm中。色氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5bn中。表e5bmseqideaawseqid-015460.510.08seqid-006420.450.08seqid-036900.430.08seqid-037760.430.08seqid-032970.620.07seqid-032440.460.07seqid-005120.440.07seqid-008140.420.07seqid-001100.490.06seqid-031370.500.06表e5bnseqideaawseqid-001660.650.00seqid-001370.640.00seqid-005250.640.00seqid-001620.640.00seqid-001690.600.00seqid-000510.590.00seqid-000520.590.00seqid-001340.580.00seqid-005360.580.00seqid-000430.570.00富含酪氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5bo中。酪氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5bp中。表e5bo表e5bpseqideaayseqid-001400.700.00seqid-001460.670.00seqid-000510.590.00seqid-000520.590.00seqid-005480.590.00seqid-001340.580.00seqid-000430.570.00seqid-000530.570.00seqid-000540.550.00seqid-000550.550.00富含纈氨酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e5bq中。纈氨酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列顯示于表e5br中。表e5bqseqideaavseqid-005500.490.18seqid-005920.530.16seqid-005320.440.15seqid-006200.500.15seqid-006440.420.14seqid-005140.460.13seqid-005180.520.13seqid-005980.490.13seqid-005810.510.13seqid-001450.510.13表e5br實施例6.選擇用以提供蛋白質(zhì)營養(yǎng)以及用于治療蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良的富含必需氨基酸的營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列。已顯示人不能內(nèi)源性合成20種天然存在的氨基酸中的9種：組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和色氨酸(young,v.r.和tharakan,j.f.nutritionalessentialityofaminoacidsandaminoacidrequirementsinhealthyadults.metabolicandtherapeuticaspectsofaminoacidsinclinicalnutrition.第2版.cynober,l.a.編；crcpress:newyork,2004；第439-470頁)。因此，需要攝取足量的這9種必需氨基酸以避免蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良和由這個狀態(tài)所致的有害健康影響。通過選擇以質(zhì)量計富含必需氨基酸，并且含有非零量的各必需氨基酸(即營養(yǎng)性多肽序列是必需氨基酸全面的)的營養(yǎng)性多肽來鑒定適用于在健康或營養(yǎng)失調(diào)個體中滿足這些必需氨基酸需求的營養(yǎng)性多肽。使用源于如本文所述的可食用物種的所有蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫，鑒定是必需氨基酸全面的，并且富含必需氨基酸的候選序列。為增加這些蛋白質(zhì)可溶性表達以及在ph7下在聚集傾向降低下高度可溶的概率，應(yīng)用-20kcal/mol/aa和0.5的溶合評分和聚集評分上界。為降低這些蛋白質(zhì)將引發(fā)過敏原性應(yīng)答的可能性，整體過敏原同源性和過敏原性評分的上界被分別設(shè)置為50％和35％。為降低這些蛋白質(zhì)將在攝取后具有毒性作用的可能性，毒性評分的上界被設(shè)置為35％。為降低這些蛋白質(zhì)將充當消化性蛋白酶的抑制劑的可能性，抗營養(yǎng)性評分的上界被設(shè)置為35％。是必需氨基酸全面的，富含必需氨基酸，并且滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上提及的截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e6a中。表e6aseqideaaceaaseqid-0363610.65seqid-0349210.63seqid-0346810.62seqid-0354410.62seqid-0348410.62seqid-0344210.61seqid-0341710.61seqid-0356310.61seqid-0346910.60seqid-0344310.60來自表達蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的是必需氨基酸全面的，并且富含必需氨基酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e6b中。表e6bseqideaaceaaseqid-0014010.70seqid-0056110.68seqid-0014610.67seqid-0015010.67seqid-0014310.65seqid-0329710.62seqid-0048710.61seqid-0028710.59seqid-0029810.59seqid-0054810.59實施例7.選擇用于達成肌肉健康的富含支鏈氨基酸的營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列，以及選擇用于治療糖尿病、心血管疾病、慢性腎病和中風(fēng)，支鏈氨基酸降低的營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列。鑒定用于治療肝病和/或腎病的富含支鏈氨基酸的蛋白質(zhì)。使用源于如本文所述的可食用物種的所有蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫，鑒定在支鏈氨基酸方面增濃或降低的候選序列。為增加這些蛋白質(zhì)可溶性表達以及在ph7下在聚集傾向降低下高度可溶的概率，應(yīng)用-20kcal/mol/aa和0.5的溶合評分和聚集評分上界。為降低這些蛋白質(zhì)將引發(fā)過敏原性應(yīng)答的可能性，整體過敏原同源性和過敏原性評分的上界被分別設(shè)置為50％和35％。為降低這些蛋白質(zhì)將在攝取后具有毒性作用的可能性，毒性評分的上界被設(shè)置為35％。為降低這些蛋白質(zhì)將充當消化性蛋白酶的抑制劑的可能性，抗營養(yǎng)性評分的上界被設(shè)置為35％。富含支鏈氨基酸，并且滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上提及的截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e7a中。表e7aseqideaabcaaseqid-035320.580.31seqid-036160.530.31seqid-036290.560.31seqid-036190.520.29seqid-035420.490.29seqid-035190.490.29seqid-036030.530.29seqid-035360.520.29seqid-035970.480.29seqid-036230.490.29來自表達蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的富含支鏈氨基酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e7b中。表e7b支鏈氨基酸降低，并且滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上提及的截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e7c中。表e7cseqideaabcaaseqid-034710.360.01seqid-034730.060.01seqid-035710.240.01seqid-034950.240.01seqid-035140.240.01seqid-005520.450.03seqid-036110.370.03seqid-034570.370.03seqid-034560.340.03seqid-035200.360.03來自表達蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，支鏈氨基酸降低的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e7d中。表e7dseqideaabcaaseqid-005520.450.03seqid-005220.400.03seqid-005150.250.05seqid-005530.390.05seqid-005850.440.06seqid-006370.420.07seqid-006520.280.08seqid-006150.400.08seqid-007430.290.08seqid-005470.490.09實施例8.選擇用于治療或預(yù)防苯丙酮酸尿癥的具有較低或不具有苯丙氨酸，并且富含酪氨酸和所有其它必需氨基酸的營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列。常由于肝酶苯丙氨酸羥化酶功能失常，罹患苯丙酮酸尿癥(pku)的個體不能處理氨基酸苯丙氨酸并催化它轉(zhuǎn)化成酪氨酸(macleode.l.和neyd.m.nutritionalmanagementofphenylketonuria.annalesnestle.(2010)68:58-69)。在這些個體中，當含有氨基酸苯丙氨酸的蛋白質(zhì)被攝取時，苯丙氨酸積累在血液中。未治療的pku具有嚴重不利健康影響，包括學(xué)習(xí)表現(xiàn)受損、執(zhí)行功能受損以及長期智力失能(matalon,r.,michals-matalon,k.,bhatia,g.,grechanina,e.,novikov,p.,mcdonald,j.d.,grady,j.,tyring,s.k.,guttler,f.largeneutralaminoacidsinthetreatmentofphenylketonuria.j.inherit.metab.dis.(2006)29:732-738)。一種可保持苯丙氨酸血液水平較低以避免神經(jīng)影響的方式在于避免攝取含有苯丙氨酸的蛋白質(zhì)和/或僅消耗苯丙氨酸較低的蛋白質(zhì)來源。因為也必須滿足所有其它氨基酸的基本蛋白質(zhì)營養(yǎng)需求，所以需要充足攝取其它必需氨基酸(組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和色氨酸)和在這些個體中變?yōu)闂l件性必需的酪氨酸。可通過選擇含有較低或不含有苯丙氨酸，并且以質(zhì)量計富含酪氨酸和其它必需氨基酸的蛋白質(zhì)來鑒定有益于罹患苯丙酮酸尿癥的個體的營養(yǎng)性多肽。使用源于如本文所述的可食用物種的所有蛋白質(zhì)序列的數(shù)據(jù)庫，鑒定以質(zhì)量計含有較低或不含有苯丙氨酸，是必需氨基酸和酪氨酸全面的(除苯丙氨酸之外)，并且富含酪氨酸和必需氨基酸的候選序列，并且首先根據(jù)它們的苯丙氨酸質(zhì)量分數(shù)，接著根據(jù)它們的總酪氨酸加必需氨基酸質(zhì)量分數(shù)來分級排序。為增加這些蛋白質(zhì)可溶性表達以及在ph7下在聚集傾向降低下高度可溶的概率，應(yīng)用-20kcal/mol/aa和0.5的溶合評分和聚集評分上界。為降低這些蛋白質(zhì)將引發(fā)過敏原性應(yīng)答的可能性，整體過敏原同源性和過敏原性評分的上界被分別設(shè)置為50％和35％。為降低這些蛋白質(zhì)將在攝取后具有毒性作用的可能性，毒性評分的上界被設(shè)置為35％。為降低這些蛋白質(zhì)將充當消化性蛋白酶的抑制劑的可能性，抗營養(yǎng)性評分的上界被設(shè)置為35％。以質(zhì)量計含有較低或不含有苯丙氨酸，是必需氨基酸和酪氨酸全面的(除苯丙氨酸之外)，富含酪氨酸和必需氨基酸，并且滿足溶合評分、聚集評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上提及的截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e8a中。表e8aseqideaafyseqid-035840.530.000.09seqid-034790.520.000.04seqid-035730.550.000.01seqid-006340.500.000.05seqid-034660.490.000.05seqid-036090.530.000.01seqid-034980.450.000.06seqid-034650.400.000.08seqid-035870.460.000.01seqid-034630.410.000.05來自表達蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的以質(zhì)量計含有較低或不含有苯丙氨酸，是必需氨基酸和酪氨酸全面的(除苯丙氨酸之外)，并且富含酪氨酸和必需氨基酸的前10名營養(yǎng)性多肽序列的示例性清單顯示于表e8b中。表e8b實施例9.選擇含有天然存在的蛋白質(zhì)序列的片段或區(qū)域的營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列：富含亮氨酸和所有必需氨基酸的營養(yǎng)性多肽片段。在一些情況下，鑒于一種或多種由一種或多種重要參數(shù)限定的選擇要求，從本文所述的數(shù)據(jù)庫鑒定的全長蛋白質(zhì)并非特別有利，或另外以質(zhì)量計，相對于營養(yǎng)性多肽的總質(zhì)量，不提供足夠一種或多種特定氨基酸。在這些情況下，在數(shù)據(jù)庫中鑒定的營養(yǎng)性多肽的一個或多個片段(在本文中也稱為“區(qū)域”)能夠滿足所需搜索準則。通過獲取數(shù)據(jù)庫中各全長序列以及考查其中含有的長度是至少25個氨基酸的所有可能的子序列來產(chǎn)生和搜索含有營養(yǎng)性多肽的可能片段的數(shù)據(jù)庫。舉例來說，需要的是發(fā)現(xiàn)亮氨酸質(zhì)量分數(shù)大于約0.2，并且高度帶電荷以增加可溶性表達的可能性的營養(yǎng)性多肽序列。使用溶合評分截斷值小于-30搜索本文所述的蛋白質(zhì)可食用物種數(shù)據(jù)庫，并且為降低這些蛋白質(zhì)將引發(fā)過敏原性應(yīng)答的可能性，整體過敏原同源性和過敏原性評分的上界被設(shè)置為50％。為降低這些蛋白質(zhì)將在攝取后具有毒性作用的可能性，毒性評分的上界被設(shè)置為35％。為降低這些蛋白質(zhì)將充當消化性蛋白酶的抑制劑的可能性，抗營養(yǎng)性評分的上界被設(shè)置為35％。富含亮氨酸(≥20質(zhì)量％)，并且滿足溶合評分、整體過敏原同源性、過敏原性評分、毒性評分和抗營養(yǎng)性評分的以上提及的截斷值的前10名營養(yǎng)性多肽片段的示例性清單顯示于表e9a中。表e9a來自表達蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的富含亮氨酸(≥20質(zhì)量％)的前10名營養(yǎng)性多肽片段的示例性清單顯示于表e9b中。表e9bseqideaalseqid-001320.600.32seqid-001950.520.26seqid-001940.540.26seqid-001930.530.26seqid-001660.650.26seqid-001340.580.24seqid-002120.510.23seqid-001390.490.23seqid-002130.510.21seqid-001480.470.21實施例10.營養(yǎng)性多肽的純化。各種純化方法已用于從諸如原料食物、細胞、鹽、小分子、宿主細胞蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的其它物質(zhì)分離營養(yǎng)性多肽或使營養(yǎng)性多肽分離以離開所述其它物質(zhì)。這些方法包括透濾、沉淀、絮凝、水性兩相提取和色譜法。通過抗flag親和色譜法純化?？筬lag純化提供一種用以從低滴度表達系統(tǒng)或從類似帶電荷的宿主細胞蛋白質(zhì)純化營養(yǎng)性多肽的方法。營養(yǎng)性多肽被工程改造來含有附接于蛋白質(zhì)的c末端的單一flag標簽(dykddddk)或三重串聯(lián)flag標簽(dykddddkdykddddkdykddddk)?？筬lag親和純化提供一種單步純化方法，其提供非變性工藝條件和洗脫純度>95％(einhauer等,2001journalofbiochemicalandbiophysicalmethods)。使用抗flagm2親和瓊脂糖凝膠(sigmaaldrich,st.louis,mo)純化營養(yǎng)性多肽。m2親和樹脂被特定設(shè)計來與c末端flag表位一起使用。對于n末端附接的flag表位的純化，使用m1親和瓊脂糖凝膠。m2親和瓊脂糖凝膠(樹脂)具有每ml樹脂約0.5mg營養(yǎng)性多肽的宣傳靜態(tài)結(jié)合容量(sbc)。使用20-40ml抗flag樹脂從黑曲霉分泌培養(yǎng)基和枯草芽孢桿菌分泌培養(yǎng)基進行營養(yǎng)性多肽純化。在純化之前，調(diào)整分泌培養(yǎng)基以獲得150mmnacl和ph7.4。通過用過量1xtris緩沖鹽水(tbs)(ph7.4±0.1)沖洗介質(zhì)，以及通過0.2um聚醚砜(pes)真空過濾器收集它來平衡樹脂。接著以批式模式使平衡的樹脂與分泌培養(yǎng)基混合，并且使其在室溫下混合1小時。通過使整個混合物穿過0.2umpes真空過濾器來從樹脂移除未結(jié)合物質(zhì)。樹脂被物理收集于過濾器的表面上，并且隨后用20樹脂體積的tbs(ph7.4±0.1)洗滌以進一步通過0.2umpes真空過濾器移除未結(jié)合物質(zhì)。將洗滌的樹脂轉(zhuǎn)移至滴柱(各自10ml)中，并且結(jié)合的多肽用2柱體積(cv)的0.1m甘氨酸(ph3.0)洗脫。使洗脫的多肽從滴柱直接流入含有1mtris(ph8.0)的錐形管中；這個策略用于盡快中和洗脫的多肽溶液的ph。使用額外3cv的0.1m甘氨酸(ph3.0)再生樹脂。對于短期儲存，將樹脂在4℃下儲存在1xtbs(ph7.4)中；對于長期儲存，將樹脂在-20℃下儲存在0.5xtbs(ph7.4)、50％甘油中。對來自枯草芽孢桿菌的seqid-00105的示例性抗flag純化產(chǎn)生于4.3ml洗脫物中的4.0mg蛋白質(zhì)。將樣品在3種不同稀釋度下裝載于聚丙烯酰胺凝膠上以增加靈敏性，并且得知seqid-00105的純度是95％。根據(jù)相同程序?qū)碜院谇沟膕eqid-00298進行示例性抗flag純化。如所述中和洗脫份，并且通過如本文所述的sds-page和bradford測定來分析。得知洗脫中的主帶的純度是95％。將洗脫中的主帶與同一凝膠上的mw階梯進行比較，并且匹配seqid-00298的預(yù)期分子量。40ml抗flag樹脂捕集了4.0mg物質(zhì)，從而產(chǎn)生0.10mg/ml的估計樹脂容量。通過5ml固定金屬親和色譜法(imac)純化。以振蕩燒瓶發(fā)酵方式使大腸桿菌生長，其中如本文所述靶向表達具有his8標簽的個別營養(yǎng)性多肽。通過吊桶離心來從各振蕩燒瓶收集細胞。丟棄上清液，并且將細胞在細胞濕重(wcw)濃度20％w/v下混懸于30mm咪唑、50mm磷酸鈉、0.5mnacl(ph7.5)中。接著在20,000psi下2次穿過m110-p微射流機(microfluidics,westwood,ma)，通過87um相互作用腔室來使混懸的細胞溶解。在15,000相對離心力(rcf)下使溶解的細胞離心120分鐘，接著傾析。丟棄細胞碎片，并且使上清液進行0.2um過濾。這些過濾的蛋白質(zhì)溶液接著通過固定金屬親和色譜法(imac)在explorer100fplc(gehealthcare,piscataway,nj)上純化。經(jīng)5ml(1.6cm直徑x2.5cm高度)imac瓊脂糖6速流柱(gehealthcare,piscataway,nj)純化營養(yǎng)性多肽。使用0.2niso4將imac樹脂(gehealthcare,imac瓊脂糖6速流)裝以鎳，并且用500mmnacl、200mm咪唑(ph7.5)洗滌，隨后于30mm咪唑、50mm磷酸鈉、0.5mnacl(ph7.5)中平衡。將50ml各蛋白質(zhì)裝載溶液施加于5mlimac柱上，并且再用平衡溶液洗滌以移除未結(jié)合雜質(zhì)。目標蛋白質(zhì)接著用15mlimac洗脫溶液(0.25m咪唑、0.5mnacl，ph7.5)洗脫。所有柱阻斷都在線性流速150cm/h下進行。通過透析來使各imac洗脫份進行緩沖液交換以進入中性ph配制溶液中。通過毛細管電泳和/或sds-page來分析純化的蛋白質(zhì)的濃度和純度。也如本文所述通過bradford和a280測量來測試濃度。表e9a說明通過imac在5ml規(guī)模下純化的營養(yǎng)性多肽的清單。表e9a.通過imac在5ml下純化的營養(yǎng)性多肽通過1l固定金屬親和色譜法(imac)純化。以20l發(fā)酵方式使大腸桿菌生長，其中如本文所述靶向表達具有his8標簽的個別營養(yǎng)性多肽。從發(fā)酵罐收集細胞，并且使用sharplesas-16p離心機離心以收集濕細胞團塊。隨后將細胞在細胞濕重(wcw)濃度20％w/v下再混懸于30mm咪唑、50mm磷酸鈉、0.5mnacl(ph7.5)中。接著利用在操作壓力12,500–15,000psi和流速1l/min下4次穿過nirosoavi均質(zhì)器(nirosoavi,parma,italy)來使細胞混懸物溶解。使用beckmanj2-hc吊桶離心機(beckman-coulter,brea,ca)在13,700xg下使溶解產(chǎn)物澄清1小時。丟棄細胞碎片，并且上清液經(jīng)sartoporeiixlg0.8/0.2um過濾器(sartoriusstedim,bohemia,ny)在30l/m2/h下過濾。使用填充在0.9l柱(9cm直徑x13.8cm高度)中的imac瓊脂糖6速流樹脂，通過imac純化過濾的溶解產(chǎn)物。如本文所述在線性流速300cm/h下平衡imac樹脂。一旦平衡，使過濾的溶解產(chǎn)物的整體在線性流速150cm/h下穿過管柱。裝載體積在6至10柱體積的范圍內(nèi)。在裝載之后，從管柱洗除未結(jié)合物質(zhì)，并且洗脫靶標蛋白質(zhì)。在室溫、4℃或冷凍下運送洗脫匯合物。這個決定取決于營養(yǎng)性多肽在洗脫溶液中的穩(wěn)定性。表e9b概述已通過imac在1l柱規(guī)模下純化的許多營養(yǎng)性多肽。表e9b.已通過imac在1l規(guī)模下純化的營養(yǎng)性多肽營養(yǎng)性多肽經(jīng)sartoporeiixlg0.8/0.2m過濾器過濾，并且直接裝載至超濾/透濾(uf/df)單元操作中。酌情選擇各營養(yǎng)性多肽的膜面積和標稱分子量截斷值。在交叉流量12l/m2/min和tmp目標25psi下使營養(yǎng)性多肽進行超濾。在hydrosart超濾盒(sartoriusstedim,bohemia,ny)上使營養(yǎng)性多肽濃縮約10倍，并且透濾7透析體積至營養(yǎng)性多肽特異性的配制緩沖液中。丟棄超濾滲透物。收集透濾的濃縮滯留物，經(jīng)0.22um膜過濾器過濾，并且冷凍在-80℃下。在一些情況下，使用labconco凍干器(labconco,kansascity,mo)使冷凍蛋白質(zhì)濃縮物凍干。使用karlfisher方法分析餅塊的殘余水含量。通過10l固定金屬親和色譜法(imac)純化。以250l發(fā)酵方式使大腸桿菌生長，其中如本文所述靶向表達具有his8標簽的個別營養(yǎng)性多肽。從250l發(fā)酵罐收集細胞，并且使用sharplesas-16p離心機離心以收集濕細胞團塊。隨后將細胞在wcw濃度20％w/v下再混懸于30mm咪唑、50mm磷酸鈉、0.5mnacl(ph7.5)中。接著利用在操作壓力12,500–15,000psi和流速1l/min下4次穿過nirosoavi均質(zhì)器(nirosoavi,parma,italy)來使細胞混懸物溶解。利用在15,000rpm下4次穿過在0.5l/min下操作的sharplesas-16p離心機來產(chǎn)生澄清溶解產(chǎn)物。丟棄細胞碎片，并且上清液經(jīng)一系列過濾器過濾。使澄清溶解產(chǎn)物依序穿過sartopuregf+0.65um、sartoguardpes1.2/0.2um和sartoporeiixlg0.8/0.2um過濾器(sartoriusstedim,bohemia,ny)。使用填充在8.5柱(20cm直徑x27.1cm高度)中的imac瓊脂糖6速流樹脂，通過imac純化過濾的溶解產(chǎn)物。如所述在線性流速150cm/h下平衡imac樹脂。一旦平衡，使過濾的溶解產(chǎn)物在線性流速150cm/h下穿過管柱。裝載體積在3.8至5.0cv的范圍內(nèi)。在裝載之后，以再次平衡來從管柱洗除未結(jié)合物質(zhì)。使在10limac規(guī)模下制造的營養(yǎng)性多肽經(jīng)受用2cv的10mm磷酸氫二鈉、300mmnacl；3cv的0.5％w/v脫氧膽酸鈉、50mm磷酸氫二鈉、300mmnacl；以及5cv的10mm磷酸氫二鈉、300mmnacl進行的另一組洗滌。在洗滌之后，如所述洗脫靶標多肽。在室溫下儲存洗脫匯合物。通過imac色譜法在10l柱規(guī)模下純化多種營養(yǎng)性多肽。表e9c概述seqid-00105和seqid-00338的純化。圖1提供對seqid-00105的純化的示例性sds-page分析。表e9c.通過imac色譜法在10l柱規(guī)模下純化營養(yǎng)性多肽seqid質(zhì)量純度00105179g98％00105265g98％00105131g91％00105147g92％00105164g94％00105148g95％00105229g100％00105228g100％00338137g92％00338196g100％00338169g100％在10l柱規(guī)模下進行imac純化之后，營養(yǎng)性多肽經(jīng)sartoporeiixlg0.8/0.2um過濾器過濾，并且直接裝載至超濾/透濾(uf/df)單元操作中。酌情選擇各營養(yǎng)性多肽的膜面積和標稱分子量截斷值。在交叉流量12l/m2/min和tmp目標25psi下使營養(yǎng)性多肽進行超濾。在hydrosart超濾盒(sartoriusstedim,bohemia,ny)上使營養(yǎng)性多肽濃縮約10倍，并且依序透濾至4透析體積的10％磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)(ph8.7)；隨后2透析體積的25mm乙二胺四乙酸四鈉；隨后7透析體積的10％pbs(ph8.7)中。進行向na4edta中的中間透濾以從imac樹脂螯合任何浸瀝的鎳(ii)。丟棄超濾滲透物；透濾的濃縮滯留物經(jīng)0.2um膜過濾器過濾，并且冷凍在-80℃下。以降低生物負荷為目標，用滅菌級過濾器過濾超濾匯合物。將營養(yǎng)性多肽過濾入用乙醇沖洗的玻璃托盤中。隨后將填充的玻璃托盤冷凍在-80℃下。接著使用labconco凍干裝置(labconco,kansascity,mo)使冷凍物質(zhì)凍干成干燥餅塊。隨時間監(jiān)測托盤中的蛋白質(zhì)的質(zhì)量，直至它到達平穩(wěn)狀態(tài)，此被視為完全干燥。用托盤的蓋板來密封干燥的蛋白質(zhì)餅塊，并且通過真空密封來過度包裝在塑料袋中。將整個包裝儲存在-80℃下。離子交換色譜法。選擇純化營養(yǎng)性多肽的適當方法牽涉于工藝開發(fā)速度、制造成本、最終純度和純化強力性。已通過各種色譜方法來分離營養(yǎng)性多肽。選擇以供使用的色譜模式取決于靶標營養(yǎng)性多肽的物理化學(xué)性質(zhì)。帶電荷的營養(yǎng)性多肽通過靜電相互作用結(jié)合離子交換色譜樹脂。在本申請中，我們已確定兩種篩選多肽的文庫以關(guān)于它們結(jié)合離子交換樹脂的能力來將它們分級排序的方法。一種方法是如本文所述，基于使用多肽的一級序列，跨越一定范圍的ph計算蛋白質(zhì)凈電荷的電子預(yù)測。第二方法是如本文所述的體外多路純化篩選。兩種方法已獨立于彼此被成功使用，并且它們已一起用于如本文所述的同一組具有支持性數(shù)據(jù)的168種營養(yǎng)性多肽。電子預(yù)測性離子交換純化分級方法基于根據(jù)一級序列在一定ph范圍下計算營養(yǎng)性多肽的凈電荷。營養(yǎng)性多肽的一級序列用于預(yù)測最可能從宿主細胞蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)成功分離那個營養(yǎng)性多肽的色譜模式。高度帶電荷的營養(yǎng)性多肽可能緊密結(jié)合離子交換色譜樹脂。具有一種主要電荷(正電荷或負電荷)的營養(yǎng)性多肽實現(xiàn)的結(jié)合最緊密。具有正電荷和負電荷的混合物的營養(yǎng)性多肽有可能緊密結(jié)合離子交換樹脂，但也可能的是那些電荷可彼此相反地起作用。類似地，在它的表面上具有交替正性片塊和負性片塊的營養(yǎng)性多肽可不與它的表面的占優(yōu)部分帶一種單一電荷的營養(yǎng)性多肽同樣緊密結(jié)合。類似地，具有強烈正性或負性末端、尾部、標簽或接頭序列的營養(yǎng)性多肽可有效顯示那個高度帶電荷的基團，從而允許極其緊密結(jié)合。一種或多種某些氨基酸，例如組氨酸、精氨酸和賴氨酸在多肽中盛行會在蛋白質(zhì)溶劑的ph低于一種或多種氨基酸的pka時，在那個多肽或其一部分中賦予正電荷。多肽電荷包括總蛋白質(zhì)電荷、凈電荷或多肽的一部分的電荷。在其中多肽或其部分帶正電荷的實施方案中，使用陽離子交換樹脂。一種或多種某些氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸在多肽中盛行會在蛋白質(zhì)溶劑的ph高于一種或多種氨基酸的pka時，在那個多肽或其一部分中賦予負電荷。多肽電荷包括總蛋白質(zhì)電荷、凈電荷或多肽的一部分的電荷。在其中多肽或其部分帶負電荷的實施方案中，使用陰離子交換樹脂。多肽的凈電荷隨蛋白質(zhì)溶劑的ph而變?？苫诙嚯牡囊患壭蛄杏嬎闳魏蝡h下的正電荷和負電荷的數(shù)目。在任一ph下正電荷和負電荷的總和產(chǎn)生計算凈電荷。多肽的等電點(pi)是它的計算凈電荷是0所處的ph。為進行比較，通過序列中的氨基酸的數(shù)目來使序列的凈電荷標準化，并且參數(shù)“每個氨基酸凈電荷”作為序列之間的新型比較參數(shù)而產(chǎn)生，其用于預(yù)測色譜性能。已通過計算各多肽在每一ph(1-14)下的每個氨基酸凈電荷來評估營養(yǎng)性多肽序列。另外，計算各多肽的pi。根據(jù)pi以及根據(jù)每個氨基酸凈電荷來將營養(yǎng)性多肽分級。預(yù)測具有低pi和跨越廣泛范圍的ph極其負性每個氨基酸凈電荷的多肽以高親和力結(jié)合陰離子交換色譜樹脂。預(yù)測具有高pi和跨越廣泛范圍的ph極其正性每個氨基酸凈電荷的多肽以高親和力結(jié)合陽離子交換色譜樹脂。在本文一些實施方案中，僅一部分多肽帶電荷(如末端、尾部、標簽或接頭中)，應(yīng)認識到pi和凈多肽電荷可為可變的，并且其它因素或經(jīng)驗測量可適用于預(yù)測這種多肽對色譜樹脂的結(jié)合親和力。圖2說明基于一級序列被預(yù)測結(jié)合陰離子或陽離子交換樹脂的示例性營養(yǎng)性多肽。預(yù)測具有pi<4.0和跨越廣泛范圍的ph負性每個氨基酸凈電荷的營養(yǎng)性多肽以高親和力結(jié)合陰離子交換樹脂((1)seqid-00105，(2)seqid-00008，(3)seqid-00009，(4)seqid-00475)。預(yù)測具有pi>10.0和跨越廣泛范圍的ph正性每個氨基酸凈電荷的營養(yǎng)性多肽以高親和力結(jié)合陽離子交換樹脂((5)seqid-00472，(6)seqid-00640，(7)seqid-00019)。本文呈現(xiàn)的一級序列分析指示seqid-00105和seqid-00009可能以高親和力結(jié)合陰離子交換色譜樹脂，并且seqid-00640可能以高親和力結(jié)合陽離子交換色譜樹脂。這些預(yù)測被測試和證明是真實的，如在微生物細胞培養(yǎng)之后進行的以下4個多肽純化實例中所證明。在第一實例中，使用陰離子交換色譜法，從溶解的大腸桿菌細胞直接純化seqid-00009以獲得99％純度。在第二實例中，通過陰離子交換色譜法來從枯草芽孢桿菌上清液分離seqid-00105。在第三實例中，在大腸桿菌中細胞內(nèi)表達的seqid-00105在它初始已通過imac色譜法純化之后使用陰離子交換色譜法精制以獲得100％純度。在第四實例中，通過陽離子交換色譜法來從枯草芽孢桿菌上清液分離seqid-00640。如本文所述，在大腸桿菌中細胞內(nèi)表達seqid-00009。將細胞混懸于溶液中并破裂。測試3種溶液(0.1mna2co3(ph11.4)、0.1mtrishcl(ph4.1)和0.1m磷酸鉀(ph7.0))。通過離心來使這些溶解化溶液澄清，并且與陰離子交換樹脂混合以進行結(jié)合。測試2種樹脂(來自emd的emdtmaehicap(m)和來自lifetechnologies的d50μm)。以批式模式執(zhí)行這6種結(jié)合條件，并且樹脂用適當溶解緩沖液洗滌以移除任何未結(jié)合蛋白質(zhì)。接著將最大結(jié)合的潮濕樹脂轉(zhuǎn)移至較小滴柱中。各滴柱接著以多達6次以遞增nacl濃度進行的連續(xù)洗滌來洗脫(各nacl洗滌溶液用適當溶解緩沖液加以緩沖)。seqid-00009被洗脫在這些洗脫份中，收集，并且通過芯片電泳來分析，如本文所述。seqid-00009被鑒定為處于預(yù)期分子量下的洗脫帶。在每種情況下，從滴柱洗脫的seqid-00009的純度都高于裝載純度。這個觀察結(jié)果指示如所預(yù)測，seqid-00009結(jié)合陰離子交換樹脂，并且實現(xiàn)了純化。達到的最大純度是99％。在每種情況下，seqid-00009都在待從樹脂洗脫的上一次蛋白質(zhì)之中，從而指示在一定ph范圍下seqid-00009對兩種樹脂的結(jié)合親和力大體上高于來自大腸桿菌的任何宿主細胞蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力。如本文所述進行枯草芽孢桿菌的微生物細胞培養(yǎng)，從而將seqid-00105表達和分泌至發(fā)酵培養(yǎng)基中。通過離心來移除細胞，并且通過膜過濾來使上清液進一步澄清。通過超濾來濃縮澄清上清液以降低在陰離子交換柱上的裝載時間，并且將溶液交換成在ph6.0下緩沖的低鹽溶液。使這個溶液穿過含有來自lifetechnologies的xq強陰離子交換樹脂的色譜柱(1cm直徑，20cm高度)。用20mmbistris(ph6.3)從樹脂沖洗未結(jié)合蛋白質(zhì)。接著使用30柱體積梯度將結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫至400mmnacl、20mmbistris(ph6.3)中。柱流出物被收集在連續(xù)洗脫份中，并且通過芯片電泳來分析，如本文所述。seqid-00105被鑒定為處于預(yù)期分子量下的洗脫帶。在一個洗脫份中達到的最大純度是100％。如本文所述，在大腸桿菌中細胞內(nèi)表達seqid-00105。使細胞破裂，并且根據(jù)本文所述的程序，通過imac色譜法純化seqid-00105。使用陰離子交換色譜法進一步精制imac洗脫匯合物以獲得100％純度。濃縮imac洗脫匯合物，接著稀釋至50mmtris(ph8.0)中。接著使這個溶液穿過填充有陰離子交換樹脂：來自emd的emdtmaehicap(m)的管柱(1.6cm直徑，20cm高度)。結(jié)合的蛋白質(zhì)用平衡溶液沖洗，接著用350mmnacl、50mmtris(ph8.0)洗脫。重復(fù)這個程序多次，并且所有樣品都通過芯片電泳來分析，如本文所述。洗脫樣品的純度在79％至99％的范圍內(nèi)。如本文所述進行枯草芽孢桿菌的微生物細胞培養(yǎng)，從而將seqid-00640表達和分泌至發(fā)酵培養(yǎng)基中。通過離心來移除細胞，并且通過膜過濾來使上清液進一步澄清。澄清上清液用去離子水1:2稀釋，并且用1m乙酸滴定至ph5。使所得溶液進行膜過濾，隨后裝載于填充有來自lifetechnologies的xs強陽離子交換樹脂的陽離子交換柱(1.2cm直徑10cm高度)上。結(jié)合的樹脂用50mm乙酸鹽、50mmnacl(ph5.0)溶液沖洗。蛋白質(zhì)接著用20cv梯度洗脫至1.05mnacl(ph5.0)中。收集洗脫份，并且通過sds-page、coomassie藍染色來分析。峰樣品顯示100％純度，并且隨后無雜質(zhì)被洗脫于梯度中，從而指示seqid-00640多肽比任何宿主細胞蛋白質(zhì)以更大親和力結(jié)合于陽離子交換樹脂。通過沉淀來純化。蛋白質(zhì)沉淀是一種用于純化多肽的熟知方法(scopesr.1987.proteinpurification:principlesandpractice.newyork:springer)。許多多肽隨著鹽濃度增加而沉淀，這是一種稱為鹽析的現(xiàn)象。各種鹽類型已根據(jù)它們使蛋白質(zhì)鹽析的不同能力以hofmeister次序分級和組織(f.hofmeisterarch.exp.pathol.pharmacol.24,(1888)247-260.)。蛋白質(zhì)基于它們的物理化學(xué)性質(zhì)也具有歸因于高鹽濃度的沉淀的不同傾向，然而，尚未建立用以關(guān)于這個特征來將蛋白質(zhì)分級的通用量度。使用這種分級量度以關(guān)于營養(yǎng)性多肽被純化的能力選擇營養(yǎng)性多肽牽涉于工藝開發(fā)速度、制造成本、最終純度和純化強力性。在通過多肽沉淀進行純化的大多數(shù)工業(yè)應(yīng)用中，選擇性沉淀目標多肽，并且接著將雜質(zhì)沖洗離開固體沉淀。在某些實施方案中，多肽在高鹽水平下不沉淀，而是通過使雜質(zhì)沉淀來實現(xiàn)純化。在本申請中，我們已確定兩種篩選多肽的文庫以關(guān)于它們在苛刻沉淀條件下保持可溶的能力來將它們分級排序的方法。一種方法是如本文所述，基于使用多肽的一級序列，跨越一定范圍的ph計算蛋白質(zhì)總電荷的電子預(yù)測。第二方法是如本文所述的體外多路純化篩選。兩種方法已獨立于彼此被成功使用，并且它們已一起用于如本文所述的同一組具有支持性數(shù)據(jù)的168種營養(yǎng)性多肽。多肽的溶解度與表面電荷的豐度直接相關(guān)(jimkling,highlyconcentratedproteinformulations:findingsolutionsforthenextgenerationofparenteralbiologics,bioprocessinternational,2014.)。已確定表面電荷可對多肽賦予物理特征(lawrence,m.s.,phillips,k.j.和liu,d.r.(2007).superchargingproteinscanimpartunusualresilience.journaloftheamericanchemicalsociety,129(33),10110–2.doi:10.1021/ja071641y)。電子預(yù)測性溶解度分級方法基于根據(jù)一級序列在一定ph范圍下計算營養(yǎng)性多肽的電荷總數(shù)。一種或多種某些氨基酸，例如組氨酸、精氨酸和賴氨酸在多肽中盛行會在蛋白質(zhì)溶劑的ph低于一種或多種氨基酸的pka時，在那個多肽或其一部分中賦予正電荷。一種或多種某些氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸在多肽中盛行會在蛋白質(zhì)溶劑的ph高于一種或多種氨基酸的pka時，在那個多肽或其一部分中賦予負電荷。多肽的電荷總數(shù)隨蛋白質(zhì)溶劑的ph而變。如本文所述，可基于多肽的一級序列計算任何ph下的正電荷和負電荷的數(shù)目。在任一ph下正電荷和負電荷的總和產(chǎn)生計算凈電荷。多肽的等電點(pi)是它的計算凈電荷是0所處的ph。為在營養(yǎng)性多肽之間進行比較，將正電荷的總數(shù)添加至負電荷的總數(shù)(絕對值)中，并且通過序列中的氨基酸的數(shù)目來使那個總電荷標準化，并且參數(shù)“每個氨基酸總電荷”作為序列之間的新型比較參數(shù)而產(chǎn)生，其用于預(yù)測多肽的抗沉淀性。多肽的抗性越大，它可通過使雜質(zhì)沉淀析出來在高程度上被純化的可能性越高。不同于預(yù)測色譜性能，溶解度不受電荷的極性影響。盡管常常真實的是多肽在序列的pi下經(jīng)歷它的最低溶解度，但一些多肽具有高總電荷，并且在它們的pi下仍然極其可溶，如本文所示。已通過計算各多肽在一定ph范圍(1-14)下的每個氨基酸總電荷來評估營養(yǎng)性多肽序列。根據(jù)每個氨基酸總電荷來將營養(yǎng)性多肽分級。根據(jù)這個分級，具有低pi和跨越廣泛范圍的ph極其負性每個氨基酸凈電荷的多肽和具有高pi和跨越廣泛范圍的ph極其正性每個氨基酸凈電荷的多肽都被預(yù)期具有同等評分。具有許多兩種電荷的多肽評分最佳。圖3說明基于一級序列被預(yù)測具有極高溶解度的示例性營養(yǎng)性多肽。這組包括具有低pi(<4)和跨越廣泛范圍極其負性每個氨基酸凈電荷的多肽((1)seqid–00475，(2)seqid-00009)。這組包括具有高pi(>10)和跨越廣泛范圍的ph極其正性每個氨基酸凈電荷的多肽((4)seqid-00433，(5)seqid-00472)。這組包括具有中性更大的pi的多肽((3)seqid-00478)。此處顯示的許多多肽甚至在諸如<4和>12的極端ph值下也顯示高電荷。預(yù)期整個組跨越廣泛范圍的ph極其可溶，并且抵抗沉淀。在這個實證中，通過離心來從振蕩燒瓶發(fā)酵收集大腸桿菌細胞，并且將全部細胞分配至管中(每管1克細胞)。向各管中，添加4ml溶解溶液，并且通過在75安培下超聲處理30秒來溶解細胞。溶解溶液包括：水；8m尿素，0.1mtris，0.1mnacl；0.1m乙酸鹽，10％gly，0.1％吐溫-80，0.3marg，0.3mnacl，10mmedta；10mm咪唑(ph5.0)；0.1m乙酸鹽，10％gly，0.1％吐溫-80，0.3marg，0.3mnacl，10mmedta；10mm咪唑(ph7.0)；100nacl，100hepes，10咪唑(ph7.5)；500nacl，100hepes，10咪唑(ph7.5)；100mmphos；150mmnacl；10mm咪唑(ph7.5)；0.1mnacl，0.1mhepes，10mm咪唑，50mmcacl2(ph7.5)；0.1mhepes，3.5m硫酸銨(ph7.5)；0.1mhepes，2m硫酸銨(ph7.5)；0.1mtris；0.1mtris，0.5mnacl；150mmnacl，10mm乙酸鹽，15mm咪唑(ph6.04)；和500mmnacl，100mm乙酸鹽，15mm咪唑(ph6.04)。通過離心和0.2um過濾來使溶解產(chǎn)物澄清。如本文所述，通過sds-page(藍色染色)來分析澄清上清液。seqid-00009顯示在這些條件中的各個下都可溶。除一種條件之外，大腸桿菌宿主細胞蛋白質(zhì)通常也顯示在這些條件下可溶。在3.5m硫酸銨存在下，大多數(shù)宿主細胞蛋白質(zhì)被有效沉淀，從而在過程的細胞收集階段之后產(chǎn)生85％純化的seqid-00009。這個結(jié)果指示seqid-00009比大多數(shù)大腸桿菌宿主細胞蛋白質(zhì)更可溶，并且沉淀可被用作低成本分離方法的一部分。這與seqid-00009的高總電荷相關(guān)，并且支持預(yù)測是準確的。此外，預(yù)測電荷大于seqid-00009的多肽將甚至更可溶，其可超過seqid-00009具有多肽產(chǎn)率較高的益處。在隨后實驗中，以單級硫酸銨沉淀使seqid-00009純化以獲得99％純度。在這個實證中，通過離心來從振蕩燒瓶發(fā)酵收集大腸桿菌細胞，并且將全部細胞混懸于0.1m碳酸鈉(ph10)中(1克細胞于4ml溶液中)。通過超聲處理(80安培持續(xù)2分鐘)來溶解細胞。通過離心和0.2μm膜過濾來使溶解產(chǎn)物澄清。將澄清上清液分成一系列3ml部分，向其中添加4m硫酸銨的儲備溶液(ph9.8)。添加可變量的儲備溶液以實現(xiàn)一定范圍的硫酸銨濃度。在室溫下混合樣品10分鐘，并且通過離心和0.2um膜過濾來澄清化。如本文所述，通過sds-page(藍色染色)來分析澄清上清液。圖4顯示seqid-00009的純度隨硫酸銨濃度而變。多路純化：離子交換色譜法。在一些情況下，在多路篩選實驗平臺中測試整個蛋白質(zhì)文庫。在多路表達系統(tǒng)中轉(zhuǎn)染和表達168種營養(yǎng)性多肽，其中單一生長條件用于在單一容器中產(chǎn)生各多肽。這個多路表達系統(tǒng)允許關(guān)于廣泛范圍的可制造性參數(shù)來同時測試任一組多肽序列，所述參數(shù)各自可用于分級排序所考查的這組多肽。一組可制造性參數(shù)包括表達水平、多肽溶解度、多肽通過色譜法被純化的能力、抵抗熱變性的能力、多肽的消化能力、多肽通過抵抗苛刻處理被純化的能力。關(guān)于在大腸桿菌中的細胞內(nèi)表達來測試這組168種營養(yǎng)性多肽?？扇苄员磉_的多肽作為整體被預(yù)處理，接著經(jīng)受一系列純化條件以使這組可以它們的通過多種方法進行純化的容易性加以分級排序。如本文所述，基于一級序列分析(具體來說每個氨基酸凈電荷)，預(yù)期將從各表達系統(tǒng)鑒定相同子組的蛋白質(zhì)來聯(lián)合特定色譜模式。對于大腸桿菌多路純化，這組營養(yǎng)性多肽序列被his8標簽化。如本文所述培養(yǎng)細胞，破裂，并且如本文所述使溶液澄清。這個產(chǎn)生過程產(chǎn)生含有來自這組的表達并可溶的所有多肽的溶液。使那組可溶性多肽穿過5mlimac柱并洗脫，如本文所述。這個imac純化通過移除大多數(shù)大腸桿菌宿主細胞蛋白質(zhì)來將可溶性表達的營養(yǎng)性多肽作為一組有效分離。濃縮洗脫份，并且進行緩沖液交換以進入接近中性ph加以緩沖的低鹽溶液中，隨后測試各種純化方法。測試的方法包括陰離子交換色譜法、陽離子交換色譜法和負性沉淀，其中雜質(zhì)沉淀，并且保持可溶的多肽分級最高。在這個情況下，雜質(zhì)已被移除，因此多肽在它們自身之間被分級排序。另外，通過加熱來測試這組蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，其中在加熱之后保持可溶的多肽比沉淀的那些更加熱穩(wěn)定。多肽的這個混合物關(guān)于它們結(jié)合陰離子交換和陽離子交換色譜樹脂的能力加以分級排序。測試4種色譜樹脂。2種陰離子交換樹脂：來自gelifesciences的captodeae和來自emd的q樹脂。2種陽離子交換樹脂：來自lifetechnologies的xs強陽離子交換樹脂和來自emd的s樹脂。以如下8種不同緩沖條件測試各樹脂。用于陰離子交換的緩沖液：水(無緩沖劑)，ph7；15mmna2hpo4，ph8.7；30mmna2hpo4，ph9.0；15mmtris堿，ph9.6；30mmtris堿，ph10.0；30mmna2co3，ph11.2；25mm精氨酸，ph10.1。用于陽離子交換的緩沖液：水(無緩沖劑)，ph7；15mmkh2po4，ph4.2；30mmkh2po4，ph4.5；15mmtris酸，ph4.9；30mmtris酸，ph4.7；15mmmes酸，ph3.9；25mmmes酸，ph4.1。將樹脂分配至96孔過濾板(每孔20ul樹脂)中，并且各自平衡三次。使蛋白質(zhì)組(proteinset)與平衡緩沖液混合，并且使其結(jié)合樹脂。通過使液體離心穿過過濾板以收集在以下96孔板中來使溶液中的未結(jié)合蛋白質(zhì)與樹脂分離。以平衡緩沖液洗滌來將剩余未結(jié)合蛋白質(zhì)從樹脂進一步?jīng)_洗去除。接著依序用三級遞增鹽濃度(于以上一組適當緩沖液中緩沖的50、250、1500mmnacl)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。松散結(jié)合的蛋白質(zhì)首先被移除，并且在最終洗脫條件下移除的蛋白質(zhì)極其緊密結(jié)合于樹脂。因此，在大腸桿菌中表達168種蛋白質(zhì)的文庫，并且關(guān)于它們對陰離子交換和陽離子交換色譜樹脂的結(jié)合親和力加以分級排序。本文所述的實驗產(chǎn)生160個樣品(4種樹脂，8種緩沖液，5種收集物)。5個收集階段包括：流過部分，洗滌部分，50mmnacl洗脫，250mmnacl洗脫和1500mmnacl洗脫。所有160個樣品都通過280nm下的紫外-可見吸光度，通過bradford總蛋白質(zhì)測定，通過芯片電泳來分析，并且通過lc/ms/ms來分析所選樣品。本文描述所有分析測定。測定證明一些蛋白質(zhì)流過樹脂，并且未被結(jié)合。在大多數(shù)情況下，洗滌部分不洗脫大量蛋白質(zhì)，從而指示待洗脫的任何其它蛋白質(zhì)實際上結(jié)合于樹脂。隨著nacl濃度增加，所移除的總蛋白質(zhì)也增加，從而證明在幾乎每種條件下都成功結(jié)合和洗脫。在1500mmnacl洗脫條件下通過電泳檢測的蛋白質(zhì)在250mmnacl洗滌條件下保持結(jié)合，從而指示強烈結(jié)合。所選條件被選擇用于lc/ms/ms分析。用在30mmtris堿緩沖條件下來自陰離子交換色譜樹脂(captodeae)的1500mmnacl洗脫樣品進行l(wèi)c/ms/ms分析。相對于文庫中最初表達的所有168種營養(yǎng)性多肽的序列搜索lc/ms/ms結(jié)果。被鑒定為在這個條件下對這個陰離子交換樹脂具有高結(jié)合親和力的8種獨特多肽是seqid-00341、seqid-00346、seqid-00497、seqid-00525、seqid-00555、seqid-00605、seqid-00606、seqid-00610。對于這個組中的各多肽序列，基于一級序列跨越測試的ph范圍計算每個氨基酸凈電荷。如本文所述，預(yù)期緊密結(jié)合陰離子交換樹脂的多肽跨越ph范圍具有低于0的每個氨基酸凈電荷，并且除單一多肽之外，這被證明是真實的。預(yù)期任何例外都歸因于以下事實：跨越序列的長度存在電荷異質(zhì)性，并且如所述，每個氨基酸凈電荷并非始終體現(xiàn)那個電荷異質(zhì)性。這個多路篩選基于一組多肽結(jié)合陰離子交換樹脂的親和力來從較大文庫鑒定它們，并且這個結(jié)果可如本文所述基于一級序列分析加以預(yù)測。用在15mmtris酸緩沖條件下來自陽離子交換色譜樹脂(porosxs)的1500mmnacl洗脫樣品進行l(wèi)c/ms/ms分析。相對于文庫中最初表達的所有168種營養(yǎng)性多肽的序列搜索lc/ms/ms結(jié)果。被鑒定為在這個條件下對這個陽離子交換樹脂具有高結(jié)合親和力的8種獨特多肽是seqid-00302、seqid-495、seqid-00522、seqid-00537、seqid-00546、seqid-00547、seqid-00560、seqid-00598。對于這個組中的各多肽序列，基于一級序列跨越測試的ph范圍計算每個氨基酸凈電荷。如本文所述，預(yù)期緊密結(jié)合陽離子交換樹脂的多肽跨越ph范圍具有高于0的每個氨基酸凈電荷，并且除少數(shù)之外，這被證明是真實的。預(yù)期任何例外都歸因于以下事實：跨越序列的長度存在電荷異質(zhì)性，并且如所述，每個氨基酸凈電荷并非始終體現(xiàn)那個電荷異質(zhì)性。這個多路篩選基于一組多肽結(jié)合陽離子交換樹脂的親和力來從較大文庫鑒定它們，并且這個結(jié)果可如本文所述基于一級序列分析加以預(yù)測。在多路純化的枯草芽孢桿菌實例中，在無任何類型的純化標簽下表達這組多肽序列。如本文所述在燒瓶中培養(yǎng)細胞，并且所述細胞將多肽表達和分泌至生長培養(yǎng)基中。通過離心來移除細胞，并且通過膜過濾來使溶液進一步澄清，如本文所述。這個產(chǎn)生過程產(chǎn)生含有來自這組的表達并可溶性分泌的所有多肽的溶液。濃縮那組可溶性多肽，并且進行緩沖液交換以進入磷酸鹽溶液(ph7.0)中，隨后測試各種純化方法。測試的方法包括陰離子交換色譜法、陽離子交換色譜法和負性沉淀，其中雜質(zhì)沉淀，并且保持可溶的多肽分級最高。在這些多路純化研究中，多肽被從彼此和從宿主細胞蛋白質(zhì)純化離開以在它們自身之間被分級排序。多肽的這個混合物關(guān)于它們結(jié)合陰離子交換和陽離子交換色譜樹脂的能力加以分級排序。測試4種色譜樹脂。2種陰離子交換樹脂：來自gelifesciences的captodeae和來自emd的q樹脂。2種陽離子交換樹脂：來自lifetechnologies的xs強陽離子交換樹脂和來自emd的s樹脂。以8種不同緩沖條件測試各樹脂。用于陰離子交換的緩沖液：18mmbis-tris，ph6.5；13mmhepes，ph7.0；18mmhepes，ph7.5；16mmtris，ph8.0；32mmtris，ph8.5；88mmtris，ph9.0；13mmna2co3，ph9.5；20mmna2co3，ph10.0。用于陽離子交換的緩沖液：19mm檸檬酸鹽，ph3.0；13mm檸檬酸鹽，ph3.5；49mm乙酸鹽，ph4.0；22mm乙酸鹽，ph4.5；14mm乙酸鹽，ph5.0；10mm乙酸鹽，ph5.5；24mmmes，ph6.0；15mmmes，ph6.5。將樹脂分配至96孔過濾板(每孔50μl樹脂)中，并且各自平衡三次。使蛋白質(zhì)組與平衡緩沖液混合，并且使其結(jié)合樹脂。通過使液體離心穿過過濾板以收集在以下96孔板中來使溶液中的未結(jié)合蛋白質(zhì)與樹脂分離。以平衡緩沖液進行兩個洗滌循環(huán)來將剩余未結(jié)合蛋白質(zhì)從樹脂進一步?jīng)_洗去除。接著依序用遞增鹽濃度(250、500、1000mm、2000mmnacl)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。各鹽溶液在適當平衡緩沖液中緩沖，例外之處是2000mmnacl溶液，其用mes在ph6.0下(用于陰離子交換樹脂)以及用tris在ph8.0下(用于陽離子交換樹脂)緩沖。松散結(jié)合的蛋白質(zhì)首先被移除，并且在最終洗脫條件下移除的蛋白質(zhì)極其緊密結(jié)合于樹脂。因此，在枯草芽孢桿菌中表達蛋白質(zhì)的文庫，并且關(guān)于它們對陰離子交換和陽離子交換色譜樹脂的結(jié)合親和力加以分級排序。本文所述的實驗產(chǎn)生192個樣品(4種樹脂，8種緩沖液，6種收集物)。6個收集階段包括：流過部分，洗滌部分，250mmnacl洗脫，500mmnacl洗脫，1000mmnacl洗脫和2000mmnacl洗脫。所有192個樣品都通過芯片電泳來分析。通過sds-page來分析所選樣品。通過lc/ms/ms來分析所選樣品。本文描述所有分析測定。通過芯片電泳、sds-page和lc/ms/ms的組合來對強烈結(jié)合的蛋白質(zhì)進行鑒定。sds-page結(jié)果證明大多數(shù)多肽不結(jié)合這些樹脂，實際上它們見于流過部分中。因此，結(jié)合樹脂的多肽在它們能夠從大多數(shù)其它多肽被純化方面是獨特的。各種洗脫份中的這組多肽已基于它們的性質(zhì)以某一純化方法從較大組分離，所述純化方法牽涉制造、成本、開發(fā)時間和這些多肽的最終純度。此外，在結(jié)合樹脂的多肽之中，這些多肽可根據(jù)它們在以遞增濃度的nacl達成的嚴格洗滌條件下保持結(jié)合于樹脂的能力來分級排序。見于2000mmnacl樣品中的那些多肽已能夠在1000mmnacl洗滌條件下保持結(jié)合。廣泛接受的是可在高于500mmnacl下保持結(jié)合于離子交換樹脂的任何多肽都被視為對那個樹脂具有極高親和力。在兩種陽離子交換樹脂之間，條帶樣式是類似的，從而支持提出的機理。同樣，在兩種陰離子交換樹脂之間，條帶樣式是類似的，并且代表與通過陽離子交換鑒定的樣品組不同的樣品組。為分級排序鑒定于任何子組中的個別多肽，利用lc/ms/ms。作為示例性數(shù)據(jù)集，lc/ms/ms結(jié)果將以下多肽鑒定為在ph7.5下結(jié)合captodeae陰離子交換樹脂：p39645、p37869、p80698、p80868、p21880、p80239、p50849、p12425、o34669、p39138、p37871、p19669、p29727、p80643、o34981、p80879、p54716、p37477。作為示例性數(shù)據(jù)集，lc/ms/ms結(jié)果將以下多肽鑒定為在ph4.0下結(jié)合porosxs陽離子交換樹脂：o34669、p19405、o31803、o05411、o31973、o31643、p80239、p26901、p08821、p80240、p49814、o34310、p0ci78、o31925、p71014、p42111。基于鑒定為具有高結(jié)合親和力的這些多肽的一級序列來分析它們的物理化學(xué)性質(zhì)?；谝患壭蛄锌缭綔y試的ph范圍計算每個氨基酸凈電荷。如本文所述，預(yù)期緊密結(jié)合陰離子交換樹脂的多肽跨越ph范圍具有低于0的每個氨基酸凈電荷，并且這通常被證明是真實的。如本文所述，預(yù)期緊密結(jié)合陽離子交換樹脂的多肽跨越ph范圍具有高于0的每個氨基酸凈電荷，并且這通常被證明是真實的。預(yù)期任何例外都歸因于以下事實：跨越序列的長度存在電荷異質(zhì)性，并且如所述，每個氨基酸凈電荷并非始終體現(xiàn)那個電荷異質(zhì)性。這個多路篩選基于一組多肽結(jié)合陰離子交換樹脂的親和力來從較大文庫鑒定它們，并且這個結(jié)果可如本文所述基于一級序列分析加以預(yù)測。在多路純化的枯草芽孢桿菌實例中，在無任何類型的純化標簽下表達這組168種營養(yǎng)性多肽序列。如本文所述在燒瓶中培養(yǎng)細胞，并且所述細胞將多肽表達和分泌至生長培養(yǎng)基中。測試的方法包括負性絮凝/沉淀，其中雜質(zhì)沉淀，并且保持可溶的多肽分級最高。在這些多路純化研究中，雜質(zhì)以可溶性雜質(zhì)(例如宿主細胞蛋白質(zhì)、dna、磷脂和產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)，諸如亞型或聚集物質(zhì))、不溶性雜質(zhì)、細胞或細胞碎片(例如膜片段)的形式存在。在離心移除不溶性雜質(zhì)、細胞和細胞碎片以及通過膜過濾來進一步澄清化之前和之后進行負性沉淀。細胞混懸液(在離心和膜過濾之前)和澄清上清液(在離心和膜過濾之后)中的這組可溶性表達和分泌的多肽關(guān)于它們與絮凝劑締合的能力加以分級排序。此外，絮凝劑關(guān)于它們與雜質(zhì)締合的能力加以分級排序。在兩種不同濃度下測試48種絮凝劑，如下所示：碳酸氫銨(100mm，200mm)；氯化錳(100mm，200mm)；硫酸鎳(100mm，200mm)；檸檬酸鈉(100mm，200mm)；乙酸鋰(100mm，200mm)；丙二醇(10％v/v，20％v/v)；硝酸銨(100mm，200mm)；氯化鉀(100mm，200mm)；硫酸鈉(100mm，200mm)；鉬酸鈉(100mm，200mm)；乙酸(100mm，200mm)；殼聚糖mmw(0.1％w/v，0.2％w/v)；硫酸銨(100mm，200mm)；氯化鈉(0.5m，1.0m)；硫酸鋅(100mm，200mm)；硝酸鈉(100mm，200mm)；檸檬酸(100mm，200mm)；鹽酸胍(0.6m，1.2m)；氯化銨(100mm，200mm)；氯化鋅(100mm，200mm)；碳酸鉀(100mm，200mm)；磷酸鈉(100mm，200mm)；鹽酸(100mm，200mm)；peg1000(5％w/v，10％w/v)；氯化鈣(100mm，200mm)；檸檬酸鐵(100mm，200mm)；硝酸鉀(100mm，200mm)；丙酸鈉(100mm，200mm)；氫氧化鉀(100mm，200mm)；peg4000(5％w/v，10％w/v)；氯化膽堿(100mm，200mm)；硫酸銅(100mm，200mm)；磷酸鉀(100mm，200mm)；丁二酸鈉(100mm，200mm)；氫氧化鈉(100mm，200mm)；tritonx-100(0.5％w/v，1.0％w/v)；氯化鐵(100mm，200mm)；硫酸鐵(100mm，200mm)；脫氧膽酸(0.5％w/v，1.0％w/v)；硫氰酸鈉(100mm，200mm)；乙醇(10％v/v，20％v/v)；吐溫80(0.5％w/v，1.0％w/v)；氯化鎂(100mm，200mm)；硫酸鎂(100mm，200mm)；碳酸鈉(100mm，200mm)；硫代硫酸鈉(100mm，200mm)；異丙醇(10％v/v，20％v/v)；尿素(0.8m，1.6m)。將細胞混懸液(在離心和膜過濾之前)和澄清上清液(在離心和膜過濾之后)分配至96孔過濾板中(每孔300μl(用于低絮凝劑濃度)和267μl(用于高絮凝劑濃度))。通過分別添加33μl或67μl的濃縮絮凝劑溶液來將這些裝載物稀釋0.1倍或0.2倍。在室溫下混合所得溶液1小時。在混合之后，通過使液體離心穿過過濾板以收集在以下96孔板中來使剩余可溶性物質(zhì)與不溶性物質(zhì)分離。所有192個樣品都通過芯片電泳來分析。通過sds-page來分析所選樣品。通過lc/ms/ms來分析所選樣品。本文描述所有分析測定。sds-page結(jié)果證明一些條件使許多多肽有效沉淀，從而指示在那些條件下可溶性多肽相當可溶，并且可在這些條件下被分離。在各種沉淀條件下可溶的多肽基于它們的性質(zhì)以某一純化方法從較大組分離，所述純化方法牽涉制造、成本、開發(fā)時間和這些多肽的最終純度。根據(jù)本文所述的機理，一些多肽由于它們的高電荷而跨越一定范圍的條件是廣泛可溶的。為分級排序鑒定于任何子組中的個別多肽，利用lc/ms/ms。作為示例性數(shù)據(jù)集，lc/ms/ms結(jié)果證明以下多肽由于它們在100mm乙酸(ph5.18)中持續(xù)可溶而被分離：o34669、p54423、p21879、p10475、p28598、o31803、p40767、p17889、o34918、q08352、p24327、p37871、o31973、p81101、p50849、p26901、p80700、o34385、p70960、p42111、p21880、p27876、p80868、p54716、o34313、o07603、o05411、p54531、o05497、p12425、o07921、p19405、q06797、p02394、p24141、p09339、p37965、p07343、p37809、p0ci78、p39824、p49814、p39632、p39773、p51777、p21883、o06989、p25152、p70961、o07593、o34310、p80860、p37437、p80698、p13243、p38494、p39645、p39148、o31398、p08821、p08877、o05268、p04957、p28366、p31103、p94421、p14949、p80864、p37869、p80240、p80859、o06993、o34666、o34714、p37546、q9kwu4、o31605、p16616、p80239、o34788、p71014、p37571、p09124、p42971、o31925、p39793、p17865、p16263、p18429、p05653、p26908、p33166、o34499、p08750、p54602、q45071、p12047、p42919、o34334、o34358、p39120、p39126、p00691、p14192、p22250、p37870、p39116、p54484、p54488、p54547、p56849、o31579、o34629、p30949、p54422、p54530、p54542、p96739。作為示例性數(shù)據(jù)集，lc/ms/ms結(jié)果證明以下多肽由于它們在100mm碳酸鉀(ph9.66)中持續(xù)可溶而被分離：o34669、p54423、p21879、p24327、p40767、p17889、o31973、p10475、p28598、p80700、p37871、p80868、o31803、p81101、p70960、p27876、p19405、p28366、p71014、p26901、o34385、p21880、q06797、p24141、p07343、p80698、p13243、p42971、p39793、o31643、p39071、o32210、p21468、p42199、p54531、p37965、p37809、p21883、p38494、p39148、p08877、p09124、p17865、p16263、p54602、p46906、o34918、q08352、p42111、o05411、o05497、o07921、p02394、p09339、p49814、p39632、p37437、p39645、p08821、p04957、p31103、q9kwu4、p80239、o34788、p18429、p05653、p26908、o34499、p08750、p12047、p37870、p54547、q06796、q45477、p25144、p46898、p40871、o31501、p21464、p21465、p40409。作為示例性數(shù)據(jù)集，lc/ms/ms結(jié)果證明以下多肽由于它們在100mm氯化鈣(ph7.50)中持續(xù)可溶而被分離：o34669、p54423、p21879、o34918、o31803、p10475、p28598、p24327、p40767、p80700、p27876、p37871、o34385、p13243、q08352、o07921、p17889、o31973、p80868、p26901、p24141、p80698、p02394、q06797、p39148、p19405、p54531、p37965、p09339、p39645、o34788、p37571、o07909、p70960、p21880、p42971、p37809、p80239、q45477、p94421、p81101、p07343、p39793、p39071、p38494、p17865、p42111、p12425、p39773、o06989、p80864、o05411、o05497、p25144、p0ci78、p39824、p25152、p70961、o31398、o05268、p37869、p80859、o32150、p39138、o31643、p21468、p42199、p21883、p09124、p49814、p05653、q06796、o34313、p51777、o34310、o06993、o34666、o31925、p33166、p39634、p37808、p39779、p28366、p08877、p16263、p39632、p08821、p04957、o34499、p08750、p46898、p50849、p54716、p80860、p14949、p80240、q45071、o34334、o34358、p39120、p39126、p20278、p53001、p54375、o06006、o06988、o34667、o34981、p08164、p19669、p30950、p37487、p45694、p81102、p71014、p54602、p46906、p31103、p18429、p26908、p12047、p40871、o07603、o34714、p37546、p42919、p00691、p22250、p39116、p54488、p40924、c0sp93、o31760、o32023、o32106、o32167、o34962、p12048、p25995、p28015、p28599、p34957、p35137、p37253、p37477、p37812、p37940、p46354、p49778、p54169、p54418、p54550、p54941、p80885、p94576、q04796、q06004、q07868、q9r9i1。作為示例性數(shù)據(jù)集，lc/ms/ms結(jié)果證明以下多肽由于它們在100mm氯化鐵(ph4.54)中持續(xù)可溶而被分離：p26901、o34669、o34918、p54423、o31803、p96657、o31973、p37871、o07921、o31643、q06796、p17889、p80698、p80239、o05411、o07909、o31925、p20278、p71014、p21879、p10475、p80700、p27876、q08352、p81101、p42111、p0ci78、p39824、o32210、p28598、p24327、o34385、q06797、p19405、p37571、p38494、o31398、p09124、p51777、p08821、p18429、o07593、p80868、p09339、p39645、o34788、o05268、p49814、p08877、p39632、p04957、p14949、p31103、o06746、o07555、p40767、p02394、p54531、p37965、p70960、p37809、p07343、p39773、p33166、p39634、p16263、p46898、p50849、p54716、p80240、q45071、p53001、p54375、p26908、p42919、p40924、p14192、p54484、p56849、o06748、p12878、p21477、p32081、p46899、p50620、p54464。基于鑒定為具有高溶解度的這些多肽的一級序列來分析它們的物理化學(xué)性質(zhì)。基于一級序列跨越測試的ph范圍計算每個氨基酸總電荷。如本文所述，預(yù)期最可溶的多肽具有較高每個氨基酸總電荷，并且這通常被證明是真實的。這個多路篩選基于一組多肽結(jié)合陰離子交換樹脂的親和力來從較大文庫鑒定它們，并且這個結(jié)果可如本文所述基于一級序列分析加以預(yù)測。多路純化：沉淀和絮凝。用于移除細胞和細胞碎片的常規(guī)生物藥物蛋白質(zhì)純化方法包括離心、微濾和深度過濾器。諸如硅藻土的助濾劑可用于增強這些步驟的性能，但它們并非始終有效，并且有時會顯著結(jié)合目標產(chǎn)物。它們的使用也可要求添加固體或均質(zhì)混懸液作為大規(guī)模生物藥物操作的一部分，所述添加可具有挑戰(zhàn)性。聚合絮凝劑可用于幫助使哺乳動物細胞培養(yǎng)工藝物流澄清化，但它們可具有局限性。舉例來說，由于擔憂使目標蛋白質(zhì)失活或歸因于沉淀的產(chǎn)物損失，通常用作加工助劑的硫酸魚精蛋白制劑在應(yīng)用方面受限(scopes,proteinpurificationprinciplesandpractice第3版,cantor編22-43；171(1994))。高品質(zhì)試劑，諸如銷售供醫(yī)學(xué)使用的試劑，可為昂貴的。在某些情況下，需要在極低程度上進行移除以確保在患者中不存在不利影響。舉例來說，殼聚糖不是充分確定的試劑，并且存在關(guān)于它在澄清化應(yīng)用中常規(guī)使用時的一致性能的擔憂。多種帶電荷聚合物，諸如deae右旋糖苷、基于丙烯酰胺的聚合物，常用于廢水處理中(nalcowaterhandbook,第2.1章節(jié):applications—impurityremoval,第3版,mcgraw-hill,2009)，并且聚乙烯胺(pei)已被考慮用于澄清化應(yīng)用中。關(guān)于后兩種類型的聚合物，丙烯酰胺試劑有可能被毒性試劑污染，而聚乙烯胺盡管是高度有效的澄清化試劑，但常被不同量的乙烯亞胺單體(一種懷疑致癌劑)污染(scawen等,handbookofenzymebiotechnology第2版,wiseman編:15-53(1985))。此外，這些聚合物中的許多(包括pei)傾向于幾乎不可逆結(jié)合許多色譜樹脂，由此限制下游加工選項。與這些聚合物相關(guān)的規(guī)章性和原材料再使用顧慮已從根本上限制它們用于學(xué)術(shù)研究。諸如明礬和鐵鹽的基于非聚合物的絮凝劑已用于廢水處理行業(yè)中(nalcowaterhandbook,第2.1章節(jié):applications—impurityremoval,第3版,mcgraw-hill,2009)。這些物質(zhì)可似乎不適用于處理蛋白質(zhì)產(chǎn)物，因為它們可結(jié)合蛋白質(zhì)產(chǎn)物，或可催化化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致對蛋白質(zhì)的可影響安全性或功效的修飾。在一些情況下，在多路篩選實驗平臺中測試整個蛋白質(zhì)文庫。在多路表達系統(tǒng)中轉(zhuǎn)染和表達168種營養(yǎng)性多肽的文庫，其中單一生長條件用于在單一容器中產(chǎn)生各多肽。這個多路表達系統(tǒng)允許關(guān)于廣泛范圍的可制造性參數(shù)來同時測試任一組多肽序列，所述參數(shù)各自可用于分級排序所考查的這組多肽。一組可制造性參數(shù)包括表達水平、多肽溶解度、多肽通過色譜法被純化的能力、抵抗熱變性的能力、多肽的消化能力、多肽通過抵抗苛刻處理被純化的能力。對于通過沉淀達成的大腸桿菌多路純化，這組168種營養(yǎng)性多肽序列被his8標簽化。如本文所述培養(yǎng)細胞，破裂，并且如本文所述使溶液澄清。這個產(chǎn)生過程產(chǎn)生含有來自這組的表達并可溶的所有多肽的溶液。使那組可溶性多肽穿過imac柱并洗脫，如本文所述。這個imac純化通過移除大多數(shù)大腸桿菌宿主細胞蛋白質(zhì)來將可溶性表達的營養(yǎng)性多肽作為一組有效分離。濃縮洗脫份，并且進行緩沖液交換以進入接近中性ph加以緩沖的低鹽溶液中，隨后測試各種純化方法。測試的方法包括陰離子交換色譜法、陽離子交換色譜法和負性沉淀，其中雜質(zhì)沉淀，并且保持可溶的多肽分級最高。在這個情況下，雜質(zhì)已被移除，因此多肽在它們自身之間被分級排序。另外，通過加熱來測試這組蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，其中在加熱之后保持可溶的多肽比沉淀的那些更加熱穩(wěn)定。將由大腸桿菌表達的一組預(yù)處理多肽分配至96孔板的32個孔中(每孔4.7ul蛋白質(zhì)儲備物，在43g/l的總蛋白質(zhì)濃度下)。添加儲備溶液至各孔中以產(chǎn)生以下條件：對照(無添加劑)；42mm檸檬酸鹽/磷酸鹽，ph7.1；42mm檸檬酸鹽/磷酸鹽，ph6.5；42mm檸檬酸鹽/磷酸鹽，ph6.0；42mm檸檬酸鹽/磷酸鹽，ph5.6；42mm檸檬酸鹽/磷酸鹽，ph5.0；42mm檸檬酸鹽/磷酸鹽，ph4.6；42mm檸檬酸鹽/磷酸鹽，ph4.3；42mm檸檬酸鹽/磷酸鹽，ph3.9；42mm檸檬酸鹽/磷酸鹽，ph3.7；42mm檸檬酸鹽/磷酸鹽，ph2.8；75mmtris堿；50mmna2co3；50mm哌嗪堿；100mm磷酸氫二鈉；50mm乙醇胺；100mm磷酸二氫鈉；100mmmes酸；100mm乙酸鈉，ph4.1；100mmmops酸；100mmtrishcl；25mm乙酸；25mm硼酸；25mm檸檬酸；50mmpipes酸；50mm丁二酸；1.2m亞硫酸鈉；1.5m亞硫酸鈉；2.5m硫酸銨；3.5m硫酸銨；200mmcacl2；60％甲醇。添加水以使各孔含有總計40ul5g/l的溶液。在室溫下混合各板30分鐘，接著在3,000rcf下離心10分鐘以集結(jié)任何沉淀蛋白質(zhì)。從各孔獲取樣品以進行分析。接著在95℃下加熱96孔板2分鐘。將板在3,000rcf下再次離心10分鐘以集結(jié)任何沉淀蛋白質(zhì)，并且從各孔獲取樣品以進行分析。所有64個樣品都通過bradford測定來分析，并且依次通過芯片電泳和lc/ms/ms來分析所選樣品。本文描述所有分析測定。對剩余在溶液中的總蛋白質(zhì)的測量證明許多條件導(dǎo)致多肽沉淀，從而指示一部分測試條件是嚴格苛刻條件。以表e9d中所述的4個所選樣品進行l(wèi)c/ms/ms分析。以x指示在可溶性部分中檢測到營養(yǎng)性多肽。表e9d.在所選條件的可溶性部分中檢測的營養(yǎng)性多肽。以x指示檢出。lc/ms/ms數(shù)據(jù)鑒定在各條件下的許多可溶性多肽。在篩選之中測試的不同條件代表許多不同沉淀機理，并且這些不同條件能夠基于不同組多肽的不同物理化學(xué)性質(zhì)來鑒定它們?；谠谕ㄟ^lc/ms/ms考查的條件下保持可溶的多肽的數(shù)目，最苛刻條件是在室溫下2.5m硫酸銨條件。除少數(shù)多肽之外，在那個條件下可溶的多肽通常在所有三種其它測試條件下都可溶。許多多肽被鑒定為在加熱至95℃持續(xù)2分鐘之后可溶。在這個實驗中，跨越廣泛多種條件關(guān)于可溶性來物理篩選營養(yǎng)性多肽的文庫，并且在各條件內(nèi)鑒定各子組的可溶性肽。實施例11.基于溶合評分和聚集評分以及其它基于序列的分析來選擇來自氨基酸序列文庫的營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列。溶合評分。溶合評分是用于評估給定蛋白質(zhì)的親水性和潛在可溶性的基于一級序列的量度。假定各殘基都獨立地溶合，那么溶合評分定義為所有氨基酸側(cè)鏈的用序列中的殘基總數(shù)加以標準化的總?cè)芎献杂赡?即與從氣相轉(zhuǎn)移至稀釋溶液相關(guān)的自由能變化)。側(cè)鏈溶合自由能是通過計算真空介電常數(shù)1與水介電常數(shù)80之間的靜電能量差異(通過解析poisson-boltzmann等式)，以及使用線性溶劑可及表面積模型計算非極性vanderwaals能量來計算得到(d.sitkoff,k.a.sharp,b.honig.“accuratecalculationofhydrationfreeenergiesusingmacroscopicsolventmodels”.j.phys.chem.98,1994)。這些溶合自由能與實驗測量充分相關(guān)。對于具有可離子化側(cè)鏈的氨基酸(arg、asp、cys、glu、his、lys和tyr)，平均溶合自由能基于在指定ph下各離子化狀態(tài)的相對概率。假定在折疊后所有極性殘基暴露于溶劑，而非極性殘基排除溶劑，那么溶合評分有效作為溶合自由能的量度。聚集評分。聚集評分是用于評估給定蛋白質(zhì)的疏水性和聚集可能性的基于一級序列的量度。使用賦予疏水性殘基正值并賦予親水性殘基負值的kyte和doolittle疏水性量表(kytej,doolittlerf(1982年5月)."asimplemethodfordisplayingthehydropathiccharacterofaprotein".j.mol.biol.157(1):105–32)，利用以各殘基為中心的5個殘基的移動平均值計算隨序列位置而變的有效疏水性。通過對大于0的所有那些平均疏水性值求和以及通過蛋白質(zhì)的總長度進行標準化來得到聚集評分。潛伏理解是聚集是兩個或更多個疏水性片塊集合以排除水并降低表面暴露的結(jié)果，并且蛋白質(zhì)將聚集的可能性隨它的疏水性(即聚集傾向性)殘基被密集壓緊程度而變。電荷含量。每個氨基酸絕對電荷或凈電荷是隨ph而變并獨立于殘基在蛋白質(zhì)內(nèi)的位置加以計算。鑒于ph值和可滴定殘基的pka，解析henderson-hasselbalch等式以確定各滴定狀態(tài)的相對濃度(例如對于酸性殘基谷氨酸，-1或0)。henderson-hasselbalch等式通過使這些相對濃度轉(zhuǎn)換成帶電荷的有效概率以及乘以那個氨基酸的電荷和實例數(shù)目來得到那個可滴定殘基的平均電荷。由這個程序得到的凈電荷或絕對電荷接著除以氨基酸的數(shù)目以得到每個氨基酸值。以下顯示于表e11a中的殘基類型在相應(yīng)pka值和相關(guān)滴定狀態(tài)下使用。這些pka值來自提供于歐洲分子生物學(xué)開放軟件套件(europeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)(rice,p.longden,i.和bleasby,a.emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite.trendsingenetics,16,2000)中的pka表。加權(quán)euclidean距離。為鑒定與已知臨床有效摻合物具有類似氨基酸分解的候選蛋白質(zhì)，使用基于加權(quán)euclidean距離的搜索策略。大體上，這意味著相對于靶標氨基酸分布計算各氨基酸的加權(quán)差異百分比，如由以下等式所定義：其中aa是靶標分布中的一組所有氨基酸，xi是候選蛋白質(zhì)序列中的氨基酸i的權(quán)重分數(shù)，是靶標氨基酸分布中的氨基酸i的權(quán)重分數(shù)，并且αi是與氨基酸i相關(guān)的相對權(quán)重。相對權(quán)重用于確保與最重要氨基酸靶標的大偏差被適當處罰。舉例來說，對于治療肌肉減少癥，支持運動，以及刺激產(chǎn)熱，使用氨基酸摻合物(鑒于亮氨酸和其它兩種支鏈氨基酸異亮氨酸和纈氨酸的相對重要性)的亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸相對權(quán)重3:2:2。所有其它氨基酸被賦予相對權(quán)重1。過敏原性。過敏原性評分是一種基于who推薦(fao.org/ag/agn/food/pdf/allergygm.pdf)的以一級序列為基礎(chǔ)的用于評估蛋白質(zhì)與任何已知過敏原的類似程度的量度，其中主要理解是靶標與已知過敏原之間的高同一性百分比可能指示交叉反應(yīng)性。對于給定蛋白質(zhì)，通過一對基于序列同源性的互補測試來評估引發(fā)過敏應(yīng)答的可能性。第一測試通過使用采用blosum50取代矩陣、空位開放罰分10和空位延伸罰分2的fasta算法，與某一數(shù)據(jù)庫的已知過敏原進行整體-局部序列比對來確定蛋白質(zhì)跨越整個序列的同一性百分比。表明兩個序列之間的整體同源性小于50％的蛋白質(zhì)不可能具有過敏原性(goodmanr.e.等allergenicityassessmentofgeneticallymodifiedcrops—whatmakessense？nat.biotech.26,73-81(2008).；aalberser.c.structuralbiologyofallergens.j.allergyclin.immunol.106,228-238(2000).)。第二測試通過使用采用blosum50取代矩陣、空位開放罰分10和空位延伸罰分2的fasta算法，將各片段與某一數(shù)據(jù)庫的已知過敏原進行整體-局部序列比對以確定所有可能的連續(xù)80個氨基酸的片段的局部過敏原性來沿蛋白質(zhì)序列評估局部過敏原性。任何80個氨基酸的窗口與任何過敏原的最高同一性百分比被取作目標蛋白質(zhì)的最終評分。who指導(dǎo)方針建議使用35％同一性截斷值。定制數(shù)據(jù)庫包含由食物過敏研究和資源程序(allergenonline.org/)、uniprot注釋(uniprot.org/docs/allergen)和過敏原性蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(sdap，fermi.utmb.edu/sdap/sdap_lnk.html)收集的匯合過敏原清單。這個數(shù)據(jù)庫包括由國際免疫學(xué)聯(lián)合會(iuis，allergen.org/)當前認可的所有過敏原以及尚末官方命名的許多其它過敏原。毒性/非過敏原性/抗營養(yǎng)性。蛋白質(zhì)的毒性、非過敏原性和抗營養(yǎng)性都通過分別確定蛋白質(zhì)與各數(shù)據(jù)庫的已知毒性、非過敏原性和蛋白酶抑制性蛋白質(zhì)的同一性百分比來類似地評估。假定毒性和抗營養(yǎng)性特性隨完整蛋白質(zhì)而變(即已知毒性蛋白質(zhì)的片段將不具有毒性)，因為它們的毒性和抑制性作用機理本質(zhì)上常與結(jié)構(gòu)相關(guān)(huntingtonj,readr,carrellr."structureofaserpin-proteasecomplexshowsinhibitionbydeformation".nature407(2000):923–6；vandenbornh.k.等theoreticalanalysisofthestructureofthepeptidefasciculinanditsdockingtoacetylcholinesterase.proteinsci.4(1995):703-715.；以及harelm.crystalstructureofanacetylcholinesterase-fasciculincomplex:interactionofathree-fingeredtoxinfromsnakevenomwithitstarget.structure.3(1995):1355-1366.)。鑒于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)隨整個蛋白質(zhì)序列而變，使用采用blosum50取代矩陣、空位開放罰分10和空位延伸罰分2的fasta算法，相對于兩個相應(yīng)數(shù)據(jù)庫進行目標蛋白質(zhì)的整體-整體比對。可使用截斷值35％。盡管參考文獻delaneyb.等evaluationofproteinsafetyinthecontextofagriculturalbiotechnology.food.chem.toxicol.46(2008:s71-s97未提供如何避免毒性/抗營養(yǎng)性多肽的具體說明，但它建議當評估可能的食物蛋白質(zhì)的安全性時，應(yīng)避免已知毒性多肽與抗營養(yǎng)性多肽兩者。蛋白質(zhì)的非過敏原性與它在暴露后引發(fā)過敏原性應(yīng)答的可能性相關(guān)(類似于過敏原性但與過敏原性相對)。具體來說，人免疫系統(tǒng)被定期暴露于眾多可能的過敏原性蛋白質(zhì)，并且具有確定自身與非自身的固有能力。這個能力的精確本質(zhì)并非總是明確的，并且存在由于身體未能區(qū)分自身與非自身而產(chǎn)生的許多疾病(例如關(guān)節(jié)炎)。盡管如此，理解是看起來非常像非過敏原性(即人)蛋白質(zhì)(即與其共有較大程度的序列同源性)的蛋白質(zhì)引發(fā)免疫應(yīng)答的可能性較小。特定來說，已顯示對于一些具有已知過敏原性成員的蛋白質(zhì)家族(原肌凝蛋白、小白蛋白、酪蛋白)，相對于已知過敏原性蛋白質(zhì)，攜帶與它們的人對應(yīng)物的更大序列同源性的那些蛋白質(zhì)不被認為具有過敏原性(jenkinsj.a.等evolutionarydistancefromhumanhomologsreflectsallergenicityofanimcalfoodproteins.j.allergyclinimmunol.120(2007):1399-1405.)。對于給定蛋白質(zhì)，非過敏原性評分是通過由使用采用blosum50取代矩陣、空位開放罰分10和空位延伸罰分2的fasta算法進行整體-局部比對以確定所述蛋白質(zhì)與某一數(shù)據(jù)庫的人蛋白質(zhì)的最大同一性百分比來測量。截斷值可變化。舉例來說，jenkinsj.a.等(evolutionarydistancefromhumanhomologsreflectsallergenicityofanimcalfoodproteins.j.allergyclinimmunol.120(2007):1399-1405)主張與人蛋白質(zhì)的序列同一性高于約62％的蛋白質(zhì)具有過敏原性的可能性較小。實施例12.營養(yǎng)性多肽的表達。以下清單包括在大腸桿菌、芽孢桿菌屬、黑曲霉和哺乳動物細胞中表達的所有營養(yǎng)性蛋白質(zhì)序列。在大腸桿菌中，檢測全細胞溶解產(chǎn)物或細胞溶解產(chǎn)物的可溶性部分中的蛋白質(zhì)。在芽孢桿菌屬中，檢測枯草芽孢桿菌或巨大芽孢桿菌的細胞溶解產(chǎn)物或分泌上清液中的表達。在黑曲霉中，蛋白質(zhì)從真菌分泌，并且在上清液中檢測。對于在哺乳動物細胞中表達的蛋白質(zhì)，在中國倉鼠卵巢-s株系(cho-s)或人胚腎293f株系(hek293f)中表達它們。通過以下量度來衡量表達：針對如上所述的個別蛋白質(zhì)表達進行的匯合文庫中由lc-ms/ms獲得的蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)的質(zhì)譜測定法光譜計數(shù)、sds-page、芯片電泳、斑點印跡、蛋白質(zhì)印跡(westernblot)和elisa。在大腸桿菌的全細胞溶解產(chǎn)物或細胞溶解產(chǎn)物的可溶性部分中檢測到以下營養(yǎng)性多肽：seqid-00001、seqid-00002、seqid-00003、seqid-00004、seqid-00005、seqid-00007、seqid-00008、seqid-00009、seqid-00011、seqid-00012、seqid-00013、seqid-00014、seqid-00015、seqid-00016、seqid-00020、seqid-00021、seqid-00024、seqid-00025、seqid-00027、seqid-00028、seqid-00029、seqid-00030、seqid-00031、seqid-00033、seqid-00043、seqid-00049、seqid-00051、seqid-00052、seqid-00053、seqid-00054、seqid-00055、seqid-00057、seqid-00059、seqid-00060、seqid-00061、seqid-00068、seqid-00070、seqid-00071、seqid-00073、seqid-00074、seqid-00075、seqid-00076、seqid-00077、seqid-00078、seqid-00083、seqid-00084、seqid-00085、seqid-00086、seqid-00087、seqid-00088、seqid-00090、seqid-00091、seqid-00092、seqid-00093、seqid-00098、seqid-00099、seqid-00100、seqid-00101、seqid-00102、seqid-00103、seqid-00104、seqid-00105、seqid-00106、seqid-00107、seqid-00108、seqid-00110、seqid-00112、seqid-00113、seqid-00115、seqid-00116、seqid-00117、seqid-00118、seqid-00123、seqid-00124、seqid-00128、seqid-00130、seqid-00131、seqid-00132、seqid-00134、seqid-00137、seqid-00139、seqid-00140、seqid-00141、seqid-00142、seqid-00143、seqid-00145、seqid-00146、seqid-00148、seqid-00150、seqid-00151、seqid-00152、seqid-00153、seqid-00154、seqid-00155、seqid-00157、seqid-00158、seqid-00159、seqid-00162、seqid-00166、seqid-00169、seqid-00175、seqid-00193、seqid-00194、seqid-00195、seqid-00196、seqid-00197、seqid-00198、seqid-00199、seqid-00200、seqid-00201、seqid-00202、seqid-00203、seqid-00204、seqid-00205、seqid-00211、seqid-00212、seqid-00213、seqid-00214、seqid-00215、seqid-00216、seqid-00218、seqid-00219、seqid-00220、seqid-00221、seqid-00223、seqid-00224、seqid-00225、seqid-00226、seqid-00227、seqid-00228、seqid-00230、seqid-00232、seqid-00233、seqid-00234、seqid-00235、seqid-00236、seqid-00237、seqid-00239、seqid-00240、seqid-00241、seqid-00264、seqid-00265、seqid-00266、seqid-00267、seqid-00268、seqid-00269、seqid-00270、seqid-00271、seqid-00273、seqid-00274、seqid-00275、seqid-00276、seqid-00284、seqid-00287、seqid-00297、seqid-00298、seqid-00299、seqid-00302、seqid-00303、seqid-00304、seqid-00305、seqid-00306、seqid-00307、seqid-00309、seqid-00318、seqid-00322、seqid-00325、seqid-00326、seqid-00327、seqid-00328、seqid-00329、seqid-00332、seqid-00335、seqid-00336、seqid-00337、seqid-00338、seqid-00341、seqid-00343、seqid-00344、seqid-00345、seqid-00346、seqid-00349、seqid-00350、seqid-00352、seqid-00353、seqid-00354、seqid-00355、seqid-00356、seqid-00357、seqid-00358、seqid-00359、seqid-00360、seqid-00362、seqid-00363、seqid-00408、seqid-00409、seqid-00415、seqid-00416、seqid-00418、seqid-00424、seqid-00481、seqid-00482、seqid-00483、seqid-00484、seqid-00485、seqid-00486、seqid-00487、seqid-00488、seqid-00489、seqid-00490、seqid-00491、seqid-00492、seqid-00493、seqid-00494、seqid-00495、seqid-00496、seqid-00497、seqid-00498、seqid-00499、seqid-00500、seqid-00501、seqid-00502、seqid-00503、seqid-00504、seqid-00505、seqid-00506、seqid-00507、seqid-00508、seqid-00509、seqid-00510、seqid-00511、seqid-00512、seqid-00513、seqid-00514、seqid-00515、seqid-00516、seqid-00517、seqid-00518、seqid-00519、seqid-00520、seqid-00521、seqid-00522、seqid-00523、seqid-00524、seqid-00525、seqid-00526、seqid-00527、seqid-00528、seqid-00529、seqid-00530、seqid-00531、seqid-00532、seqid-00533、seqid-00534、seqid-00535、seqid-00536、seqid-00537、seqid-00538、seqid-00539、seqid-00540、seqid-00541、seqid-00542、seqid-00543、seqid-00544、seqid-00545、seqid-00546、seqid-00547、seqid-00548、seqid-00549、seqid-00550、seqid-00551、seqid-00552、seqid-00553、seqid-00554、seqid-00555、seqid-00556、seqid-00557、seqid-00558、seqid-00559、seqid-00560、seqid-00561、seqid-00562、seqid-00563、seqid-00564、seqid-00565、seqid-00566、seqid-00567、seqid-00568、seqid-00569、seqid-00570、seqid-00571、seqid-00572、seqid-00573、seqid-00574、seqid-00575、seqid-00576、seqid-00577、seqid-00578、seqid-00579、seqid-00580、seqid-00581、seqid-00582、seqid-00583、seqid-00584、seqid-00585、seqid-00586、seqid-00587、seqid-00588、seqid-00589、seqid-00590、seqid-00591、seqid-00592、seqid-00593、seqid-00594、seqid-00595、seqid-00596、seqid-00597、seqid-00598、seqid-00599、seqid-00600、seqid-00601、seqid-00602、seqid-00603、seqid-00604、seqid-00605、seqid-00606、seqid-00607、seqid-00608、seqid-00609、seqid-00610、seqid-00611、seqid-00612、seqid-00613、seqid-00614、seqid-00615、seqid-00616、seqid-00617、seqid-00618、seqid-00619、seqid-00620、seqid-00621、seqid-00622、seqid-00623、seqid-00624、seqid-00625、seqid-00626、seqid-00627、seqid-00628、seqid-00629、seqid-00630、seqid-00631、seqid-00632、seqid-00633、seqid-00634、seqid-00635、seqid-00636、seqid-00637、seqid-00638、seqid-00639、seqid-00640、seqid-00641、seqid-00642、seqid-00643、seqid-00644、seqid-00645、seqid-00646、seqid-00647、seqid-00648、seqid-00669、seqid-00670、seqid-00671、seqid-00672、seqid-00673、seqid-00674、seqid-00675、seqid-00676、seqid-00677、seqid-00678、seqid-00679、seqid-00680、seqid-00681、seqid-00682、seqid-00716、seqid-00717、seqid-00718、seqid-00719、seqid-00720、seqid-00723、seqid-00724、seqid-00725、seqid-00726、seqid-00727、seqid-00728、seqid-00729、seqid-00730、seqid-00731、seqid-00732、seqid-00734、seqid-00735、seqid-00736、seqid-00737、seqid-00738、seqid-00739、seqid-00740、seqid-00741、seqid-00742、seqid-00743、seqid-00744、seqid-00745、seqid-00746、seqid-00747、seqid-00748、seqid-00749、seqid-00750、seqid-00751、seqid-00752、seqid-00753、seqid-00754、seqid-00755、seqid-00756、seqid-00757、seqid-00758、seqid-00759、seqid-00760、seqid-00761、seqid-00763、seqid-00765、seqid-00766、seqid-00767、seqid-00768、seqid-00769、seqid-00770、seqid-00771、seqid-00772、seqid-00773、seqid-00774、seqid-00775、seqid-00777、seqid-00778、seqid-00780、seqid-00781、seqid-00782、seqid-00783、seqid-00784、seqid-00785、seqid-00786、seqid-00787、seqid-00788、seqid-00789、seqid-00790、seqid-00791、seqid-00792、seqid-00793、seqid-00794、seqid-00795、seqid-00796、seqid-00797、seqid-00798、seqid-00799、seqid-00801、seqid-00802、seqid-00803、seqid-00804、seqid-00805、seqid-00806、seqid-00807、seqid-00808、seqid-00809、seqid-00810、seqid-00811、seqid-00812、seqid-00813、seqid-00814、seqid-00815、seqid-00816、seqid-00817、seqid-00818、seqid-00819、seqid-00820、seqid-00821、seqid-00822、seqid-00823、seqid-00824、seqid-00825、seqid-00826、seqid-00827、seqid-00828、seqid-00829、seqid-00830、seqid-00831、seqid-00832、seqid-00833、seqid-00834、seqid-00835、seqid-00836、seqid-00837。在枯草芽孢桿菌或巨大芽孢桿菌的細胞溶解產(chǎn)物或分泌上清液中檢測到以下營養(yǎng)性多肽：seqid-00003、seqid-00004、seqid-00005、seqid-00087、seqid-00099、seqid-00102、seqid-00103、seqid-00105、seqid-00115、seqid-00218、seqid-00220、seqid-00223、seqid-00226、seqid-00236、seqid-00240、seqid-00267、seqid-00271、seqid-00276、seqid-00297、seqid-00298、seqid-00299、seqid-00302、seqid-00303、seqid-00304、seqid-00305、seqid-00306、seqid-00307、seqid-00309、seqid-00318、seqid-00322、seqid-00325、seqid-00326、seqid-00327、seqid-00328、seqid-00329、seqid-00330、seqid-00332、seqid-00335、seqid-00336、seqid-00337、seqid-00338、seqid-00340、seqid-00341、seqid-00343、seqid-00344、seqid-00345、seqid-00346、seqid-00349、seqid-00350、seqid-00352、seqid-00353、seqid-00354、seqid-00355、seqid-00356、seqid-00357、seqid-00358、seqid-00359、seqid-00360、seqid-00361、seqid-00362、seqid-00363、seqid-00374、seqid-00389、seqid-00398、seqid-00403、seqid-00404、seqid-00405、seqid-00407、seqid-00409、seqid-00415、seqid-00416、seqid-00417、seqid-00418、seqid-00419、seqid-00420、seqid-00421、seqid-00424、seqid-00481、seqid-00482、seqid-00483、seqid-00484、seqid-00485、seqid-00486、seqid-00487、seqid-00488、seqid-00489、seqid-00490、seqid-00491、seqid-00492、seqid-00493、seqid-00494、seqid-00495、seqid-00496、seqid-00497、seqid-00498、seqid-00499、seqid-00500、seqid-00501、seqid-00502、seqid-00503、seqid-00504、seqid-00505、seqid-00506、seqid-00507、seqid-00508、seqid-00509、seqid-00510、seqid-00511、seqid-00512、seqid-00513、seqid-00514、seqid-00515、seqid-00516、seqid-00517、seqid-00518、seqid-00519、seqid-00520、seqid-00521、seqid-00522、seqid-00523、seqid-00524、seqid-00525、seqid-00526、seqid-00527、seqid-00528、seqid-00529、seqid-00530、seqid-00531、seqid-00532、seqid-00533、seqid-00534、seqid-00535、seqid-00536、seqid-00537、seqid-00538、seqid-00539、seqid-00540、seqid-00541、seqid-00542、seqid-00543、seqid-00544、seqid-00545、seqid-00546、seqid-00547、seqid-00548、seqid-00549、seqid-00550、seqid-00551、seqid-00552、seqid-00553、seqid-00554、seqid-00555、seqid-00556、seqid-00557、seqid-00558、seqid-00559、seqid-00560、seqid-00561、seqid-00562、seqid-00563、seqid-00564、seqid-00565、seqid-00566、seqid-00567、seqid-00568、seqid-00569、seqid-00570、seqid-00571、seqid-00572、seqid-00573、seqid-00574、seqid-00575、seqid-00576、seqid-00577、seqid-00578、seqid-00579、seqid-00580、seqid-00581、seqid-00582、seqid-00583、seqid-00584、seqid-00585、seqid-00586、seqid-00587、seqid-00588、seqid-00589、seqid-00590、seqid-00591、seqid-00592、seqid-00593、seqid-00594、seqid-00595、seqid-00596、seqid-00597、seqid-00598、seqid-00599、seqid-00600、seqid-00601、seqid-00602、seqid-00603、seqid-00604、seqid-00605、seqid-00606、seqid-00607、seqid-00608、seqid-00609、seqid-00610、seqid-00611、seqid-00612、seqid-00613、seqid-00614、seqid-00615、seqid-00616、seqid-00617、seqid-00618、seqid-00619、seqid-00620、seqid-00621、seqid-00622、seqid-00623、seqid-00624、seqid-00625、seqid-00626、seqid-00627、seqid-00628、seqid-00629、seqid-00630、seqid-00631、seqid-00632、seqid-00633、seqid-00634、seqid-00635、seqid-00636、seqid-00637、seqid-00638、seqid-00639、seqid-00640、seqid-00641、seqid-00642、seqid-00643、seqid-00644、seqid-00645、seqid-00646、seqid-00647、seqid-00648、seqid-00653、seqid-00654、seqid-00655、seqid-00656、seqid-00657、seqid-00659、seqid-00660、seqid-00664、seqid-00668、seqid-00670、seqid-00671、seqid-00672、seqid-00673、seqid-00674、seqid-00675、seqid-00676、seqid-00678、seqid-00679、seqid-00680、seqid-00681、seqid-00682、seqid-00690、seqid-00710、seqid-00711、seqid-00712、seqid-00713、seqid-00714、seqid-00715、seqid-00716、seqid-00717、seqid-00718、seqid-00719、seqid-00720、seqid-00723、seqid-00724、seqid-00725、seqid-00726、seqid-00727、seqid-00728、seqid-00729、seqid-00730、seqid-00731、seqid-00734、seqid-00735、seqid-00736、seqid-00737、seqid-00738、seqid-00739、seqid-00740、seqid-00741、seqid-00742、seqid-00743、seqid-00744、seqid-00745、seqid-00746、seqid-00747、seqid-00748、seqid-00749、seqid-00750、seqid-00751、seqid-00752、seqid-00753、seqid-00754、seqid-00755、seqid-00756、seqid-00757、seqid-00758、seqid-00759、seqid-00760、seqid-00761、seqid-00763、seqid-00765、seqid-00766、seqid-00767、seqid-00768、seqid-00769、seqid-00770、seqid-00771、seqid-00772、seqid-00773、seqid-00774、seqid-00775、seqid-00777、seqid-00778、seqid-00780、seqid-00781、seqid-00782、seqid-00783、seqid-00784、seqid-00785、seqid-00786、seqid-00787、seqid-00788、seqid-00789、seqid-00790、seqid-00791、seqid-00792、seqid-00793、seqid-00794、seqid-00795、seqid-00796、seqid-00797、seqid-00798、seqid-00799、seqid-00800、seqid-00801、seqid-00802、seqid-00803、seqid-00804、seqid-00805、seqid-00806、seqid-00807、seqid-00808、seqid-00809、seqid-00810、seqid-00811、seqid-00812、seqid-00813、seqid-00814、seqid-00815、seqid-00816、seqid-00817、seqid-00818、seqid-00819、seqid-00820、seqid-00821、seqid-00822、seqid-00823、seqid-00824、seqid-00825、seqid-00826、seqid-00827、seqid-00828、seqid-00829、seqid-00830、seqid-00831、seqid-00832、seqid-00833、seqid-00834、seqid-00835、seqid-00836、seqid-00837。從黑曲霉的分泌上清液檢測到以下營養(yǎng)性多肽：seqid-00087、seqid-00103、seqid-00105、seqid-00112、seqid-00115、seqid-00218、seqid-00298、seqid-00341、seqid-00352、seqid-00354、seqid-00363、seqid-00406、seqid-00409、seqid-00415、seqid-00416、seqid-00417、seqid-00418、seqid-00419、seqid-00420、seqid-00421、seqid-00424、seqid-00552、seqid-00554。以下營養(yǎng)性多肽在哺乳動物細胞系中國倉鼠卵巢-s株系(cho-s)或人胚腎293f株系(hek293f)中表達：seqid-00001、seqid-00103、seqid-00105、seqid-00298。實施例13.在大腸桿菌細菌中表達營養(yǎng)性多肽。從可食用物種產(chǎn)生營養(yǎng)性多肽序列文庫并篩選以論證在大腸桿菌中表達營養(yǎng)性多肽。基因合成和質(zhì)粒構(gòu)建。所有基因都由lifetechnologies/geneart或dna2.0合成制備，并且針對在大腸桿菌中表達加以優(yōu)化。使用多克隆位點內(nèi)的ndei-bamhi限制位點(因此含有氨基末端mgsshhhhhhssglvprgsh標簽)將基因克隆至pet15b(emdmillipore/novagen)中，或使用引物克隆至ncoi-bamhi位點(因此移除質(zhì)粒上的氨基末端標簽)中以包括含有mgshhhhhhhh或mgshhhhhhhhsenlyfqg的氨基末端標簽。pet15b含有pbr322復(fù)制起點、lac控制的t7啟動子、和賦予對羧芐青霉素的抗性的bla基因。對于手動克隆的片段，使用t7啟動子引物與t7終止子引物兩者，通過sanger測序來驗證插入物。對于分泌構(gòu)建體，將基因在t5終止子的上游克隆至pj444載體(dna2.0,usa)中，具有c末端hhhhhhhh標簽和n末端中的dsba信號肽(atgaaaaagatttggctggcgctggctggtttagttttagcgtttagcgcatcggcg)。菌株構(gòu)建。t7express感受態(tài)大腸桿菌購自newenglandbiolabs，并且用作親本菌株。t7express是一種增強的bl21衍生物，其在lac操縱元中含有t7rna聚合酶，同時仍然缺乏lon和ompt蛋白酶。t7express的基因型是：fhua2lacz::t7gene1[lon]omptgalsula11r(mcr-73::minitn10--tets)2[dcm]r(zgb-210::tn10--tets)enda1δ(mcrc-mrr)114::is10。對于分泌構(gòu)建體，cgsc5610(美國耶魯大腸桿菌遺傳儲備物中心(yalee.coligeneticstockcenter,usa))用于研究。cgsc5610的基因型是f-,lacy1或δ(cod-laci)6,glnv44(as),galk2(oc),galt22,λ-,e14-,mcra0,rfbc1,metb1,mcrb1,hsdr2。約1ng上述純化質(zhì)粒dna用于轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)t7express，并且在37℃下孵育約16小時之后在含有100mg/l羧芐青霉素的lb瓊脂板上選擇單一菌落。將單一菌落接種至含有100mg/l羧芐青霉素的液體lb中，并且生長直至細胞密度od600nm≈0.6，此時，將甘油在10％(v/v)下補充至培養(yǎng)基中，并且獲取等分試樣以在-80℃下儲存在冷凍小瓶中。表達測試。使表達培養(yǎng)物在lb培養(yǎng)基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨和5g/l酵母提取物)中或在biosiltaenbase培養(yǎng)基中生長，并且用異丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷誘導(dǎo)。對于lb培養(yǎng)基中的表達測試，將菌落或來自甘油儲備物的穿刺物接種至3ml補充以100mg/l羧芐青霉素的lb中，并且在37℃和250rpm下生長過夜(約16小時)。次日早晨，測量細胞密度(在od600nm下以分光光度方式)，并且于3ml補充以羧芐青霉素的lb培養(yǎng)基中稀釋回到od600nm＝0.05并在37℃和250rpm下生長。在od600nm≈0.8±0.2下，用1mmiptg誘導(dǎo)培養(yǎng)物。使異源性表達在37℃和250rpm下進行2小時，此時終止培養(yǎng)。測量終末細胞密度。對于用enbase培養(yǎng)基的表達，將菌落或來自甘油儲備物的穿刺物接種至3ml具有100mg/l羧芐青霉素的lb中，并且在od600＝0.1時轉(zhuǎn)移至具有100mg/l羧芐青霉素和600mu/l的葡糖淀粉酶的enbase培養(yǎng)基中，并在37℃和250rpm下生長過夜，并且次日用1mmiptg誘導(dǎo)。使異源性表達在37℃和250rpm下持續(xù)24小時，此時終止培養(yǎng)。測量終末細胞密度，并且通過離心(3000rpm，10分鐘，室溫)來收集細胞。為測定細胞內(nèi)產(chǎn)量，根據(jù)制造商方案用b-per(pierce)溶解細胞，接著測定以測量目標蛋白質(zhì)(poi)。為測定分泌蛋白質(zhì)的水平，通過0.22μm過濾器來過濾0.5ml培養(yǎng)上清液等分試樣。接著測定濾液以測定分泌目標蛋白質(zhì)(poi)的水平。發(fā)酵。以20和/或250l發(fā)酵方式在大腸桿菌宿主細胞nebt7express(newenglandbiolabs)中表達細胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)seqid-00105、seqid-00240、seqid-00338、seqid-00341、seqid-00352、seqid-00363、seqid-00423、seqid-00424、seqid-00425、seqid-00426、seqid-00429、seqid-00559和seqid-00587。發(fā)酵發(fā)生在含有以下的富含碳和氮的培養(yǎng)基中：酵母提取物、大豆水解產(chǎn)物、甘油、葡萄糖和乳糖。發(fā)酵在30℃下發(fā)生，并且誘導(dǎo)在存在于培養(yǎng)基中的葡萄糖被耗盡，并且乳糖變?yōu)橹饕荚刺菚r發(fā)生。發(fā)酵過程時間通常持續(xù)24–26小時。發(fā)酵操作參數(shù)被控制在ph6.9、溫度30℃和溶氧百分比35％下。在培養(yǎng)持續(xù)時間的稍后階段，培養(yǎng)物被補充以基于甘油的補料。收集發(fā)生在細胞進入靜止期，并且不再需要補充氧氣以維持35％設(shè)置點時。營養(yǎng)性多肽文庫基因合成和質(zhì)粒構(gòu)建。以線性片段形式產(chǎn)生編碼168種不同可食用物種多肽序列的基因，并且針對在大腸桿菌中表達加以密碼子選擇。在一些情況下，單一線性片段含有兩種或更多種編碼兩種或更多種不同多肽序列的具有側(cè)接5’ndei限制位點和3’bamhi限制位點的核酸序列。所有線性片段都以相等摩爾濃度組合。線性片段用ndei和bamhi消化，并且使用引物將消化的混合物克隆至pet15b(emdmillipore/novagen)中以包括含有mgshhhhhhhh的氨基末端標簽和ndei-bamhi限制位點。pet15b含有pbr322復(fù)制起點、lac控制的t7啟動子、和賦予對羧芐青霉素的抗性的bla基因。對于克隆的片段，使用t7啟動子引物與t7終止子引物兩者，通過sanger測序來驗證插入物。168種營養(yǎng)性多肽的文庫菌株構(gòu)建。t7express感受態(tài)大腸桿菌(newenglandbiolabs)用作親本菌株。t7express是一種增強的bl21衍生物，其在lac操縱元中含有t7rna聚合酶，同時缺乏lon和ompt蛋白酶。t7express的基因型是：fhua2lacz::t7gene1[lon]omptgalsula11r(mcr-73::minitn10--tets)2[dcm]r(zgb-210::tn10--tets)enda1δ(mcrc-mrr)114::is10。對于分泌構(gòu)建體，使用cgsc5610(美國耶魯大腸桿菌遺傳儲備物中心)。cgsc5610的基因型是f-,lacy1或δ(cod-laci)6,glnv44(as),galk2(oc),galt22,λ-,e14-,mcra0,rfbc1,metb1,mcrb1,hsdr2。將約10ng連接的dna混合物轉(zhuǎn)化至化學(xué)感受態(tài)t7express中，并且在37℃下孵育約16小時之后在含有100mg/l羧芐青霉素的lb瓊脂板上選擇單一菌落。進行多重轉(zhuǎn)化，并且將約1000個菌落匯合在一起并混懸至lb培養(yǎng)基中。對來自50-100個菌落的dna測序以確定產(chǎn)生的文庫的多樣性。168種營養(yǎng)性多肽的文庫表達測試。使再混懸于lb培養(yǎng)基中的菌落混合物初始在3ml具有100mg/l羧芐青霉素的lb培養(yǎng)基(10g/lnacl、10g/l胰蛋白胨和5g/l酵母提取物)中生長，接著在od600＝0.1時轉(zhuǎn)移至具有100mg/l羧芐青霉素和600mu/l的葡糖淀粉酶的biosiltaenbase培養(yǎng)基中，在37℃和250rpm下生長過夜，并且次日用1mmiptg誘導(dǎo)。使異源性表達在37℃和250rpm下持續(xù)24小時，此時終止培養(yǎng)。測量終末細胞密度，并且通過離心(3000rpm，10分鐘，室溫)來收集細胞。為測定細胞內(nèi)產(chǎn)量，使用微射流機使細胞溶解，并且根據(jù)制造商方案于5ml鎳親和柱中純化可溶性部分，接著使用lc-ms/ms進行測定以鑒定如下所述表達的蛋白質(zhì)?；趍s光譜計數(shù)，168種不同蛋白質(zhì)中的114種在大腸桿菌中成功可溶性表達。基于這個結(jié)果，個別地克隆某些基因，并且在大腸桿菌中測試細胞內(nèi)可溶性表達。在大腸桿菌菌株背景中表達真菌營養(yǎng)性多肽。4種菌株用于表達真菌營養(yǎng)性多肽：來自newenglandbiolabs的t7express、shufflet7和shufflet7express；和來自emdmillipore的origamib(de3)。t7express是一種增強的bl21衍生物，其在lac操縱元中含有t7rna聚合酶，同時缺乏lon和ompt蛋白酶。t7express的基因型是：fhua2lacz::t7gene1[lon]omptgalsula11r(mcr-73::minitn10--tets)2[dcm]r(zgb-210::tn10--tets)enda1δ(mcrc-mrr)114::is10。shufflet7是一種促進細胞質(zhì)二硫鍵形成，并且表達t7rnap的染色體拷貝的k12衍生菌株。shufflet7的基因型是f′lac,pro,laciq/δ(ara-leu)7697arad139fhua2lacz::t7gene1δ(phoa)pvuiiphorahpc*gale(oru)galkλatt::pneb3-r1-cdsbc(specr,laciq)δtrxbrpsl150(strr)δgorδ(malf)3。shufflet7express是一種促進細胞質(zhì)二硫鍵形成，并且表達t7rnap的染色體拷貝的bl21衍生菌株。shufflet7express的基因型是fhua2lacz::t7gene1[lon]omptahpcgalλatt::pneb3-r1-cdsbc(specr,laciq)δtrxbsula11r(mcr-73::minitn10--tets)2[dcm]r(zgb-210::tn10--tets)enda1δgorδ(mcrc-mrr)114::is10。origamib(de3)是一種在trxb和gor中含有促進細胞質(zhì)中二硫鍵形成的突變的bl21衍生物。origamib(de3)的基因型是f-ompthsdsb(rb-mb-)galdcmlacy1ahpc(de3)gor522::tn10trxb(kanr,tetr)。如對于大腸桿菌所述來完成對這些菌株的表達篩選。實施例14.在枯草芽孢桿菌細菌中表達營養(yǎng)性多肽?；蚝铣珊唾|(zhì)粒構(gòu)建。所有編碼目標蛋白質(zhì)(poi)的基因都通過pcr來克隆。這些基因的pcr擴增模板是對于在大腸桿菌中表達(參見上文)所產(chǎn)生的合成基因或來自來源生物體(例如枯草芽孢桿菌)的基因組dna。合成基因針對在大腸桿菌中表達加以密碼子優(yōu)化?？寺〉乃谢蚨季哂性诰o靠終止密碼子之前同框融合于它們的3’末端的編碼1xflag標簽(氨基酸＝dykdddk)的序列。對于在枯草芽孢桿菌中表達，根據(jù)制造商說明書，使用gibson組裝主混合物(newenglandbiolabs,beverly,ma)和克隆宿主大腸桿菌turbo(newenglandbiolabs)將基因克隆于mobitec(germany)表達載體pht43中。以分泌表達構(gòu)建體(基因與編碼來自解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶信號肽(samyq)的dna同框融合)形式或以細胞內(nèi)表達構(gòu)建體(基因緊靠核糖體結(jié)合位點(rbs)的下游插入，從而移除samyq序列)形式將基因克隆至pht43中。在轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中之后，在含有100μg/ml羧芐青霉素(cb100)的lb瓊脂板上選擇含有重組質(zhì)粒的細胞。從大腸桿菌分離重組質(zhì)粒，并且在轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌表達宿主中之前通過sanger測序來驗證它們的dna序列。菌株構(gòu)建?？莶菅挎邨U菌菌株wb800n購自mobitec(germany)，并且用作表達宿主。wb800n是充分研究的菌株(枯草芽孢桿菌168)的衍生物，并且它已通過缺失編碼8種細胞外蛋白酶的基因(npre、apre、epr、bpr、mpr、nprb、vpr和wpra)來工程改造以降低分泌蛋白質(zhì)的蛋白水解降解。根據(jù)制造商說明書進行枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化。將約1μg各表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化至wb800n中，并且通過涂鋪在含有5.0μg/ml氯霉素(cm5)的lb瓊脂上來在37℃下選擇單一菌落。使個別轉(zhuǎn)化體在含有cm5的lb肉湯中生長直至它們達到對數(shù)期。使這些培養(yǎng)物的等分試樣與甘油(20％最終濃度)混合，并且冷凍在-80℃下。表達測試?？莶菅挎邨U菌表達菌株的冷凍甘油儲備物用于接種于深孔塊(96方孔)中的1ml具有cm5的2x-mal培養(yǎng)基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨和10g/l酵母提取物、75g/l麥芽糖)。培養(yǎng)塊用多孔粘附性板密封物覆蓋，并且在微型表達室(glas-col,terrehaute,in)中在37℃和880rpm下孵育過夜。過夜培養(yǎng)物用于接種于深孔塊中的新鮮2x-malcm5培養(yǎng)物以獲得起始od600＝0.1。在37℃、880rpm下孵育這些表達培養(yǎng)物直至od600＝1.0(約4小時)，此時通過在最終濃度0.1m下添加異丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)以及繼續(xù)孵育4小時來誘導(dǎo)它們。在4小時之后，測量各培養(yǎng)物的細胞密度(od600)，并且通過離心(3000rpm，10分鐘，室溫)來收集細胞。在離心之后，小心移除培養(yǎng)上清液，并且轉(zhuǎn)移至新塊中，并將細胞集結(jié)塊冷凍在-80℃下。為測定分泌蛋白質(zhì)的水平，首先通過0.45-μm過濾器，隨后通過0.22μm過濾器來過濾0.5-ml培養(yǎng)上清液等分試樣。接著測定濾液以測定分泌目標蛋白質(zhì)(poi)的水平。為測定細胞內(nèi)產(chǎn)生的poi的水平，使冷凍細胞集結(jié)塊解凍，并且添加0.5g0.1mm鋯珠粒至各樣品中，隨后添加0.5mlpbs。通過在配備有96孔板適配器的qiagentissuelyserii(qiagen,hilden,germany)中進行珠粒敲打5分鐘來在冷室(4℃)中使細胞溶解。在3000rpm下離心細胞溶解產(chǎn)物10分鐘，并且移除上清液并如下所述分析poi濃度。為測定分泌蛋白質(zhì)的水平，通過0.22μm過濾器來過濾0.5ml培養(yǎng)上清液等分試樣。接著測定濾液以測定分泌目標蛋白質(zhì)(poi)的水平。振蕩燒瓶表達。從各seqid的瓊脂板挑選單一菌落，并且接種至5ml2xmal培養(yǎng)基中。使這些振蕩燒瓶接種物在30℃振蕩孵育器中生長過夜。5ml的這個過夜培養(yǎng)物用于接種250ml2xmal。使培養(yǎng)物在30℃下生長4小時，接著在30℃下誘導(dǎo)4小時。通過離心來收集培養(yǎng)物。無菌過濾各seqid的離心上清液，并且冷凍在-80℃下。發(fā)酵表達。已使seqid-00105的可溶性蛋白質(zhì)從含有游離性質(zhì)?；蛘腺|(zhì)粒的工程改造的枯草芽孢桿菌菌株分泌。發(fā)酵以4l體積發(fā)生在含有植物蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖的富含碳和氮的培養(yǎng)基中。使發(fā)酵培養(yǎng)物在30℃下，在ph7.0和溶氧百分比40％下生長。通過添加iptg進行的誘導(dǎo)發(fā)生在od600nm是5.0(+/-1.0)時。在誘導(dǎo)后，培養(yǎng)物被補充以基于葡萄糖的補料。在誘導(dǎo)后5–8小時收集培養(yǎng)物。接著通過離心移除生物質(zhì)，并且通過過濾使上清液澄清并儲存在4℃下直至處理。168種營養(yǎng)性多肽的文庫基因合成和質(zhì)粒構(gòu)建。對于在枯草芽孢桿菌中表達，所用載體源于不具有信號肽的pht43骨架載體(mobitecgermany)，并且grac啟動子被apre啟動子取代，并移除laci表達盒。168種編碼以上鑒定的168種不同蛋白質(zhì)序列的基因由lifetechnologies/geneart以線性片段(基因串列)形式合成制備，并且被選擇用于在大腸桿菌中表達。在大多數(shù)情況下，兩種基因以具有側(cè)接5’ndei限制位點和3’bamhi限制位點的單一線性片段形式合成在一起。所有線性片段都以相等摩爾濃度混合在一起。接著用ndei和bamhi消化線性片段混合物。以分泌表達構(gòu)建體(基因與編碼來自枯草芽孢桿菌的脂肪酶信號肽(lipasp)的dna同框融合)形式或以細胞內(nèi)表達構(gòu)建體(基因緊靠核糖體結(jié)合位點(rbs)的下游插入，具有以及不具有含有mgshhhhhhh的n末端標簽)形式將消化的混合物克隆至載體中。使用t4dna連接酶(newenglandbiolabs,beverly,ma)使文庫基因連接于載體pcr產(chǎn)物。根據(jù)制造商說明書將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至克隆宿主大腸桿菌turbo(newenglandbiolabs)中。對50-100個菌落測序以確定前導(dǎo)肽文庫的多樣性。接著將瓊脂板上的菌落混懸于lb培養(yǎng)基中，并且收集以進行質(zhì)粒純化。168種營養(yǎng)性多肽的文庫菌株構(gòu)建。wb800n是充分研究的菌株(枯草芽孢桿菌168)的衍生物，并且它已通過缺失編碼8種細胞外蛋白酶的基因(npre、apre、epr、bpr、mpr、nprb、vpr和wpra)來工程改造以降低分泌蛋白質(zhì)的蛋白水解降解?？莶菅挎邨U菌菌株wb800n購自mobitec(germany)，并且被修飾以具有以下突變wb800n:pxyla-comk::erm,degu32(hy),δsigf。這個新菌株用作表達宿主。將約1μg從大腸桿菌細胞純化的質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)化至表達菌株中。在轉(zhuǎn)化之后，將100μl培養(yǎng)物涂鋪于4個含有5mg/l氯霉素的lb1.5％瓊脂板上，并且在37℃下孵育16小時。在孵育之后，添加2ml具有5mg/l氯霉素的lb培養(yǎng)基至含有數(shù)千個轉(zhuǎn)化體的各板的表面，并且通過用細胞涂布器刮擦以及混合來將細胞混懸于表面培養(yǎng)基中。將來自4個平行測定的混懸細胞匯合在一起以形成用于表達實驗的預(yù)接種物培養(yǎng)物。168種營養(yǎng)性多肽表達測試。使用板讀取器，由再混懸細胞制得的預(yù)接種物培養(yǎng)物的od600被測量為約20-25。對500ml含有50ml具有5mg/l氯霉素的2xmal培養(yǎng)基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨、10g/l酵母提取物、75g/ld-麥芽糖)的擋板振蕩燒瓶接種以獲得od600≈0.2來形成接種物培養(yǎng)物，并且在30℃下在250rpm下振蕩孵育約6小時。測量od600，并且接種物培養(yǎng)物用于在2l含有250ml具有5mg/l氯霉素、1xteknova微量金屬和0.01％消泡劑204的2xmal培養(yǎng)基的擋板振蕩燒瓶中接種表達培養(yǎng)物以獲得od6000.1。在30℃和250rpm下振蕩培養(yǎng)物18小時，此時收集培養(yǎng)物。對于分泌蛋白質(zhì)文庫構(gòu)建體，測量終末細胞密度，并且通過離心(5000xg，30分鐘，室溫)來收集上清液并使用0.22um過濾器過濾。對于細胞內(nèi)蛋白質(zhì)文庫構(gòu)建體，測量終末細胞密度，并且通過離心(5000xg，30分鐘，室溫)來收集細胞。接著使用微射流機使細胞溶解，并且如果構(gòu)建體文庫具有n末端his標簽，那么使用鎳親和柱純化可溶性部分。否則可溶性部分用于進一步分析。在sds-page凝膠上操作所有樣品，分離成10個部分，接著如下所述使用lc-ms/ms進行分析。168種蛋白質(zhì)中的40種被成功分泌，168種蛋白質(zhì)中的10種在無his標簽下被成功細胞內(nèi)產(chǎn)生，并且168種蛋白質(zhì)中的28種在有5’8xhis標簽下在枯草芽孢桿菌中被成功細胞內(nèi)產(chǎn)生?；诮Y(jié)果，個別地克隆某些基因，并且在枯草芽孢桿菌中測試個別分泌。分泌營養(yǎng)性多肽質(zhì)粒構(gòu)建。對于這個研究，通過以下方式來修飾不具有信號肽的pht43骨架載體：移除samyq信號肽以允許天然信號肽來引導(dǎo)分泌，用apre啟動子取代grac啟動子，移除laci區(qū)域，以及在終止子區(qū)域之前添加1xflag標簽(dykddddk)。來自mobitec的未修飾的pht43載體含有pgrac啟動子、samyq信號肽、amp和cm抗性基因、laci區(qū)域、repa區(qū)域和cole1復(fù)制起點。為擴增目標基因，從野生型芽孢桿菌屬菌株制備基因組dna制備物。使用尾部含有與pht43骨架的25bp同源區(qū)的pcr引物來pcr擴增包括它們的天然信號肽編碼區(qū)的分泌營養(yǎng)性多肽基因，并且在1％瓊脂糖tae凝膠上操作以檢查正確插入物大小。將來自各pcr的10μl一起匯合成單一插入物文庫，并且使混合物gibson連接于pht43骨架載體。將連接物轉(zhuǎn)化至10-β電感受態(tài)細胞(newenglandbiolabs)中，并且將轉(zhuǎn)化的細胞在10-1稀釋度下涂鋪于4個具有100mg/l羧芐青霉素的lb瓊脂板上。使用在啟動子區(qū)域中進行結(jié)合的正向引物和在終止子區(qū)域中進行結(jié)合的反向引物對1個板測序。添加2ml具有100mg/l羧芐青霉素的lb培養(yǎng)基至剩余3個板中。將細胞刮擦并混懸至lb培養(yǎng)基中，并且從細胞混懸物提取質(zhì)粒以形成待轉(zhuǎn)化至表達菌株中的多路質(zhì)粒混合物。類似于168種營養(yǎng)性多肽的文庫菌株構(gòu)建和表達測試來進行分泌多肽文庫菌株構(gòu)建和表達。分泌前導(dǎo)肽文庫構(gòu)建。分泌信號肽文庫促進任何給定目標蛋白質(zhì)的分泌。一種用以增強分泌的方法在于使文庫信號肽序列融合于目標蛋白質(zhì)，并且篩選導(dǎo)致分泌水平最高的那些。此處所述的信號肽文庫由鑒定為與枯草芽孢桿菌中天然sec介導(dǎo)的分泌蛋白質(zhì)相關(guān)的173種信號肽組成(brockmeier等molecularbiology,2006)。以seqid-43136融合于來自解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶的信號肽(samyq)的質(zhì)粒pes1207起始，產(chǎn)生用于seqid-43136的信號肽文庫。pes1207用作以擴增除samyq序列之外的整個質(zhì)粒的引物pfwd和prev進行的pcr反應(yīng)的模板。pfwd和prev擁有具有aari限制位點的尾部，并且純化pcr產(chǎn)物并用aari切割。接著使用antarctic磷酸酶(newenglandbiolabs,beverly,ma)使片段脫磷酸。通過使構(gòu)成各信號肽序列的正向鏈和反向鏈的單鏈寡核苷酸雙鏈化來構(gòu)建編碼個別信號肽的dna。設(shè)計寡核苷酸以使在雙鏈體分子的5’末端形成單鏈尾部。這些尾部互補于通過aari消化載體pcr片段產(chǎn)生的突出部分。為使寡核苷酸雙鏈化，將先導(dǎo)鏈和反向鏈寡核苷酸混合在一起，使用t4多核苷酸激酶(newenglandbiolabs,beverly,ma)來磷酸化并退火。在退火后，在單個管中以相等比例混合信號肽dna序列。使用t4dna連接酶(newenglandbiolabs,beverly,ma)使文庫信號肽連接于載體pcr產(chǎn)物。根據(jù)制造商說明書將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至克隆宿主大腸桿菌turbo(newenglandbiolabs)中。對50-100個菌落測序以確定用于seqid-00298和seqid-00338的前導(dǎo)肽文庫的多樣性。接著將瓊脂板上的菌落混懸于lb培養(yǎng)基中，并且收集以進行質(zhì)粒純化。分泌前導(dǎo)肽文庫菌株構(gòu)建?？莶菅挎邨U菌菌株wb800n(mobitec,germany)用作表達宿主。將約10μg特定蛋白質(zhì)構(gòu)建體的信號肽文庫轉(zhuǎn)化至wb800n中，并且通過涂鋪在含有5.0μg/ml氯霉素(cm5)的lb瓊脂上來在37℃下選擇單一菌落。在已被修飾來在sigf孢子形成因子中具有突變，并且細胞內(nèi)絲氨酸蛋白酶(ispa)也被抗生素標記破壞的枯草芽孢桿菌wb800n中對用于seqid-00105、seqid-00352、seqid-00341、seqid-00103的前導(dǎo)肽文庫進行篩選。所述菌株也具有整合至染色體中以達成較高轉(zhuǎn)化效率的誘導(dǎo)性comk(感受態(tài)起始轉(zhuǎn)錄因子)。分泌前導(dǎo)肽文庫表達篩選?？莶菅挎邨U菌信號肽文庫的400-500個個別轉(zhuǎn)化體用于接種于深孔塊(96方孔)中的具有cm5的2x-mal培養(yǎng)基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨和10g/l酵母提取物、75g/l麥芽糖)的個別1-ml培養(yǎng)物。除信號肽文庫菌株之外，接種含有具有目標蛋白質(zhì)和samyq前導(dǎo)肽的質(zhì)粒的菌株作為對照。培養(yǎng)塊用多孔粘附性板密封物覆蓋，并且在微型表達室(glas-col,terrehaute,in)中在37℃和800rpm下孵育過夜。過夜培養(yǎng)物用于接種于深孔塊中的新鮮2x-malcm5培養(yǎng)物以獲得起始od600＝0.15。在37℃、880rpm下孵育表達培養(yǎng)物直至od600＝1.0(約4小時)，此時通過在最終濃度1mm下添加異丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)以及繼續(xù)孵育4小時來誘導(dǎo)它們。在4小時之后，測量各培養(yǎng)物的細胞密度(od600)，并且通過離心(3000rpm，10分鐘，室溫)來收集細胞。在離心之后，小心移除培養(yǎng)上清液，并且轉(zhuǎn)移至新塊中，并將細胞集結(jié)塊冷凍在-80℃下。為測定分泌蛋白質(zhì)的水平，首先通過0.45μm過濾器，隨后通過0.22μm過濾器來過濾0.5-ml培養(yǎng)上清液等分試樣。接著如本文所述通過芯片電泳來測定濾液以測定分泌目標蛋白質(zhì)(poi)的水平，并且與基礎(chǔ)構(gòu)建體的分泌水平進行比較。稀釋的過夜培養(yǎng)物用作含有cm5的lb肉湯培養(yǎng)物的接種物。使這些培養(yǎng)物在37c下生長直至它們達到對數(shù)期。使這些培養(yǎng)物的等分試樣與甘油(20％最終濃度)混合，并且冷凍在-80℃下。接著使用instagene基質(zhì)(biorad,usa)純化前10-15名命中物，并且圍繞信號肽進行擴增并送去測序以鑒定信號肽序列。表e14a.枯草芽孢桿菌前導(dǎo)肽文庫篩選的示例性結(jié)果。實施例15.在黑曲霉真菌中表達營養(yǎng)性多肽?；蚝铣珊唾|(zhì)粒構(gòu)建。使用根據(jù)黑曲霉cbs513.88的基因組序列設(shè)計的引物，pcr擴增來自黑曲霉atcc64974的編碼天然分泌蛋白質(zhì)的基因。在一個實例中，基因包括天然5’分泌序列，并且在直接受控于來自構(gòu)巢曲霉的gpda啟動子下，在添加c末端3xflag標簽(dykdhdgdykdhdidykddddk)下克隆至表達載體pan56-1(genbank：z32700.1)中。在另一實例中，基因僅包括添加有異源性5’分泌信號的成熟肽。使用gibson組裝試劑盒(newenglandbiolabs,beverly,ma)構(gòu)建質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)化至曲霉屬宿主中之前，對重組質(zhì)粒進行序列驗證。從bccm/lmbp(ghent,netherlands)獲得pfglahil6t。使用gibson組裝試劑盒(newenglandbiolabs,beverly,ma)構(gòu)建質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)化至曲霉屬宿主中之前，對重組質(zhì)粒進行序列驗證。使用根據(jù)黑曲霉atcc1015的基因組序列設(shè)計的引物，pcr擴增來自黑曲霉atcc64974的pyra營養(yǎng)性標記。pyrapcr片段用xbai消化，并且連接至pcsn44(staben等,1989)的xbai片段中以構(gòu)建pes1947。從bccm/lmbp(ghent,netherlands)獲得pcsn44。在轉(zhuǎn)化至曲霉屬宿主中之前，對重組質(zhì)粒進行序列驗證。菌株構(gòu)建。黑曲霉的蛋白酶缺乏性衍生物atcc62590用作表達宿主。使用如punt等,1992,methodsinenzymology,216,447-457中所述的原生質(zhì)體方法，使表達載體與pes1947共同轉(zhuǎn)化。將約5ug各質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至黑曲霉原生質(zhì)體中。在補充以1.2m山梨糖醇和1.5％細菌瓊脂的基本培養(yǎng)基(10g/l葡萄糖、4g/l硝酸鈉、20ml/l鹽溶液(含有26.2g/l氯化鉀和74.8g/l磷酸二氫鉀，在ph5.5下)、1ml/l維生素溶液(含有100mg/l鹽酸吡哆辛、150mg/l鹽酸硫胺、750mg/l4-氨基苯甲酸、2.5g/l煙酸、2.5g/l核黃素、20g/l氯化膽堿和30mg/l生物素)和1ml/l金屬溶液(含有20g/l硫酸鋅七水合物(znso4-7h2o)、11g/l硼酸(h3bo3)、5g/l氯化錳(ii)四水合物(mncl2-4h2o)、5g/l硫酸鐵(ii)七水合物(feso4-7h2o)、1.7g/l氯化鈷(ii)六水合物(cocl2-6h2o)、1.6g/l硫酸銅(ii)五水合物(cuso4-5h2o)、1.5g/l鉬酸鈉二水合物(namoo4-2h2o)和5.0g/ledta二鈉鹽二水合物(na2edta-2h2o)，在ph6.5下))上選擇轉(zhuǎn)化體。在基本培養(yǎng)基板上分離個別轉(zhuǎn)化體，并且使其在30c下生長直至它們形成孢子。將孢子收集于水中，并且儲存在4c下。表達測試。將黑曲霉菌株的孢子儲備物在106個孢子/毫升下接種至于24孔方底深孔塊中的2ml用40mmmes調(diào)整至ph7的cm(mm加5.0g/l酵母提取物、2.0g/l酪蛋白氨基酸)和sigmafast蛋白酶抑制劑混合物(1片/100ml，sigmaaldrich)中。培養(yǎng)塊用多孔粘附性板密封物覆蓋，并且在微型表達室(glas-col,terrehaute,in)中在30℃下在600rpm下孵育48小時。在生長時期之后，首先通過25μm/0.45μm雙級過濾器，隨后通過0.22μm過濾器來過濾0.5ml培養(yǎng)上清液等分試樣。接著測定濾液以測定分泌目標蛋白質(zhì)(poi)的水平。表e15a.曲霉屬前導(dǎo)肽文庫篩選的示例性結(jié)果。黑曲霉信號肽文庫構(gòu)建。難以預(yù)測哪種分泌信號肽將最佳促進任何給定目標蛋白質(zhì)的分泌。因此，一種用以優(yōu)化分泌的方法在于使文庫信號肽序列融合于蛋白質(zhì)，并且篩選導(dǎo)致分泌水平最高的那些。我們構(gòu)建了用于seqid-00409和seqid-00420的信號肽文庫。表e15a顯示與seqid-00409和seqid-00420融合的信號肽。通過使構(gòu)成各信號肽序列的正向鏈和反向鏈的單鏈寡核苷酸雙鏈化來構(gòu)建編碼個別信號肽的dna。設(shè)計寡核苷酸以使在雙鏈體分子的5’末端形成單鏈尾部。使用根據(jù)黑曲霉cbs513.88的基因組序列設(shè)計的引物，pcr擴增來自黑曲霉atcc64974的編碼天然分泌蛋白質(zhì)seqid-00409和seqid-00420的基因?；虬ㄌ烊?’分泌序列，并且在直接受控于來自構(gòu)巢曲霉的gpda啟動子下，在添加c末端3xflag標簽(dykdhdgdykdhdidykddddk)下克隆至表達載體pan56-1(genbank：z32700.1)中。接著在無天然信號肽下擴增載體，并且使用gibson組裝試劑盒(newenglandbiolabs,beverly,ma)以雙鏈體信號肽序列重建具有不同信號肽的質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)化至曲霉屬宿主中之前，對重組質(zhì)粒進行序列驗證。使用根據(jù)黑曲霉atcc1015的基因組序列設(shè)計的引物，pcr擴增來自黑曲霉atcc64974的pyra營養(yǎng)性標記。pyrapcr片段用xbai消化，并且連接至pcsn44(staben等,1989)的xbai片段中以構(gòu)建pes1947。從bccm/lmbp(ghent,netherlands)獲得pcsn44。在轉(zhuǎn)化至曲霉屬宿主中之前，對重組質(zhì)粒進行序列驗證。黑曲霉信號肽文庫菌株構(gòu)建。黑曲霉的蛋白酶缺乏性衍生物atcc62590用作表達宿主。使用如punt等,1992中所述的原生質(zhì)體方法，使各信號肽-基因組合載體與含有營養(yǎng)性標記pyrg的質(zhì)粒個別地共同轉(zhuǎn)化。將約5ug各質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至黑曲霉原生質(zhì)體中。在補充以1.2m山梨糖醇和1.5％細菌瓊脂的基本培養(yǎng)基(10g/l葡萄糖、4g/l硝酸鈉、20ml/l鹽溶液(含有26.2g/l氯化鉀和74.8g/l磷酸二氫鉀，在ph5.5下)、1ml/l維生素溶液(含有100mg/l鹽酸吡哆辛、150mg/l鹽酸硫胺、750mg/l4-氨基苯甲酸、2.5g/l煙酸、2.5g/l核黃素、20g/l氯化膽堿和30mg/l生物素)和1ml/l金屬溶液(含有20g/l硫酸鋅七水合物(znso4-7h2o)、11g/l硼酸(h3bo3)、5g/l氯化錳(ii)四水合物(mncl2-4h2o)、5g/l硫酸鐵(ii)七水合物(feso4-7h2o)、1.7g/l氯化鈷(ii)六水合物(cocl2-6h2o)、1.6g/l硫酸銅(ii)五水合物(cuso4-5h2o)、1.5g/l鉬酸鈉二水合物(namoo4-2h2o)和5.0g/ledta二鈉鹽二水合物(na2edta-2h2o)，在ph6.5下))上選擇轉(zhuǎn)化體。在基本培養(yǎng)基板上分離個別轉(zhuǎn)化體，并且使其在30c下生長直至它們形成孢子。黑曲霉信號肽文庫表達測試。將由各構(gòu)建體獲得的6個不同原代轉(zhuǎn)化體接種至于96深孔培養(yǎng)塊中的用160mmmes調(diào)整至ph7的補充以5.0g/l酵母提取物、2.0g/l酪蛋白氨基酸的如上定義的1ml基本培養(yǎng)基中。培養(yǎng)塊用多孔粘附性板密封物覆蓋，并且在微型表達室(glas-col,terrehaute,in)中在33℃下在800rpm下孵育48小時。在生長時期之后，首先通過25μm/0.45μm雙級過濾器，隨后通過0.22μm過濾器來過濾0.5ml培養(yǎng)上清液等分試樣。接著使用如下所述的芯片電泳或如下所述的抗flag斑點印跡和sds-page分析過濾的上清液?；谶@些結(jié)果，在基本培養(yǎng)基板上分離顯示分泌高于天然信號肽的原代轉(zhuǎn)化體，并且使其在30℃下生長直至它們形成孢子。將以上黑曲霉菌株的孢子儲備物以及含有具有pgpda啟動子以及seqid-00409和seqid-00424的天然信號肽的表達構(gòu)建體的對照黑曲霉菌株在106個孢子/毫升下接種至于125ml塑料瓶中的用160mmmes調(diào)整至ph7的補充以5.0g/l酵母提取物、2.0g/l酪蛋白氨基酸的如上定義的10ml基本培養(yǎng)基中。接著使曲霉屬孢子在30℃下在150rpm下生長2天。在生長時期之后，首先通過25μm/0.45μm雙級過濾器，隨后通過0.22μm過濾器來過濾培養(yǎng)上清液等分試樣。接著如本文所述使用sds-page來分析濾液。圖5說明相較于天然信號肽，在新信號肽下，seqid-00409(左)和seqid-00420(右)的分泌。黑曲霉異源性營養(yǎng)性多肽基因合成和質(zhì)粒構(gòu)建。合成編碼營養(yǎng)性多肽的基因(geneart,lifetechnologies)?；蜥槍υ诤谇怪斜磉_加以密碼子優(yōu)化。pcr擴增合成基因，并且在受控于來自構(gòu)巢曲霉的gpda啟動子下，在添加c末端3xflag標簽(dykdhdgdykdhdidykddddk)和在葡糖淀粉酶基因與目標基因之間的克欣蛋白酶(kexinprotease)位點(nviskr)下克隆至融合于具有它的天然前導(dǎo)序列的葡糖淀粉酶的表達載體pan56-1(genbank：z32700.1)中。使用gibson組裝試劑盒(newenglandbiolabs,beverly,ma)構(gòu)建質(zhì)粒。在轉(zhuǎn)化至曲霉屬宿主中之前，對重組質(zhì)粒進行序列驗證。利用seqid-00087、seqid-00103、seqid-00105、seqid-00115、seqid-00218、seqid-00298、seqid-00302、seqid-00341、seqid-00352、seqid-00354基因。黑曲霉異源性營養(yǎng)性多肽菌株構(gòu)建。黑曲霉的蛋白酶缺乏性衍生物d15#26(e.karnaukhova等,microbialcellfactories,6:34)用作表達宿主。使用punt等,1992,methodsinenzymology,216,447-457中所述的原生質(zhì)體方法，使10ug表達載體與1ug含有pyrg選擇標記的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化。在含有10g/l葡萄糖、6g/l硝酸鈉、20ml/l鹽溶液(含有26g/l氯化鉀和76g/l磷酸二氫鉀，在ph5.5下)、2mm硫酸鎂、1ml/l維生素溶液(含有100mg/l鹽酸吡哆辛、150mg/l鹽酸硫胺、750mg/l4-氨基苯甲酸、2.5g/l煙酸、2.5g/l核黃素、20g/l氯化膽堿和30mg/l生物素)和1ml/l金屬溶液(含有20g/l硫酸鋅七水合物(znso4-7h2o)、11g/l硼酸(h3bo3)、5g/l氯化錳(ii)四水合物(mncl2-4h2o)、5g/l硫酸鐵(ii)七水合物(feso4-7h2o)、1.7g/l氯化鈷(ii)六水合物(cocl2-6h2o)、1.6g/l硫酸銅(ii)五水合物(cuso4-5h2o)、1.5g/l鉬酸鈉二水合物(namoo4-2h2o)和5.0g/ledta二鈉鹽二水合物(na2edta-2h2o)，在ph6.5下)，并且補充以1.2m山梨糖醇和1.5％細菌瓊脂的基本培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。在基本培養(yǎng)基板上分離個別轉(zhuǎn)化體，并且使其在30c下生長直至它們形成孢子。將孢子收集于水中，儲存在4c下。黑曲霉異源性營養(yǎng)性多肽表達測試。將由各構(gòu)建體獲得的90個不同原代轉(zhuǎn)化體接種至于96深孔培養(yǎng)塊中的補充以1g/l酪蛋白氨基酸的如上定義的1ml基本培養(yǎng)基中(第1mtp)。培養(yǎng)塊用多孔粘附性板密封物覆蓋，并且在微型表達室(glas-col,terrehaute,in)中在33℃下在800rpm下孵育72小時。在生長時期之后，首先通過25μm/0.45-μm雙級過濾器，隨后通過0.22μm過濾器來過濾0.5-ml培養(yǎng)上清液等分試樣。如本文所述使用抗flagelisa方法測定濾液以測定分泌目標蛋白質(zhì)(poi)的水平。由排除seqid-00302的9個表達構(gòu)建體獲得的至少5個菌落在抗flagelisa中產(chǎn)生陽性信號，如表e15b中所報道。也將來自9個表達菌株中的各個的在抗flagelisa測定中顯示陽性信號的至少5個原代轉(zhuǎn)化體劃線于新鮮基本培養(yǎng)基瓊脂板上以達成單一孢子純化，并且再測試以進行確認(第2mtp)。從板收集孢子，并且用新鮮孢子收獲物以約1e9個孢子/毫升的密度進行接種。添加10ul這些孢子收獲物至10ml基本培養(yǎng)基中，從而產(chǎn)生1e6個孢子/毫升的起始密度。接著使曲霉屬孢子在33c下在150rpm下生長3天。在生長時期之后，首先通過25μm/0.45-μm雙級過濾器，隨后通過0.22μm過濾器來過濾培養(yǎng)上清液等分試樣。接著使用下述抗flagelisa、抗flag蛋白質(zhì)印跡和sds-page分析濾液。使用新鮮孢子收獲物，以最終密度約1e6個孢子/毫升，使由不同表達構(gòu)建體獲得的某些克隆在1升基本培養(yǎng)基中生長。接著使曲霉屬孢子在33c下在150rpm下生長3天。在生長時期之后，首先通過25μm/0.45-μm雙級過濾器，隨后通過0.22μm過濾器來過濾培養(yǎng)上清液等分試樣。接著使用下述抗flagelisa、抗flag蛋白質(zhì)印跡和sds-page分析濾液。來自1升振蕩燒瓶的在抗flagelisa中高于39mg/l的任何分泌蛋白質(zhì)都被抗flag蛋白質(zhì)印跡和sds-page檢測到。表e15b說明黑曲霉中不同蛋白質(zhì)分泌的抗flagelisa結(jié)果和抗flag蛋白質(zhì)印跡結(jié)果實施例16.在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中表達營養(yǎng)性多肽?；蚝铣珊唾|(zhì)粒構(gòu)建。合成制備(geneart,lifetechnologies)所有基因，并且針對在智人中表達加以優(yōu)化。選擇編碼seqid-00001、seqid-00103、seqid-00105、seqid-00298和seqid-00363的基因用于在哺乳動物細胞中分泌。使所有基因都與來自ig-κ蛋白質(zhì)的5’信號肽序列(metdtlllwvlllwvpgstgd)和3’末端的hhhhhhhh標簽融合。將所有基因構(gòu)建體都在pcmv啟動子的下游，在多克隆位點nhei和bamhi中克隆至pcdna3.1(+)載體(lifetechnologies)中。所有基因序列都在起始密碼子的上游含有g(shù)cc序列以產(chǎn)生gccatggkozak序列。將所有質(zhì)粒都轉(zhuǎn)化于大腸桿菌中，進行序列驗證，并且純化10mg各質(zhì)粒以用于向哺乳動物細胞中轉(zhuǎn)染。菌株構(gòu)建。選擇用于實驗的細胞系是2個來自invitrogen的短暫株系freestyletmcho-s細胞(pn51-4448)和freestyletm293f細胞(pn51-0029)。細胞系從invitrogen接收，并且儲存在液氮中直至啟始亞培養(yǎng)。對于在轉(zhuǎn)染之前的亞培養(yǎng)，使細胞解凍至特定培養(yǎng)基中：使cho-s細胞解凍至30ml補充以8mmglutamax(invitrogenpn35050-061)和1xht(invitrogenpn11067-030)的freestyletmcho表達培養(yǎng)基(invitrogenpn12651-014)中。使293f細胞解凍至30mlfreestyletm293表達培養(yǎng)基(invitrogenpn12338-018)中。使細胞在80％濕度、8％二氧化碳、36.5℃下，在每分鐘110轉(zhuǎn)振蕩下混懸恢復(fù)72小時。使細胞的活細胞密度(vcd)從不超過2.0x106個細胞/毫升轉(zhuǎn)變?yōu)?.2x106個細胞/毫升。在轉(zhuǎn)染之前持續(xù)亞培養(yǎng)5代。在轉(zhuǎn)染之前26小時，使培養(yǎng)物于60ml的體積中轉(zhuǎn)變回0.6x106個活細胞/毫升。一式兩份轉(zhuǎn)染各營養(yǎng)性多肽，其中對于各細胞系進行2個模擬轉(zhuǎn)染作為對照。在轉(zhuǎn)染當天，對細胞計數(shù)，并且測定為在1.1x106個細胞/毫升下，其中活力大于98％。轉(zhuǎn)染程序。制備用于120ml總體積(60ml/250ml振蕩燒瓶)轉(zhuǎn)染的dna-脂質(zhì)復(fù)合物。在層流通風(fēng)櫥中進行以下程序。將150μg質(zhì)粒dna稀釋至optiprotmsfm降血清培養(yǎng)基(invitrogenpn：12307-050)中以獲得總體積2.4ml。溫和混合這個溶液，并且進行0.2μm過濾滅菌。將150ulfreestyletmmax試劑(invitrogenpn16447-100)于optiprotmsfm降血清培養(yǎng)基中稀釋至總體積2.4ml，溫和混合，并且在室溫下孵育5分鐘。在孵育5分鐘之后，添加2.4ml稀釋的dna至2.4ml稀釋的試劑中，溫和混合，并且在室溫下孵育20分鐘以形成dna-脂質(zhì)復(fù)合物。在孵育20分鐘之后，添加2.4ml復(fù)合物至各一式兩份燒瓶中。對照燒瓶接收2.4mloptiprotmsfm降血清培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染的燒瓶放置回在80％濕度、8％二氧化碳、36.5℃下，在每分鐘110轉(zhuǎn)振蕩下的孵育振蕩器中。監(jiān)測培養(yǎng)物的活力％和vcd。在第3天所有燒瓶都補充以在各細胞系特異性的培養(yǎng)基中制備的20％植物蛋白胨補料。燒瓶中的植物蛋白胨的最終濃度等于2％。在第4天通過離心來收集培養(yǎng)物，并且對上清液進行0.2um過濾。在非還原性sds-page12％bis-tris凝膠上操作上清液以確認營養(yǎng)性多肽在各分子量下表達。seqid-00001、seqid-00103、seqid-00105和seqid-00298被確認為由293f細胞表達，但在任何cho-s培養(yǎng)物中都不可檢測到可見條帶。在凝膠上不可觀察到來自293f或cho-s培養(yǎng)物的seqid-00363。通過imac純化來自293f培養(yǎng)物的seqid-00001、seqid-00103、seqid-00105、seqid-00298和seqid-00363上清液以及cho-sseqid-00103和seqid-00105上清液。使用293f細胞，于1l振蕩燒瓶中，將seqid-00103、seqid-00105和seqid-00298按比例擴大至190ml轉(zhuǎn)染體積。也相應(yīng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染程序。操作seqid-00103與seqid-00105兩者的4x190ml培養(yǎng)物以及seqid-00298的2x190ml培養(yǎng)物。在第2天，這些培養(yǎng)物以用以在培養(yǎng)物中獲得2％的最終濃度的20％植物蛋白胨補料來補料，并且在第5天進行收集。實施例17:營養(yǎng)性多肽表達分析。使用多種方法檢測細胞內(nèi)表達和/或分泌的營養(yǎng)性多肽。這些方法包括電泳、蛋白質(zhì)印跡、斑點印跡、elisa和定量lc/ms/ms。電泳分析。通過芯片電泳(labchipgxii)或sds-page分析來分析細胞外和/或細胞內(nèi)表達的蛋白質(zhì)以評估表達水平。對于sds-page，將于與5％β-巰基乙醇混合的invitrogenlds樣品緩沖液中的10μl樣品煮沸，并且裝載于：1)12％bis-tris凝膠(lifetechnologies)，或2)16％三(羥甲基)甲基甘氨酸凝膠(lifetechnologies)上，并使用標準制造商方案進行操作。使用標準制造商方案，利用simplybluetmsafestain(lifetechnologies)將凝膠染色，并且使用moleculargeldoctmxr+系統(tǒng)(bio-rad)進行成像。通過相對于分子量標記和對照培養(yǎng)物進行比較來鑒定過度表達的異源性蛋白質(zhì)。對于芯片電泳(labchipgxii)，使用ht低分子量蛋白質(zhì)表達試劑盒(遵循制造商方案)，通過添加2μl樣品至7μl樣品緩沖液中來分析樣品。對于分子量測定和定量(分子量以kda計)，每12個樣品裝載1個蛋白質(zhì)階梯。lc-ms/ms分析?？墒褂胠c-ms/ms分析全細胞、細胞溶解產(chǎn)物和分泌樣品的蛋白質(zhì)表達。為分析樣品，將10μg樣品裝載于10％sds-page凝膠(invitrogen)上，并且分離約2cm。將凝膠切成10個區(qū)段，并且通過依次用25mm碳酸氫銨和乙腈洗滌來處理凝膠切片。凝膠切片接著在60℃下用10mm二硫蘇糖醇還原，隨后在室溫下用50mm碘乙酰胺進行烷基化。最后，樣品用胰蛋白酶(promega)在37℃下消化4小時，并且以添加甲酸來使消化淬滅。上清液樣品接著用聯(lián)接于thermofisherqexactive的watersnanoacquityhplc系統(tǒng)，通過納米lc/ms/ms來分析。將肽裝載于捕集柱上，并且歷經(jīng)75μm分析柱在350nl/min下洗脫；兩個柱均填充有jupiterproteo樹脂(phenomenex)。采用1小時梯度。以數(shù)據(jù)依賴性模式操作質(zhì)譜儀，其中ms和ms/ms分別在70,000fwhm分辨率和17,500fwhm分辨率下在orbitrap中進行。15種最豐富的離子被選擇用于ms/ms。使用mascot相對于適當數(shù)據(jù)庫搜索數(shù)據(jù)以鑒定肽。將mascotdat文件解析至scaffold軟件中以進行驗證，過濾，并且創(chuàng)建每個樣品的非冗余清單。在1％蛋白質(zhì)和肽假發(fā)現(xiàn)率(fdr)以及每種蛋白質(zhì)要求至少兩種獨特肽下過濾數(shù)據(jù)?？筬lag蛋白質(zhì)印跡。使用蛋白質(zhì)印跡分析細胞外和/或細胞內(nèi)蛋白質(zhì)以評估表達水平。對于sds-page，將于與5％β-巰基乙醇混合的invitrogenlds樣品緩沖液中的10μl樣品煮沸，并且裝載于12％bis-tris凝膠(lifetechnologies)上。對于標準物，0.5μg至2μg氨基末端flag-baptm融合蛋白(sigma)被裝載作為陽性對照。根據(jù)制造商方案進行凝膠電泳。一旦操作，即根據(jù)制造商方案將凝膠轉(zhuǎn)移于小型轉(zhuǎn)移堆積層硝化纖維素0.2μm孔徑膜(lifetechnologies)上。接著，從堆積層移除硝化纖維素膜，并且匯集至milliporesnap2.0蛋白質(zhì)檢測裝置中。將30mlmilliporeblokch消噪試劑放置至裝配的儲集器托盤中，并且使真空穿過。通過將2μlsigma單克隆抗m2-過氧化物酶(hrp)抗體稀釋至3mlmilliporeblokch消噪試劑中來制備3ml抗體溶液。添加抗體溶液至儲集器托盤中，并且使其在無真空下孵育10分鐘。在孵育之后，儲集器托盤用90ml1xpbs+0.1％吐溫20填充，并且使真空穿過來作為最終洗滌步驟。在洗滌之后，移除硝化纖維素膜，并且放置至試劑托盤中。添加20mlmilliporeluminataclassicowesternhrp底物，并且使其孵育1分鐘。在孵育之后，將膜放置至geldoctmxr+系統(tǒng)(bio-rad)的成像托盤中，并且使用化學(xué)發(fā)光方案來成像?？筬lag斑點印跡。使用斑點印跡分析細胞外和/或細胞內(nèi)蛋白質(zhì)以評估表達水平。使110μl0.2μm過濾的樣品與110μl8.0m鹽酸胍、0.1m磷酸鈉(變性緩沖液)混合以允許達成均勻蛋白質(zhì)結(jié)合。于與樣品相同的基質(zhì)中，以2μg起始，連續(xù)2倍稀釋至0.0313μg來制取氨基末端flag-baptm融合蛋白(sigma)的標準曲線。使invitrogen0.45μm硝化纖維素膜于1xpbs緩沖液中預(yù)濕潤5分鐘，接著裝載于bio-rad斑點印跡裝置上。使真空穿過300μlpbs以使膜進一步濕潤。接著，將200μl1:1樣品:變性緩沖液混合物裝載至各孔中，并且使其靠重力穿過斑點印跡裝置排放30分鐘。接著，通過真空對所有孔進行300μlpbs洗滌，隨后裝載300μlmilliporeblokch消噪試劑并孵育60分鐘。在阻斷之后，用300μl1xpbs+0.1％吐溫20洗滌膜。接著，通過將2.4μlsigma單克隆抗m2-過氧化物酶(hrp)抗體添加至12mlmilliporeblokch消噪試劑中(1:5000稀釋)來制備抗體溶液。添加100μl所得抗體溶液至各孔中，并且使其靠重力孵育30分鐘。在抗體孵育之后，通過真空用300μl1xpbs+0.1％吐溫20進行3次最終洗滌。在洗滌之后，移除硝化纖維素膜，并且放置至試劑托盤中。添加20mlmilliporeluminataclassicowesternhrp底物，并且使其孵育1分鐘。在孵育之后，將膜放置至geldoctmxr+系統(tǒng)(bio-rad)的成像托盤中，并且使用化學(xué)發(fā)光方案來成像?？筬lagelisa。使用抗flag抗體，通過直接elisa來檢測蛋白質(zhì)表達。簡要來說，于0.1mnahco3(ph9.5)中制備一系列稀釋(0.005-10μg/ml)flag融合蛋白(sigma)。也于由空真菌培養(yǎng)獲得的用過的培養(yǎng)基中制備一系列稀釋(0.01-20μg/ml)flag融合蛋白，所述培養(yǎng)基于0.1mnahco3(ph9.5)中稀釋10倍。實驗培養(yǎng)基樣品于0.1mnahco3(ph9.5)中稀釋10倍。接著將flag融合蛋白稀釋系列和實驗樣品轉(zhuǎn)移(0.2ml)至nunc-immunotmmaxisorptm(thermo)96孔板的各孔中，并且在2-8℃下孵育過夜以促進蛋白質(zhì)吸附。次日早晨，用含有0.05％吐溫80的tris緩沖鹽水(tbs)(tbst)沖洗各板3次。通過與0.2ml溶解于tbst中的1％脫脂奶粉一起在室溫下孵育1小時來阻斷各孔免遭非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合。各板用tbst再沖洗3次，接著在室溫下與0.2ml于阻斷緩沖液中1:2000稀釋的單克隆抗體抗flagm2-hrp(sigma)一起孵育1小時。各板再次用tbst再沖洗3次，隨后與0.2ml/孔的sigmafasttm二鹽酸鄰苯二胺(opd)(sigma)一起在室溫下孵育30分鐘。以添加0.05ml/孔的1mhcl終止反應(yīng)，并且在配備有板讀取器的分光光度計上在492nm下測量樣品的吸光度。實施例18.營養(yǎng)性多肽的治療性液體制劑。出于治療目的以多種液體制劑形式施用營養(yǎng)性多肽序列。舉例來說，所用制劑的差異在于蛋白質(zhì)濃度、溶液ph、存在或不存在顆粒、礦物質(zhì)、促味劑和/或賦形劑添加劑。在治療性液體制劑中，蛋白質(zhì)在溶液中的濃度在0.1％至60％w/w的范圍內(nèi)。在某些情況下，較低濃度是優(yōu)選的。舉例來說，seqid-00105已低至10％來給藥。在一些情況下，較高濃度是優(yōu)選的。舉例來說，seqid-00105和seqid-00363以35％溶液形式來給藥。在一些情況下，營養(yǎng)性多肽序列在它的最大溶解度下給藥，所述最大溶解度隨蛋白質(zhì)而變化，并且通常在0.1％至60％w/w的范圍內(nèi)。在50％w/w下，在溶液中，seqid-00105與seqid-00363兩者均顯示為可溶性液體。在治療性液體制劑中，溶液ph通常在2至11的范圍內(nèi)。已知蛋白質(zhì)溶解度隨溶液ph強烈變化(c.tanford,physicalchemistryofmacromolecules,第242頁,wiley,newyork,1961.)。在大多數(shù)情況下，營養(yǎng)性多肽序列在它們的等電點(pi)下的溶解度最小，并且因此溶液ph常被調(diào)整至高于或低于營養(yǎng)性多肽序列的pi。這個ph調(diào)節(jié)允許控制蛋白質(zhì)溶解度。舉例來說，seqid-00105和seqid-00363具有接近4的等電點。這些營養(yǎng)性多肽序列被故意配制在ph8-9下，因此它們將處于高于它們的pi。舉例來說，seqid-00587具有pi9.7，并且被故意配制在ph7下，以使它將處于低于它的pi。在它們的pi下可溶的營養(yǎng)性多肽可被配制在它們的pi下以使液體制劑不需要額外緩沖物質(zhì)來維持溶液ph。在這個情況下，蛋白質(zhì)自身起使溶液ph緩沖的作用，因為它的自身氨基酸被質(zhì)子化和去除質(zhì)子化。當添加酸或堿時，在蛋白質(zhì)的pi下配制的蛋白質(zhì)溶液顯示對ph變化具有抗性，從而指示溶液實際上通過蛋白質(zhì)自身來緩沖。在一些治療性液體制劑中，營養(yǎng)性多肽包括顆粒物質(zhì)。顆粒物質(zhì)為眼睛可見，和/或它含有顯微可見顆粒(實例是可溶性聚集體)。顆粒物質(zhì)與產(chǎn)品相關(guān)，和/或它是外來的。顆粒物質(zhì)混懸存在，以漿液形式存在，和/或沉降在溶液底部。在一些實施方案中，顆粒物質(zhì)是合乎需要的，因為其中它在胃中不可消化或可緩慢消化，它充當向腸遞送營養(yǎng)性多肽的載體。在一些實施方案中，顆粒物質(zhì)在液體制劑中是合乎需要的，因為它允許以高于營養(yǎng)性多肽的溶解度限度來用營養(yǎng)性多肽給藥。在seqid-00105的情況下，不存在可見顆粒物質(zhì)。seqid-00424在混懸有顆粒物質(zhì)下給藥。在治療性液體制劑中，營養(yǎng)性多肽序列通常與一種或多種溶解于制劑中的賦形劑一起配制。出于特定目的包括各賦形劑。添加緩沖劑(實例：tris、磷酸鹽、碳酸氫銨、碳酸鈉、乙酸鹽、檸檬酸鹽、精氨酸)以控制溶液ph。添加糖以控制聚集和溶解度(實例：海藻糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇)。添加去污劑以控制溶解度和聚集(實例是吐溫、triton、chaps和脫氧膽酸鹽)。添加多元醇以控制溶解度和聚集(甘油、peg)。添加離液劑以增加蛋白質(zhì)溶解度(實例是硫氰酸鹽和尿素)。添加抗氧化劑以防止蛋白質(zhì)氧化(實例是抗壞血酸和甲硫氨酸)。添加鹽以增加蛋白質(zhì)溶解度和/或?qū)崿F(xiàn)所需重量摩爾滲透濃度(實例是氯化鈉)。seqid-00105、seqid-00363、seqid-00426被配制于磷酸鈉和氯化鈉中，并且口服給藥。seqid-00587和seqid-00559被配制于碳酸氫銨中，并且口服給藥。seqid-00240被配制于碳酸鈉中，并且口服給藥。添加促味劑至營養(yǎng)性多肽中以增強使用者的味覺感受，獲得成功結(jié)果。根據(jù)tang等(tangje,mooredr,kujbidagw,tarnopolskyma,phillipssm.japplphysiol(1985).2009年9月；107(3):987-92)與三氯蔗糖組合添加香草提取物。增強調(diào)味劑的定性益處由使用者記載為“相當愉快”。兩個表表e18a和表e18b概述向人和向大鼠的許多營養(yǎng)性多肽施用。表e18a.用于人施用的營養(yǎng)性多肽的治療性液體制劑。表e18b.用于人施用的營養(yǎng)性多肽的治療性液體制劑。實施例19.營養(yǎng)性多肽的治療性制劑。作為可溶性均質(zhì)液體制劑的替代方案，可替代地制備營養(yǎng)性多肽。這個實施例描述替代性營養(yǎng)性多肽制劑，諸如漿液、凝膠劑、片劑和食物成分。漿液制劑。漿液是含有可溶性物質(zhì)與通常在溶液中顯現(xiàn)為精細顆粒的不溶性物質(zhì)兩者的半液體混合物。當營養(yǎng)性多肽在高于它的最大溶解度下濃縮時，或當營養(yǎng)性多肽的凍干或冷凍干燥制劑在高于它的最大溶解度下再混懸時，制備營養(yǎng)性多肽漿液。任選地，在0.1–1％之間的濃度下添加諸如大豆卵磷脂的乳化劑的添加物以穩(wěn)定漿液的均質(zhì)性(vannieuwenhuyzen等,1999eur.journaloflipidsci.andtech.)。凝膠制劑?；蛘?，將營養(yǎng)性多肽配制成凝膠劑。凝膠劑是通常通過分子交聯(lián)形成的固體膠質(zhì)樣制劑。通過用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(ec編號2.3.2.13)處理來將營養(yǎng)性多肽配制成凝膠劑。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可催化營養(yǎng)性多肽在肽結(jié)合的谷氨酰胺殘基的g-羧酰胺基團與營養(yǎng)性多肽結(jié)合的賴氨酸殘基的e-氨基之間交聯(lián)。這個g-谷氨酰基-e-賴氨酸形成使蛋白質(zhì)在溶液中交聯(lián)；由此促進凝膠形成。人轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是一種鈣(ca2+)依賴性酶，對鈣的kd在0.3-3um的范圍內(nèi)(ahvazi等,2003journalofbiologicalchemistry)。由于鈣在營養(yǎng)性多肽的制劑中的沉淀作用，已鑒定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的微生物(茂原鏈霉菌(streptomycesmobaraensis))直系同源物，其以鈣非依賴性方式起作用(ando等,1989agricbiolchem)。為制備營養(yǎng)性多肽的凝膠狀制劑，在中性ph下在250g/l下可溶性配制營養(yǎng)性多肽。在每g營養(yǎng)性多肽10eu下將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶外加至制劑中，并且使其在35℃下反應(yīng)直至已發(fā)生足夠凝膠形成(chen等,2003biomaterials)。片劑制劑。根據(jù)sakarkar等2009(internationaljournalofappliedpharmaceutics)來實現(xiàn)對營養(yǎng)性多肽的固體片劑的制備。將片劑配制成營養(yǎng)性多肽、賦形劑和粘合劑的混合物。片劑由50％w/w營養(yǎng)性多肽、26％w/w微晶纖維素、7.5w/w碳酸氫鈉-檸檬酸混合物(70:30)、6.5％w/w乳糖、5.5％w/w硬脂酸鎂組成，并且由4.5％w/w聚乙烯吡咯烷酮異丙醇溶液結(jié)合。在壓制成100mg片劑之前，將片劑去濕并?；?。片劑用12.5％w/w乙基纖維素的二氯甲烷和鄰苯二甲酸二乙酯(作為塑化劑)溶液包覆。可吸入干燥粉末。如lucas等,1998pharmres中所述配制營養(yǎng)性多肽來以可吸入干燥粉末形式施用。通過噴霧干燥來將營養(yǎng)性蛋白質(zhì)與麥芽糖糊精一起共同加工以產(chǎn)生模型蛋白質(zhì)粒子。接著通過翻轉(zhuǎn)混合蛋白質(zhì)粉末與α-乳糖單水合物(63-90μm)或含有2.5與10％w/w之間的細粒乳糖(fpl)或微?；垡叶?000的改進乳糖來制備氣霧劑制劑。接著在粒度分布、形態(tài)和粉末流動方面表征粉末摻合物。常規(guī)食物制劑。將營養(yǎng)性多肽作為食物成分配制成干燥固體制劑。舉例來說，通過將干燥營養(yǎng)性多肽制劑混入水、硬質(zhì)粗粒小麥粉、阿拉伯膠、甘油單酯和甘油二酯、纖維、酵母和檸檬酸中來將營養(yǎng)性多肽并入意大利面食面團中。將面團切割成形，干燥并包裝。實施例20:體外篩選用于glp-1產(chǎn)生的氨基酸和營養(yǎng)性多肽。升糖素樣肽-1(glp-1)是一種由腸的l細胞應(yīng)答于多種營養(yǎng)物刺激物而產(chǎn)生的肽激素。glp-1是一種通過增加胰島素從胰腺釋放來降低血糖水平的腸促胰島素。glp-1作用于其它外周組織，從而增加骨骼肌和脂肪組織中的葡萄糖攝取和儲存，降低胃排空速率，以及降低肝葡萄糖產(chǎn)生(baggioll和djdrucker.2007.biologyofincretins:glp-1andgip.gastroenterology.132:2131-2157)。glp-1是升糖素原(proglucagon)的翻譯后裂解產(chǎn)物以產(chǎn)生活性glp-1(7-36)，這個活性glp-1在分泌之后由二肽基肽酶iv(dppiv)快速降解成glp-1(9-36)。若干哺乳動物胃腸細胞系用作l細胞分泌glp-1的模型(iec-6來自大鼠，nci-h716和fhs74int來自人，并且stc-1和glutag來自小鼠)。這些實驗的目的在于確定哪些氨基酸組合、營養(yǎng)性蛋白質(zhì)消化物和/或全長營養(yǎng)性蛋白質(zhì)誘導(dǎo)體外glp-1分泌。nci-h716細胞系從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection)(目錄號ccl-251tm，manassas,va)獲得。rpmi-1640、杜貝卡氏改良依格培養(yǎng)基(dulbecco’smodifiedeaglemedium，dmem)和杜貝卡氏磷酸鹽緩沖鹽水(dpbs)從lifetechnologies(目錄號分別是11875、11965和14190；carlsbad,ca)獲得。青霉素-鏈霉素溶液從atcc(目錄號30-2300，manassas,va)獲得?？股?抗霉菌素溶液(100x)從sigma-aldrich(目錄號a5955，st.louis,mo)獲得。胎牛血清從gehealthcare(目錄號sh3007103hi，wilmington,ma)獲得。牛血清白蛋白從fisherscientific(目錄號bp1600-100，pittsburgh,pa)獲得。無脂肪酸牛血清白蛋白從sigma-aldrich(目錄號a7030，st.louis,mo)獲得。作為蛋白酶抑制劑的苯基甲基磺酰氟(pmsf)從thermoscientific(目錄號36978，waltham,ma)獲得。作為dppiv抑制劑的抑二肽素a(diprotina)從sigma-aldrich(目錄號i9759，st.louis,mo)獲得。組織蛋白質(zhì)提取試劑(t-per)從thermoscientific(目錄號78510，waltham,ma)獲得。使用alphalisaglp-1(7-36酰胺)免疫測定研究試劑盒(目錄號al215，perkinelmer,waltham,ma)測定活性glp-1濃度，并且在enspirealpha板讀取器(perkinelmer,waltham,ma)上讀取。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析數(shù)據(jù)。制備克雷布斯林格緩沖液(krebsringerbuffer，krb)，并且alphalisaglp-1(7-36酰胺)免疫測定研究試劑盒從perkinelmer(目錄號al215，waltham,ma)獲得。96孔板用基質(zhì)膠預(yù)涂布。添加80μl基質(zhì)膠至5ml無葡萄糖的杜貝卡氏改良依格培養(yǎng)基(dmem)中。每孔添加50μl，并且將板在37℃、5％co2下孵育30分鐘。在添加細胞之前吸出基質(zhì)膠溶液。在補充以10％胎牛血清(fbs)和1％抗生素-抗霉菌素溶液的rpmi-1640培養(yǎng)基中維持nci-h716細胞，并且在37℃、5％co2下在t-75組織培養(yǎng)燒瓶中孵育。每2至3天以1:3或1:6使細胞傳代。用0.25％胰蛋白酶-edta使細胞脫離，在37℃、5％co2下孵育，并且在750rpm下離心10分鐘以集結(jié)細胞。細胞集結(jié)塊用補充以1％fbs的1x杜貝卡氏磷酸鹽緩沖鹽水(dpbs)洗滌2次，并且在750rpm下離心10分鐘以集結(jié)細胞。將細胞再混懸于補充以10％fbs和1％青霉素/鏈霉素的杜貝卡氏改良依格培養(yǎng)基(dmem)中，并且在血球計上計數(shù)。將細胞稀釋至1.8×106個細胞/毫升，并且添加200μl至用基質(zhì)膠預(yù)涂布的96孔板的各孔中。在37℃、5％co2下孵育細胞2天。在nci-h716細胞中篩選針對氨基酸處理的glp-1分泌在孵育2天之后，吸出培養(yǎng)基并用200μl饑餓緩沖液[即含有50μg/mlpmsf、34μg/ml抑二肽素a和0.2％無脂肪酸牛血清白蛋白(bsa)的克雷布斯-林格緩沖液(krb)]替換，并且在37℃、5％co2下孵育30分鐘。接著吸出饑餓緩沖液并用100μl/孔的含處理物品的饑餓緩沖液替換。用處理物品刺激細胞2小時，接著移除培養(yǎng)基并冷凍在-80℃下。處理物品包括個別氨基酸、氨基酸摻合物、營養(yǎng)性蛋白質(zhì)消化物和/或全長營養(yǎng)性蛋白質(zhì)。測定來自上清液的活性glp-1濃度。根據(jù)制造商說明書，使用alphalisaglp-1(7-36酰胺)免疫測定研究試劑盒(perkinelmer,al215)測定上清液中活性形式的glp-1(7-36)nh2。于被補充成等效濃度的饑餓緩沖液的測定緩沖液中測定標準物。或者，如本文所述使用酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)來測量活性形式的glp-1。在microsoftexcel和graphpadprism上分析來自alphalisaglp-1(7-36酰胺)免疫測定或glp-1elisa的發(fā)光數(shù)據(jù)。在graphpadprism6中對活性glp-1濃度進行x＝log(x)變換之后，使用標準物的4參數(shù)邏輯模型，通過非線性回歸來確定一式兩份樣品濃度。在graphpadprism6上進行anova和多重比較檢驗。在測試物品處理之后收集的樣品與在媒介物對照處理之后收集的樣品的glp-1含量比較描述隨時間的歸因于測試物品的glp-1分泌的程度。在各處理之間進行的這個差異的比較描述各氨基酸、氨基酸摻合物、營養(yǎng)性蛋白質(zhì)消化物和營養(yǎng)性蛋白質(zhì)處理相對于其它氨基酸、氨基酸摻合物、營養(yǎng)性蛋白質(zhì)消化物和營養(yǎng)性蛋白質(zhì)處理的差異性影響，并且提供一種將它們的功效分級的手段。由氨基酸達成的glp-1分泌如本文所述使細胞經(jīng)受氨基酸饑餓，并且用單獨刺激緩沖液、19種氨基酸、17種氨基酸(無亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸)、20種氨基酸或單獨亮氨酸在它們于dme/f12培養(yǎng)基中的濃度(看見表e20c)下刺激2小時。收集上清液并冷凍在-80℃下。隨后測定glp-1(7-36)酰胺濃度。圖6顯示在刺激之后在上清液中檢測的glp-1(7-36)的上清液濃度，誤差棒是技術(shù)平行測定的標準偏差。14種組合物使glp-1的濃度增加比在僅較大程度緩沖液刺激下觀察到的濃度大10％以上(缺乏asn、met、gln、tyr、his、gly、cys、phe、trp、ala、glu、leu、ile和val中的任一個的那些)。2種組合物(缺乏arg的氨基酸和僅leu處理)顯示glp-1(7-36)的濃度降低低于僅較低程度緩沖液刺激以下10％。表e20a.氨基酸μm氨基酸μm甘氨酸250l-亮氨酸451l-丙氨酸50l-賴氨酸500l-精氨酸700l-甲硫氨酸116l-天冬酰胺57l-苯丙氨酸215l-天冬氨酸50l-脯氨酸150l-半胱氨酸100l-絲氨酸250l-谷氨酸100l-蘇氨酸449l-谷氨酰胺2500l-色氨酸44l-組氨酸150l-酪氨酸214l-異亮氨酸416l-纈氨酸452實施例21.使用營養(yǎng)性多肽來改進健康禁食大鼠的血糖控制。葡萄糖耐受性測試是一種在臨床環(huán)境與臨床前環(huán)境兩者中衡量血糖控制的常見方法。在測試期間，給與大劑量的葡萄糖，并且在隨后時間點獲取血液樣品以測定血糖水平再正?；目焖俪潭取Ｔ诳诜咸烟悄褪苄詼y試(ogtt)中，通過口腔來攝取一定劑量的葡萄糖。所述測試在臨床上用于鑒定葡萄糖控制不良的個體(cobelli等,2014)，并且在臨床前用于評估抗糖尿病藥物的治療功效(wagman和nuss,2001)(moller,2001)。葡萄糖水平由直接和間接調(diào)節(jié)葡萄糖水平的許多不同胃腸激素調(diào)節(jié)，所述激素包括胰島素、升糖素、生長激素抑制素、葡萄糖依賴性促胰島素肽(gip)和升糖素樣肽1(glp-1)。組合測量葡萄糖和胃腸激素用于評估葡萄糖不耐受性、胰島素抗性和代謝疾病的嚴重性(ferrannini和mari,2014)。對25只伴有置留性頸靜脈導(dǎo)管(jvc)的健康禁食雄性sprague-dawley大鼠進行ogtt以評估營養(yǎng)性多肽給藥對血糖控制以及胰島素和glp-1水平的急性影響?？诜咸烟悄褪苄詼y試。所有嚙齒動物都約10-12周齡，稱重平均約350g，并且在測試之前馴化4天。動物在研究之前以墊料單獨舍飼，并且喂食常規(guī)嚙齒動物食物膳食(labdiet5001)。舍飼溫度保持在22±2℃下，濕度在50±20％下，并且實施12小時光照/12小時黑暗循環(huán)?？諝庋h(huán)是用100％新鮮空氣達成的每小時10次或大于10次空氣變換。在處理之前，使所有大鼠禁食過夜14小時。通過口服管飼來用營養(yǎng)性多肽溶解于水中的制劑處理禁食動物(參見表e21a)，并且在處理劑管飼之后15分鐘，接著以口服管飼葡萄糖(2g/kg)來激發(fā)。測量血糖，并且在7個時間點(相對于葡萄糖激發(fā)，-15、0、15、30、60、90、120分鐘)收集血液。將血液收集于含有血漿穩(wěn)定劑(dpp4抑制劑和蛋白酶混合物抑制劑)的edta收集管中。處死另一只大鼠，并且放血以提供用于分析標準物的未處理血液。使用通過jvc收集的小滴血液，利用血糖儀(alphatrak2,abbott)測量葡萄糖。表e21a.在組1-4中，在6個時間點(-15、0、15、30、60和120分鐘)從所有大鼠的jvc收集約300μl血液。定時進行葡萄糖管飼和血液收集以獲取每個動物相同時間量以使各動物的樣品時間都是準確的。所有時間點都在靶標時間的5％內(nèi)收集。將血液收集至預(yù)冷(0-4℃)k2edta血液收集管中，所述管含有在收集之前在1:100下添加至管中的蛋白酶抑制劑混合物(目錄號d8340，sigma-aldrich,st.louis,mo)和dppiv抑制劑(millipore,billerica,ma)。在血液收集之后，維持血液樣品冷卻(2-6℃)，并且在30分鐘內(nèi)離心。將收集的血漿放置在樣品管中并立刻儲存在-80℃下。在免疫測定之前，使分析樣品在冰上解凍1小時，通過吸移器來徹底混合，再排列至96孔微板中。制備用于胰島素免疫測定和glp-1免疫測定的單獨等分試樣。將主板和等分試樣冷凍儲存在-80℃下。圖7顯示在本文所述的ogtt期間的平均血糖值。顯示的誤差棒是平均值標準誤差。在葡萄糖激發(fā)之后的時間t＝15和t＝30分鐘，所有組都顯示與空腹的顯著血糖差異(p<0.05，dunnett多重比較檢驗)。在葡萄糖激發(fā)之后的時間t＝15和t＝30，接受seqid-00105和seqid-00338的組相對于媒介物顯示顯著血糖差異(p<0.05，tukey-kramer多重比較檢驗，在各時間點彼此比較處理組)。這些數(shù)據(jù)指示在遠系雜交雄性sprague-dawley大鼠中，在葡萄糖激發(fā)之后，急性攝取seqid-00105和seqid-00338可顯著改進血糖控制。在microsoftexcel中使用線性-對數(shù)梯形法計算血糖曲線下面積，并且在graphpadprism6上進行統(tǒng)計分析。從0至120分鐘以及從0至60分鐘積分的血糖曲線下面積(圖8)顯示在口服葡萄糖耐受性測試的情形下，急性seqid-00105和seqid-00338給藥通過降低血糖漂移來改進血糖控制。在0與60分鐘之間，seqid-00105與seqid-00338兩者相較于媒介物均具有顯著較小血糖變化(p<0.05，dunnett氏多重比較檢驗)。大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)。超靈敏大鼠胰島素elisa試劑盒從crystalchem,inc.(目錄號90060，downersgrove,il)獲得。使用biotekelx50微板條帶洗滌器(biotek,winooski,vt)洗滌各板。在synergymx基于單色器的微板讀取器(biotek,winooski,vt)上讀取吸光度。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析數(shù)據(jù)。在開始測定設(shè)置之前，使elisa試劑盒預(yù)升溫至室溫，持續(xù)30分鐘。根據(jù)制造商說明書制備標準曲線稀釋物以用廣泛范圍形式操作測定。使來自未處理組的血漿基質(zhì)和樣品血漿在冰上解凍，接著在4℃下在約1000xrcf下離心10分鐘以集結(jié)任何不溶性物質(zhì)。使用來自未處理組的血漿基質(zhì)制備用于操作胰島素標準物的基質(zhì)測定緩沖液以獲得于95μl中5.26％濃度。添加95μl測定緩沖液至所有樣品孔中，并且添加95μl基質(zhì)測定緩沖液至所有標準物孔中。一式兩份添加5μl各樣品和標準物。將各板在4℃下孵育2小時。接著用300μl/孔1x洗滌緩沖液洗滌各板5次。將各板在紙巾上急劇敲打數(shù)次以移除任何殘余洗滌緩沖液。通過組合2體積抗胰島素酶綴合物儲備物與1體積酶綴合物稀釋劑，以及通過上下吸移和溫和渦旋進行混合來制備抗胰島素酶綴合物工作溶液。添加100μl/孔的抗胰島素酶綴合物工作溶液至所有孔中。密封各板，并且在室溫下孵育30分鐘，接著用300μl/孔1x洗滌緩沖液洗滌7次。將各板在紙巾上急劇敲打數(shù)次以移除任何殘余洗滌緩沖液。接著添加100μl/孔酶底物溶液至各孔中，并且在室溫下在黑暗中孵育40分鐘。添加100μl/孔終止溶液至所有孔中。在synergymx板讀取器上在450nm和630nm下讀取吸光度。所得終值是a450nm-a630nm值。通過在excel中從各標準物孔a450nm-a630nm值減去0ng/ml胰島素標準物的平均值來關(guān)于胰島素的基質(zhì)濃度修正胰島素標準曲線。在graphpadprism6中對胰島素濃度進行x＝log(x)變換之后，使用背景修正的標準物的4參數(shù)邏輯模型，通過非線性回歸來確定一式兩份樣品濃度。在graphpadprism6上進行anova和多重比較檢驗。在microsoftexcel上使用線性-對數(shù)梯形法將曲線下面積積分，其中在graphpad中進行事后檢驗。圖9顯示每個處理組n＝6只大鼠在實驗過程中的平均血漿胰島素濃度。誤差棒顯示平均值標準誤差。在葡萄糖激發(fā)之后15、30和60分鐘，所有處理組相對于它們的處理劑或媒介物管飼在血漿胰島素方面都具有統(tǒng)計顯著增加(dunnett氏多重比較檢驗)。僅seqid-00105在葡萄糖激發(fā)時(0)的血漿胰島素濃度相對于在處理劑管飼時的血漿胰島素具有統(tǒng)計顯著增加(p<0.0001，dunnett氏多重比較檢驗)。在葡萄糖激發(fā)之后120分鐘，seqid-00105與seqid-00338兩者均具有統(tǒng)計顯著更大胰島素濃度(分別p<0.05和p<0.01；dunnett氏多重比較檢驗)。相較于媒介物，在葡萄糖激發(fā)時，僅seqid-00105顯示血漿胰島素濃度統(tǒng)計顯著更大增加(p<0.001，dunnett氏多重比較檢驗)。這些數(shù)據(jù)指示急性攝取seqid-00105可在攝取的15分鐘內(nèi)在遠系雜交雄性sprague-dawley大鼠中刺激胰島素釋放。圖10顯示所有處理組的在0-240和0-60分鐘之間積分的曲線下面積。無處理組統(tǒng)計顯著大于媒介物?？俫lp-1酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)。大鼠glp-1elisa試劑盒從crystalchem,inc.(目錄號81507，downersgrove,il)獲得。使用biotekelx50微板條帶洗滌器(biotek,winooski,vt)洗滌各板。在synergymx基于單色器的微板讀取器(biotek,winooski,vt)上讀取吸光度。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析數(shù)據(jù)。在開始測定設(shè)置之前，使elisa試劑盒預(yù)升溫至室溫，持續(xù)30分鐘。根據(jù)制造商說明書制備標準曲線稀釋物。使來自組5的血漿基質(zhì)和樣品血漿在冰上解凍，接著在4℃下在約1000xrcf下離心10分鐘以集結(jié)任何不溶性物質(zhì)。使用來自未處理組的血漿基質(zhì)制備用于操作glp-1標準物的基質(zhì)測定緩沖液以獲得于100μl中25％濃度。elisa微板用350μl/孔1x洗滌緩沖液洗滌3次，并且在紙巾上急劇敲打以移除殘余洗滌緩沖液。添加100μl測定緩沖液至所有樣品孔中，并且添加100μl基質(zhì)測定緩沖液至所有標準物孔中。一式兩份添加25μl各樣品和標準物。通過吸移來混合各孔。各板用粘附性箔覆蓋，并且在水平板振蕩器上在室溫下在100rpm下孵育18小時。各板接著用350μl/孔1x洗滌緩沖液洗滌3次，接著在紙巾上急劇敲打數(shù)次以移除任何殘余洗滌緩沖液。添加100μl/孔的生物素標記的抗體溶液至所有孔中。接著密封各板，并且在水平板振蕩器上在室溫下在100rpm下孵育1小時。各板接著用350μl/孔1x洗滌緩沖液洗滌3次，接著在紙巾上急劇敲打數(shù)次以移除任何殘余洗滌緩沖液。添加100μl/孔sa-hrp溶液至所有孔中。接著密封各板，并且在水平板振蕩器上在室溫下在100rpm下孵育30分鐘。各板接著用350μl/孔1x洗滌緩沖液洗滌3次，接著在紙巾上急劇敲打數(shù)次以移除任何殘余洗滌緩沖液。添加100μl/孔酶底物溶液至所有孔中。接著密封各板，并且在室溫下在黑暗中在不振蕩下孵育30分鐘。在底物孵育之后，添加100μl終止溶液至所有孔中。在synergymx板讀取器上在450nm和630nm下讀取吸光度值。所得終值是a450nm-a630nm值。通過在excel中從各標準物孔a450nm-a630nm值減去0pmglp-1標準物的平均值來關(guān)于總glp-1的基質(zhì)濃度修正標準曲線。在對glp-1濃度進行x＝log(x)變換之后，使用背景修正的標準物的4參數(shù)邏輯模型，通過非線性回歸來確定一式兩份樣品濃度。使用graphpadprism6進行anova和多重比較檢驗。在microsoftexcel上使用線性-對數(shù)梯形法將曲線下面積積分，其中在graphpad中進行事后檢驗。圖11顯示每個處理組n＝6只大鼠在實驗過程中的平均血漿glp-1濃度。此處顯示的誤差棒對應(yīng)于平均值標準誤差。在葡萄糖激發(fā)時，seqid-00338處理組顯示統(tǒng)計顯著大于媒介物的glp-1濃度(p<0.0005，dunnett氏多重比較檢驗)。實施例22：使用營養(yǎng)性多肽來改進zucker肥胖(fa/fa)大鼠的血糖控制在18只伴有置留性頸靜脈導(dǎo)管(jvc)的禁食雄性zucker肥胖大鼠中進行ogtt以評估營養(yǎng)性多肽給藥對血糖控制以及胰島素和glp-1水平的急性影響?？诜咸烟悄褪苄詼y試。所有嚙齒動物都約10-11周齡，稱重平均約450g，并且在測試之前馴化4天。動物在研究之前以墊料單獨舍飼，并且喂食常規(guī)嚙齒動物食物膳食(labdiet5001)。舍飼溫度保持在22±2℃下，濕度在50±20％下，并且實施12小時光照/12小時黑暗循環(huán)。空氣循環(huán)是用100％新鮮空氣達成的每小時10次或大于10次空氣變換。在治療之前，使所有大鼠禁食過夜14小時。通過口服管飼來用營養(yǎng)性多肽溶解于水中的制劑治療禁食動物(參見表e22a)，并且在治療劑管飼之后15分鐘，接著以口服管飼葡萄糖(5g/kg)來激發(fā)。測量血糖，并且在7個時間點(相對于葡萄糖激發(fā)，-15、0、15、30、60、90、120分鐘)收集血液。將血液收集于含有血漿穩(wěn)定劑(dpp4抑制劑和蛋白酶混合物抑制劑)的edta收集管中。處死另一只大鼠，并且放血以提供用于分析標準物的未處理血液。使用通過jvc收集的小滴血液，利用血糖儀(alphatrak2,abbott)測量葡萄糖。表e22a.在組1-3中，在6個時間點(-15、0、15、30、60、90和120分鐘)從所有大鼠的jvc收集約300μl血液。定時進行葡萄糖管飼和血液收集以獲取每個動物相同時間量以使各動物的樣品時間都是準確的。所有時間點都在靶標時間的5％內(nèi)收集。將血液收集至預(yù)冷(0-4℃)k2edta血液收集管中，所述管含有在收集之前在1:100下添加至管中的蛋白酶抑制劑混合物(目錄號d8340，sigma-aldrich,st.louis,mo)和dppiv抑制劑(millipore,billerica,ma)。在血液收集之后，維持血液樣品冷卻(2-6℃)，并且在30分鐘內(nèi)離心。將收集的血漿放置在樣品管中并立刻儲存在-80℃下。在免疫測定之前，使分析樣品在冰上解凍1小時，通過吸移器來徹底混合，再排列至96孔微板中。制備用于胰島素免疫測定和glp-1免疫測定的單獨等分試樣。將主板和等分試樣冷凍儲存在-80℃下。圖12顯示在本文所述的ogtt期間的平均血糖值。顯示的誤差棒是平均值標準誤差。在microsoftexcel上使用線性-對數(shù)梯形法計算積分曲線下面積(auc)，并且在graphpadprism6.03上進行統(tǒng)計測試。圖13顯示各治療組在葡萄糖激發(fā)時間(0分鐘)與60分鐘之間以及在時間0與120分鐘之間的積分auc。在時間0與60分鐘之間，無治療劑顯示與媒介物的統(tǒng)計顯著差異。在時間0與120分鐘之間，seqid-00105而非seqid-00338相較于媒介物顯示積分曲線下面積統(tǒng)計顯著降低(p<0.005，dunnett氏多重比較檢驗)。這些數(shù)據(jù)顯示在zucker肥胖(fa/fa)模型嚙齒動物模型中，急性seqid-00105給藥可使歸因于口服葡萄糖激發(fā)的葡萄糖漂移降低。大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)。超靈敏大鼠胰島素elisa試劑盒從crystalchem,inc.(目錄號90060，downersgrove,il)獲得。使用biotekelx50微板條帶洗滌器(biotek,winooski,vt)洗滌各板。在synergymx基于單色器的微板讀取器(biotek,winooski,vt)上讀取吸光度。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析數(shù)據(jù)。在開始測定設(shè)置之前，使elisa試劑盒預(yù)升溫至室溫，持續(xù)30分鐘。根據(jù)制造商說明書制備標準曲線稀釋物以用廣泛范圍形式操作測定。使來自未處理組的血漿基質(zhì)和樣品血漿在冰上解凍，接著在4℃下在約1000xrcf下離心10分鐘以集結(jié)任何不溶性物質(zhì)。使用來自未處理組的血漿基質(zhì)制備用于操作胰島素標準物的基質(zhì)測定緩沖液以獲得于95μl中5.26％濃度。添加95μl測定緩沖液至所有樣品孔中，并且添加95μl基質(zhì)測定緩沖液至所有標準物孔中。一式兩份添加5μl各樣品和標準物。將各板在4℃下孵育2小時。接著用300μl/孔1x洗滌緩沖液洗滌各板5次。將各板在紙巾上急劇敲打數(shù)次以移除任何殘余洗滌緩沖液。通過組合2體積抗胰島素酶綴合物儲備物與1體積酶綴合物稀釋劑，以及通過上下吸移和溫和渦旋進行混合來制備抗胰島素酶綴合物工作溶液。添加100μl/孔的抗胰島素酶綴合物工作溶液至所有孔中。密封各板，并且在室溫下孵育30分鐘，接著用300μl/孔1x洗滌緩沖液洗滌7次。將各板在紙巾上急劇敲打數(shù)次以移除任何殘余洗滌緩沖液。接著添加100μl/孔酶底物溶液至各孔中，并且在室溫下在黑暗中孵育40分鐘。添加100μl/孔終止溶液至所有孔中。在synergymx板讀取器上在450nm和630nm下讀取吸光度。所得終值是a450nm-a630nm值。相對于2.5％基質(zhì)標準物，在1:1稀釋度下再操作其中值超過標準曲線的樣品。通過在excel中從各標準物孔a450nm-a630nm值減去0ng/ml胰島素標準物的平均值來關(guān)于胰島素的基質(zhì)濃度修正胰島素標準曲線。在graphpadprism6中對胰島素濃度進行x＝log(x)變換之后，使用背景修正的標準物的4參數(shù)邏輯模型，通過非線性回歸來確定一式兩份樣品濃度。在graphpadprism6上進行anova和多重比較檢驗。在microsoftexcel上使用線性-對數(shù)梯形法將曲線下面積積分，其中在graphpad中進行事后檢驗。圖14顯示在媒介物和seqid-00105的情況下每個治療組n＝6只大鼠以及在seqid-00338的情況下每個治療組n＝5只大鼠在實驗過程中的平均血漿胰島素濃度。單因素anova與dunnett氏多重比較檢驗一起用于在各治療劑內(nèi)與時間0進行比較，以及在治療劑之間在相同時間點與媒介物進行比較。相較于媒介物管飼的時間，媒介物在血漿胰島素方面不具有統(tǒng)計顯著變化。在葡萄糖激發(fā)(時間0)時以及在葡萄糖激發(fā)之后15分鐘和90分鐘，相較于治療劑管飼的時間(時間-15)，seqid-00105具有統(tǒng)計顯著更大血漿胰島素(分別p＝0.0002、p<0.05和p<0.05)。相較于治療劑管飼的時間，在所有隨后取樣時間點，seqid-00338都具有統(tǒng)計顯著更大血漿胰島素濃度(分別p<0.0001、p<0.05、p<0.005、p<0.005和p＝0.0005)。在治療劑之間比較時，在治療劑或媒介物管飼時，seqid-00105和seqid-00338都不顯著不同于媒介物。在葡萄糖激發(fā)和所有隨后取樣時間點(0、15、30、60和90分鐘)時，seqid-00105與seqid-00338兩者均比媒介物具有顯著更大血漿胰島素濃度。這顯示在zucker肥胖(fa/fa)模型中，兩種治療劑均刺激胰島素分泌。圖15顯示各組的積分曲線下面積。僅seqid-00338治療劑在0與90分鐘之間積分時統(tǒng)計顯著大于媒介物(p<0.005)?；钚詆lp-1酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)。大鼠活性glp-1elisa試劑盒從eaglebiosciences(目錄號gp121-k01，nashua,nh)獲得。使用biotekelx50微板條帶洗滌器(biotek,winooski,vt)洗滌各板。在synergymx基于單色器的微板讀取器(biotek,winooski,vt)上讀取吸光度。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析數(shù)據(jù)。在開始測定設(shè)置之前，使elisa試劑盒預(yù)升溫至室溫，持續(xù)至少30分鐘。根據(jù)制造商說明書制備標準曲線稀釋物。使來自組5的血漿基質(zhì)和樣品血漿在冰上解凍，接著在4℃下在約1000xrcf下離心10分鐘以集結(jié)任何不溶性物質(zhì)。使用來自未處理組的血漿基質(zhì)制備用于操作活性glp-1標準物的基質(zhì)測定緩沖液以獲得于100μl中10％(針對在1:1稀釋度下測試的樣品)或于100μl中20％(針對未稀釋測試的樣品)濃度。添加20μl標準物和樣品至預(yù)涂布的微板中，并且添加100μl適當測定緩沖液至標準物和樣品孔中。各板用粘附性箔覆蓋，并且在4℃下避光孵育24小時。各板接著用350μl/孔1x洗滌緩沖液洗滌5次，接著在紙巾上急劇敲打數(shù)次以移除任何殘余洗滌緩沖液。添加100μl/孔的elisahrp底物至所有孔中。接著密封各板，并且在室溫下避光孵育20分鐘。添加100μl/孔elisa終止溶液至所有孔中，并且溫和混合。在synergymx板讀取器上在450nm和620nm下讀取吸光度值。所得終值是a450nm-a620nm值。通過在excel中從各標準物孔a450nm-a620nm值減去0pmglp-1標準物的平均值來關(guān)于活性glp-1的基質(zhì)濃度修正標準曲線。在對glp-1濃度進行x＝log(x)變換之后，使用背景修正的標準物的4參數(shù)邏輯模型，通過非線性回歸來確定一式兩份樣品濃度。使用graphpadprism6進行anova和多重比較檢驗。在microsoftexcel上使用線性-對數(shù)梯形法將曲線下面積積分，其中在graphpad中進行事后檢驗。圖16顯示每個媒介物和seqid-00105治療組n＝6只大鼠以及每個seqid-00338治療組n＝5只大鼠在實驗過程中的平均血漿glp-1濃度。單因素anova與dunnett氏多重比較檢驗一起用于在各治療劑內(nèi)與時間0進行比較，以及在治療劑之間在相同時間點與媒介物進行比較。在媒介物管飼之后在任何時間點，媒介物都顯示在glp-1(7-36)濃度方面無顯著差異。在葡萄糖激發(fā)之后在15分鐘和30分鐘，seqid-00105顯示顯著更大glp-1(7-36)濃度(分別p<0.0001和p<0.05)。在葡萄糖激發(fā)之后在15分鐘，seqid-00338具有顯著更大glp-1濃度(p<0.005)。當在各時間點相較于媒介物時，僅seqid-00105在葡萄糖激發(fā)之后在15分鐘比媒介物具有顯著更大glp-1(7-36)濃度(p<0.005)。圖17顯示各治療組的對于0-90和0-60分鐘積分的glp-1(7-36)曲線下面積。相較于媒介物，在0-90或0-60分鐘，無治療劑具有顯著不同glp-1(7-36)積分auc。在另一實驗中，在24只伴有置留性頸靜脈導(dǎo)管(jvc)的禁食雄性zucker肥胖大鼠中進行ogtt以評估營養(yǎng)性蛋白質(zhì)給藥對血糖控制以及胰島素和glp-1水平的急性影響。通過在口服葡萄糖耐受性測試的情形下比較seqid-00105相對于阿格列汀(alogliptin)相對于seqid-00105+阿格列汀相對于媒介物的血糖漂移來測試seqid-00105改進葡萄糖控制的能力。所有嚙齒動物都約10-11周齡，稱重平均約430g，并且在測試之前馴化4-5天。在治療之前，使所有大鼠禁食過夜14小時。通過口服管飼來用營養(yǎng)性蛋白質(zhì)溶解于水中的制劑治療禁食動物(參見表e22b)，并且在治療劑管飼之后15分鐘，接著以口服管飼葡萄糖(2g/kg)來激發(fā)。測量血糖，并且在9個時間點(相對于葡萄糖激發(fā)，-15、0、15、30、60、90、120、180和240分鐘)收集血液。表e22b圖18顯示在本文所述的ogtt期間的平均血糖值。每個治療組，n＝6只大鼠。顯示的誤差棒是平均值標準誤差。在graphpadprism6上將各組進行事后比較，其中兩因素anova、dunnett氏多重比較檢驗首先在各組內(nèi)與空腹葡萄糖濃度進行比較，隨后與媒介物進行各時間點比較。在葡萄糖激發(fā)時，無治療組血糖顯著不同于禁食。在各組與媒介物之間，空腹葡萄糖和在葡萄糖激發(fā)時的血糖不顯著不同。在葡萄糖激發(fā)之后在15分鐘，僅seqid-00105以及seqid-00105+阿格列汀相較于媒介物具有顯著更低血糖(分別p＝0.0003和p<0.0001)。在葡萄糖激發(fā)之后在30分鐘，單獨阿格列汀以及seqid-00105+阿格列汀比媒介物具有顯著更低血糖(分別p＝0.0424和p＝0.0021)。在葡萄糖激發(fā)之后在60分鐘，僅單獨阿格列汀顯著低于媒介物(p<0.0001)。在60分鐘之后，無群組與媒介物具有顯著不同血糖。在microsoftexcel上使用線性-對數(shù)梯形法計算積分曲線下面積(auc)，并且在graphpadprism6.03上進行兩因素anova和dunnett氏多重比較檢驗。在時間0與60分鐘之間，無治療劑顯示與媒介物在葡萄糖auc方面的統(tǒng)計顯著差異。在時間0與120分鐘之間以及在時間0與240分鐘之間，僅單獨阿格列汀治療顯著小于媒介物(分別p＝0.0051和p＝0.0054)。實施例23：使用營養(yǎng)性多肽來改進膳食誘發(fā)肥胖小鼠的血糖控制和空腹葡萄糖通過在膳食誘發(fā)肥胖(dio)小鼠中進行口服葡萄糖耐受性測試來評估本文所述的治療性營養(yǎng)性多肽的慢性給藥的影響。特定來說，在代謝疾病的這個動物模型中慢性給藥可影響血糖控制、胰島素抗性、空腹葡萄糖和胰島素水平，并且比較在一段時期的每日給藥之前和之后的空腹水平以及在ogtt期間的葡萄糖曲線下面積(auc)提供化合物功效的量度。持續(xù)14周對四組各10只雄性c57bl/6小鼠喂食高脂肪膳食以確保它們顯現(xiàn)空腹葡萄糖水平升高(高血糖癥)、空腹胰島素水平升高(高胰島素血癥)和葡萄糖控制受損(xu.h.等chronicinflammationinfatplaysacrucialroleinthedevelopmentofobesity-relatedinsulinresistance.j.clin.invest.(2003)112:1821-1830)。對單組10只雄性c57bl/6小鼠(組1)喂食正常膳食以用于將采用hfd的治療組別與處于相同齡期、處理和舍飼條件下的正常膳食組別進行比較。所有小鼠在開始研究之前都被舍飼并馴化3天。所有小鼠在ogtt處理之前都被禁食過夜14小時，并且在研究當天早晨在給藥之前收集血液樣品以分析空腹葡萄糖和激素水平。在葡萄糖激發(fā)之前15分鐘，通過管飼來用提供的營養(yǎng)性多肽的制劑治療禁食動物。在時間零時，口服施用葡萄糖(2g/kg)。測量在7個時間點(-15、0、15、30、60、90、120分鐘)的血糖。處于常規(guī)膳食下的年齡匹配的正常小鼠用作分析的內(nèi)標。在組2-5中，通過每日管飼或配制至食物中，小鼠持續(xù)15-30天接受每日劑量的所提供的治療性營養(yǎng)性多肽(2.85g/kg)(組4和5)或媒介物對照(組2和3)。將所有血液都收集于含有血漿穩(wěn)定劑(dpp4抑制劑和蛋白酶混合物抑制劑)的edta收集管中，處理以獲得血漿，并且冷凍儲存在-80c下。在研究的最后一天用媒介物(組2和4)或測試物品(組1、3和5)再次進行如上所述的ogtt。在最終測試物品或媒介物劑量之前，收集血液樣品以分析空腹葡萄糖和激素水平。在完成最終ogtt時，處死所有小鼠，并且通過心臟穿刺來收集完整血液體積。使用本文所述的elisa方法進行胰島素水平分析。在組2和4之間進行的研究末尾ogtt葡萄糖auc比較描述慢性測試物品施用的影響而無測試物品施用對ogtt的急性影響。在組3和5之間進行的研究末尾ogtt葡萄糖auc比較描述慢性測試物品施用的影響，并且包括測試物品施用對ogtt的急性影響。在組4內(nèi)或在組5內(nèi)進行的研究開始和結(jié)束時的空腹葡萄糖和胰島素水平比較描述慢性給藥對空腹葡萄糖和胰島素水平的影響。實施例24：使用營養(yǎng)性多肽來誘導(dǎo)嚙齒動物的胰島素分泌已顯示攝取的氨基酸能夠誘導(dǎo)胰島素分泌(gannonm.c.和f.q.2010.nuttall.aminoacidingestionandglucosemetabolism--areview.iubmblife,62(9):660-668)。蛋白質(zhì)攝取相較于單獨葡萄糖攝取會顯著增加血漿胰島素(nuttall等1984.effectofproteiningestionontheglucoseandinsulinresponsetoastandardizedoralglucoseload.diabetescare.7(5):465-470)。攝取的蛋白質(zhì)部分地通過在腔性暴露于營養(yǎng)物后由內(nèi)分泌細胞分泌的腸促胰島素激素(即升糖素樣肽-1(glp-1)和葡萄糖依賴性促胰島素肽(gip))的作用來增加胰島素分泌(baggioll和djdrucker.2007.biologyofincretins:glp-1andgip.gastroenterology.132:2131-2157)。也已顯示諸如亮氨酸和精氨酸的氨基酸會直接刺激胰島素釋放(newsholmep.等newinsightsintoaminoacidmetabolism,b-cellfunctionanddiabetes.clin.sci.(2005)108:185-194)。在這些研究中，測量嚙齒動物中在各種營養(yǎng)性蛋白質(zhì)的急性給藥之后的胰島素應(yīng)答。處理動物并用各種測試物品急性給藥來作為根據(jù)本文所述的方法進行的藥物動力學(xué)嚙齒動物實驗的一部分。除非另外陳述，否則所有給藥都在每kg體重2.85g下進行。除具有n＝5只大鼠的seqid-00240和具有n＝3的seqid-00587之外，所有處理組都含有n＝4只大鼠。使用胰島素免疫測定來定量血漿胰島素使血漿樣品在冰上解凍，并且在1109xg下離心10分鐘以集結(jié)不溶性物質(zhì)。從4℃冷室移除胰島素免疫測定試劑盒(perkinelmer,al204c)，并且在測定設(shè)置期間保持在冰上。通過用milliq水稀釋10x測定緩沖液來制備1x測定緩沖液。于1x測定緩沖液中在25.9％禁食大鼠血漿下制備用于稀釋胰島素的標準物緩沖液，并且用于制取16點標準曲線。通過在96孔pcr微板中于1x測定緩沖液中7:20稀釋來制備血漿樣品。通過于1x測定緩沖液中1/400稀釋接受體珠粒和生物素化抗胰島素抗體來制備接受體珠?；旌衔铩⒔邮荏w珠?；旌衔镆?0μl/孔吸移至白色不透明384孔微板(perkinelmer,optiplate-384)中，向這個混合物中一式兩份添加10μl/孔的含胰島素標準物的禁食大鼠血漿或樣品大鼠血漿。將板用箔板密封物密封，并且在水平振蕩器上在室溫下在約600rpm下孵育60分鐘。有必要保護抗生蛋白鏈菌素涂布的供體珠粒免遭光照；因此，在暗室中，通過于1x測定緩沖液中1/125稀釋抗生蛋白鏈菌素涂布的供體珠粒來制備供體珠粒。在第一孵育步驟之后，添加20μl/孔供體珠?；旌衔镏翗藴饰锖蜆悠分?。密封測定板，并且使其返回至水平振蕩器中，在室溫下在約600rpm下持續(xù)30分鐘。在供體珠粒孵育之后，在enspirealpha板讀取器上讀取發(fā)光。用microsoftexcel14.0.7128.5000版(32位)和graphpadprism6.03版分析數(shù)據(jù)。相對于log(胰島素(μiu))來產(chǎn)生標準曲線。使用s形4參數(shù)邏輯等式來內(nèi)推大鼠血漿胰島素濃度。相對于時間繪制各大鼠在技術(shù)平行測定中的一式兩份胰島素濃度的平均值。在microsoftexcel中使用線性-對數(shù)線性法將曲線下面積關(guān)于0-240分鐘和0-60分鐘積分。使用大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)來定量血漿胰島素。超靈敏大鼠胰島素elisa試劑盒從crystalchem,inc.(目錄號90060，downersgrove,il)獲得。使用biotekelx50微板條帶洗滌器(biotek,winooski,vt)洗滌各板。在synergymx基于單色器的微板讀取器(biotek,winooski,vt)上讀取吸光度。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析數(shù)據(jù)。在開始測定設(shè)置之前，使elisa試劑盒預(yù)升溫至室溫，持續(xù)30分鐘。根據(jù)制造商說明書制備標準曲線稀釋物以用廣泛范圍形式操作測定。使來自未處理組的血漿基質(zhì)和樣品血漿在冰上解凍，接著在4℃下在約1000xrcf下離心10分鐘以集結(jié)任何不溶性物質(zhì)。使用來自未處理組的血漿基質(zhì)制備用于操作胰島素標準物的基質(zhì)測定緩沖液以獲得于95μl中5.26％濃度。添加95μl測定緩沖液至所有樣品孔中，并且添加95μl基質(zhì)測定緩沖液至所有標準物孔中。一式兩份添加5μl各樣品和標準物。將各板在4℃下孵育2小時。接著用300μl/孔1x洗滌緩沖液洗滌各板5次。將各板在紙巾上急劇敲打數(shù)次以移除任何殘余洗滌緩沖液。通過組合2體積抗胰島素酶綴合物儲備物與1體積酶綴合物稀釋劑，以及通過上下吸移和溫和渦旋進行混合來制備抗胰島素酶綴合物工作溶液。添加100μl/孔的抗胰島素酶綴合物工作溶液至所有孔中。密封各板，并且在室溫下孵育30分鐘，接著用300μl/孔1x洗滌緩沖液洗滌7次。將各板在紙巾上急劇敲打數(shù)次以移除任何殘余洗滌緩沖液。接著添加100μl/孔酶底物溶液至各孔中，并且在室溫下在黑暗中孵育40分鐘。添加100μl/孔終止溶液至所有孔中。在synergymx板讀取器上在450nm和630nm下讀取吸光度。所得終值是a450nm-a630nm值。通過在excel中從各標準物孔a450nm-a630nm值減去0ng/ml胰島素標準物的平均值來關(guān)于胰島素的基質(zhì)濃度修正胰島素標準曲線。在graphpadprism6中對胰島素濃度進行x＝log(x)變換之后，使用背景修正的標準物的4參數(shù)邏輯模型，通過非線性回歸來確定一式兩份樣品濃度。在graphpadprism6上進行anova和多重比較檢驗。在microsoftexcel中使用線性-對數(shù)線性法將曲線下面積關(guān)于0-240分鐘和0-60分鐘積分。體內(nèi)血漿胰島素濃度圖19和20顯示用媒介物和在3種不同劑量下施用的seqid-00105以及在1種劑量下施用的seqid-00426、seqid-00338、seqid-00341進行的研究的組合生物平行測定數(shù)據(jù)，其中使用alphalisa胰島素試劑盒測量血漿胰島素。所有誤差棒都代表平均值標準誤差。單因素anova與dunnett氏多重比較檢驗一起用于在各處理劑內(nèi)與時間0進行比較，以及在處理劑之間在相同時間點與媒介物進行比較。在圖19中，在管飼之后在15、30和60分鐘，在2.85g/kg下的seqid-00105具有統(tǒng)計顯著血漿胰島素濃度增加(分別p<0.0001、p<0.0001和p<0.05)；在管飼之后在15和30分鐘，在1.78g/kg下的seqid-00105具有統(tǒng)計顯著血漿胰島素濃度增加(分別p＝0.0005和p<0.05)；在最低seqid-00105劑量下，血漿胰島素濃度在時間過程中不顯著不同于時間0。當在各時間點相較于媒介物對照的血漿胰島素濃度時，在口服管飼之后在15分鐘和30分鐘，在2.85g/kg下的seqid-00105顯示統(tǒng)計顯著大于媒介物的血漿胰島素(分別p<0.0001和p<0.001)，在口服管飼之后在15分鐘，在1.78g/kg下的seqid-00105顯示統(tǒng)計顯著血漿胰島素濃度增加(p＝0.0005)。在圖20中，僅seqid-00338在口服管飼之后在15和30分鐘，具有就0時而言的血漿胰島素濃度統(tǒng)計顯著增加(分別p＝0.005和p<0.05)。當相較于處于各濃度下的媒介物血漿胰島素濃度時，在口服管飼之后在15分鐘，seqid-00338顯著大于媒介物(p<0.01)。圖21和22顯示對媒介物、seqid-00105、seqid-00426、seqid-00338、seqid-00341測量的血漿胰島素濃度的積分曲線下面積，誤差棒是平均值標準誤差。單因素anova與dunnett氏多重比較檢驗一起用于與媒介物比較auc。當從0至240分鐘以及0至60分鐘積分時，在2.85g/kg下的seqid-00105比媒介物具有統(tǒng)計顯著更大血漿胰島素auc(分別p＝0.0005和p<0.05)。圖23和24顯示用媒介物以及seqid-00423、seqid-00587、seqid-00105、seqid-00424、seqid-00425和seqid-00429進行的研究的組合生物平行測定數(shù)據(jù)，其中使用alphalisa胰島素試劑盒測量血漿胰島素。所有誤差棒都代表平均值標準誤差。單因素anova與dunnett氏多重比較檢驗一起用于在各處理劑內(nèi)與時間0進行比較，以及在處理劑之間在相同時間點與媒介物進行比較。圖25和26顯示圖23和24中所示的血漿胰島素濃度的積分曲線下面積。單因素anova與dunnett氏多重比較檢驗一起用于與媒介物比較auc。當在0-240分鐘下積分時，seqid-00587具有顯著更大血漿胰島素auc(p<0.005)。圖27顯示用媒介物以及seqid-00105、seqid-00240和seqid-00559進行的研究的組合生物平行測定數(shù)據(jù)，其中使用大鼠胰島素elisa試劑盒測量血漿胰島素。所有誤差棒都代表平均值標準誤差。單因素anova與dunnett氏多重比較檢驗一起用于在各處理劑內(nèi)與時間0進行比較。相較于時間0，在管飼后在15分鐘，seqid-00105與seqid-00559兩者均具有統(tǒng)計顯著血漿胰島素濃度增加(兩者均為p<0.05)。相較于時間0，在管飼后在15和30分鐘，seqid-00240具有統(tǒng)計顯著血漿胰島素增加(分別p<0.05和p<0.01)。相較于時間0，媒介物不具有統(tǒng)計顯著血漿胰島素濃度變化。圖28顯示各處理劑在管飼后0至240和0-60分鐘的積分曲線下面積，誤差棒是平均值標準誤差。根據(jù)dunnett氏多重比較檢驗，相較于媒介物，在0-60或0-240分鐘，無處理劑顯示顯著更大auc。實施例25：營養(yǎng)性多肽刺激健康禁食大鼠的升糖素樣肽2分泌。升糖素樣肽-2(glp-2)是一種通過翻譯后裂解升糖素原產(chǎn)生的33個氨基酸的肽。glp-2連同glp-1一起由人和嚙齒動物的腸內(nèi)分泌l細胞應(yīng)答于暴露于腸腔中的營養(yǎng)物而分泌。先前已顯示glp-2通過支持腸生長(liux,muralisg,holstjj,neydm.2008.enteralnutrientspotentiatetheintestinotrophicactionofglucagon-likepeptide-2inassociationwithincreasedinsulin-likegrowthfactor-iresponsesinrats.am.j.physiol.gastrointest.liverphysiol.295(6):r1794-r1802)來改進治療短腸綜合征的結(jié)果(brinkmanas,muralisg,hitts,solversonpm,holstjj,neydm.2012.enteralnutrientspotentiateglucagon-likepeptide-2actionandreducedependenceonparenteralnutritioninaratmodelofhumanintestinalfailure.am.j.physiol.gastrointest.liverphysiol.303(5):g610-g622)。處理動物并用測試物品急性給藥來作為根據(jù)本文所述的方法進行的藥物動力學(xué)嚙齒動物實驗的一部分。在這個實驗中，分析2種測試物品，即媒介物和在1.54g/kg下給藥的seqid-240的營養(yǎng)性制劑?？俫lp-2酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)用millipore總glp-2elisa試劑盒(millipore,ezglp2-37k)測量總glp-2。在操作測定之前，使elisa試劑盒平衡至室溫，持續(xù)至少30分鐘。試劑盒g(shù)lp-2標準物、品質(zhì)控制物1和品質(zhì)控制物2用500μlmilliq水復(fù)原，倒置5次，并且在室溫下孵育5分鐘，接著溫和渦旋以進行混合。通過于試劑盒測定緩沖液中1:1連續(xù)稀釋glp-2標準物以產(chǎn)生包括0ng/mlglp-2的8點標準曲線來制取標準曲線。使血漿樣品在冰上解凍，并且在約1109xrcf下離心10分鐘以集結(jié)不溶性物質(zhì)。制備用于在20％(2x)下一式兩份操作標準物和品質(zhì)控制物的來自未處理禁食大鼠的禁食血漿基質(zhì)。通過組合50ml10x洗滌緩沖液與450mlmilliq水來在清潔500ml玻璃瓶中制備1x洗滌緩沖液。通過用以30-300μl8通道吸移器施加的300μl1x洗滌緩沖液洗滌3次來制備各條帶。在各次洗滌之間，將洗滌緩沖液傾析至廢物貯器中，并且將板在一疊紙巾上急劇敲打以移除剩余洗滌緩沖液。在首次洗滌之后，添加90μl測定緩沖液至樣品孔中，并且添加50μl含20％基質(zhì)的測定緩沖液至所有標準物和品質(zhì)控制物孔中。添加10μl樣品至各樣品孔中，并且添加50μl標準物和品質(zhì)控制物至含有基質(zhì)的孔中。一式兩份操作樣品、標準物和品質(zhì)控制物孔，例外之處是一式四份操作的0ng/mlglp-2標準物。將板用塑料板密封物密封，并且在水平板振蕩器上在室溫下在450rpm下孵育2小時。在首次孵育之后，將板用1x洗滌緩沖液洗滌3次，其中在各次洗滌之后，向廢物貯器中傾析，并且在一疊紙巾上急劇敲打倒置的板以移除過量洗滌緩沖液。添加100μl檢測抗體至各孔中，并且將板用塑料板密封物密封并在水平板振蕩器上在室溫下在450rpm下孵育1小時。在第二次孵育之后，將板用1x洗滌緩沖液洗滌3次，其中在各次洗滌之后，向廢物貯器中傾析，并且在一疊紙巾上急劇敲打倒置的板以移除過量洗滌緩沖液。添加100μl酶溶液至各孔中，并且將板用塑料板密封物密封并在水平板振蕩器上在室溫下在450rpm下孵育30分鐘。在第三次孵育之后，將板用1x洗滌緩沖液洗滌3次，其中在各次洗滌之后，向廢物貯器中傾析，并且在一疊紙巾上急劇敲打倒置的板以移除過量洗滌緩沖液。添加100μl底物至各孔中，并且將板用塑料板密封物和不透明箔密封物密封并在水平板振蕩器上在室溫下在450rpm下孵育20分鐘。在底物反應(yīng)之后，添加100μl終止溶液至各孔中，并且將板溫和振蕩以進行混合。在synergymx板讀取器上在450nm和590nm下測量吸光度。測量值是450nm吸光度值與590nm吸光度值之間的差異。用graphpadprism6.03分析數(shù)據(jù)。在減去0ng/ml背景值之后，相對于log(總glp-2(ng/ml))來產(chǎn)生標準曲線。使用s形4參數(shù)邏輯等式來內(nèi)推大鼠血漿glp-2濃度。相對于時間繪制各大鼠在技術(shù)平行測定中的一式兩份glp-2濃度的平均值。在microsoftexcel上計算積分曲線下面積，其中使用線性-對數(shù)梯形法將各生物平行測定的在各時間點之間的面積計算為面積總和。圖29顯示seqid-00240和媒介物對照的在4小時時間過程中的計算總glp-2濃度。相較于時間0，媒介物glp-2濃度在任何取樣時間點都不顯著變化，而相對于時間0，在seqid-00240管飼之后在15(p<0.00)、30(p<0.0001)和60分鐘(p<0.01)，seqid-00240顯示glp-2濃度統(tǒng)計顯著增加(dunnett氏多重比較檢驗)。通過普通單因素anova與dunnett氏多重比較檢驗事后分析來將seqid-00240與媒介物在各時間點進行比較。在處理劑之間，在時間0時，glp-2濃度不顯著不同。在處理之后在15(p<0.001)、30(p<0.0001)、60(p<0.0001)和120分鐘(p<0.05)，glp-2濃度統(tǒng)計顯著大于媒介物。這些數(shù)據(jù)顯示某一急性劑量的seqid-00240而非媒介物會誘導(dǎo)健康禁食嚙齒動物的glp-2分泌。圖30顯示在第一小時和全部4小時中的積分glp-2曲線下面積。當在0-60分鐘內(nèi)以及在0-240分鐘內(nèi)積分時，相較于媒介物，在seqid-00240處理時的glp-2曲線下面積顯著更大(分別p<0.005和p<0.01，未配對雙尾student氏t檢驗)。這個數(shù)據(jù)指示相較于媒介物，在于健康禁食嚙齒動物中急性給藥的第一小時內(nèi)，急性seqid-00240給藥顯著刺激glp-2分泌。實施例26：口服遞送的營養(yǎng)性多肽對人的血漿胰島素和腸促胰島素水平的影響對蛋白質(zhì)攝取的胰島素和腸促胰島素應(yīng)答是以氨基酸的遞送為基礎(chǔ)。這個研究的目的在于在240分鐘的時期內(nèi)考查應(yīng)答于seqid-00426和seqid-00105的血漿胰島素濃度變化。2組各4名年齡在18歲與50歲之間的表觀健康的受試者口服接受20克營養(yǎng)性多肽制劑。所有受試者在開始研究之前都禁食過夜(>8小時)。在口服攝取營養(yǎng)性多肽之后在指定時間點(即0、15、30、60、90、120、150、180、210和240分鐘)收集靜脈血液樣品以評估血漿胰島素和腸促胰島素濃度變化。圖31顯示所有受試者對seqid-00105的平均胰島素應(yīng)答，而圖32顯示超過基線(時間0分鐘)的平均應(yīng)答倍數(shù)，如本文描述所測量。所有圖上的誤差棒都對應(yīng)于平均值標準誤差。第一階段胰島素應(yīng)答發(fā)生在時間0分鐘與90分鐘之間。第二階段胰島素應(yīng)答發(fā)生在90分鐘與210分鐘之間?？缭綍r間的單因素anova比較指示血漿胰島素隨時間存在顯著變化(p＝0.003)。dunnett多重比較檢驗指示在15和30分鐘時間點的胰島素值顯著不同于在時間0分鐘的胰島素值(p<0.05)。圖33顯示所有患者對seqid-00426的平均胰島素應(yīng)答，而圖34顯示超過基線(時間0分鐘)的平均應(yīng)答倍數(shù)，如本文描述所測量。所有圖上的誤差棒都對應(yīng)于平均值標準誤差。圖35顯示所有患者對seqid-00426的平均總胃抑制性多肽(gip)應(yīng)答，而圖36顯示超過基線(時間0分鐘)的平均應(yīng)答倍數(shù)，如本文描述所測量。所有圖上的誤差棒都對應(yīng)于平均值標準誤差。實施例27.使用含有酪氨酸、精氨酸和/或亮氨酸的營養(yǎng)性多肽氨基酸組合物來體外說明骨骼肌細胞生長和信號傳導(dǎo)。雷帕霉素的哺乳動物靶標(mtor)是作為細胞生長的關(guān)鍵調(diào)控劑的蛋白質(zhì)激酶，值得注意的是所述調(diào)控通過蛋白質(zhì)合成來達成。mtor充當細胞代謝的主要調(diào)控劑，其使具有不同激酶特異性和不同蛋白質(zhì)配偶體的兩種復(fù)合物mtorc1和mtorc2成核(引用來自ess-020)。mtor驅(qū)動各組織的蛋白質(zhì)合成。mtorc1介導(dǎo)的對生長信號傳導(dǎo)的應(yīng)答由氨基酸門控。應(yīng)答定位于溶酶體使mtor活化偶聯(lián)于肌肉蛋白質(zhì)分解代謝。mtorc1可由必需氨基酸(eaa)、亮氨酸和谷氨酰胺門控。必須存在用于任何上游信號(包括生長因子)的氨基酸以活化mtorc1(引用來自ess-020)。這些實驗通過體外測量應(yīng)答于由單一氨基酸達成的刺激的核糖體蛋白質(zhì)s6(rps6)的下游磷酸化來證明精氨酸、酪氨酸以及亮氨酸能夠調(diào)節(jié)mtorc1活化。原代大鼠骨骼肌細胞(rskmc)培養(yǎng)基購自cellapplications(目錄號：r150-500，sandiego,ca)。饑餓培養(yǎng)基dmem/f12從sigma(目錄號：d9785，st.louis,mo)購買。定制饑餓培養(yǎng)基mod.4購自lifetechnologies(目錄號：12500062，grandisland,ny)，其不含有任何氨基酸、酚紅或葡萄糖。胎牛血清(fbs)和其它生長因子從cellapplications(目錄號：r151-gs，sandiego,ca)獲得。組織培養(yǎng)燒瓶和透明底部96孔組織培養(yǎng)板購自corningincorporated(目錄號分別是：430641和353072，corning,ny)。胰蛋白酶/edta從lifetechnology(目錄號：25200，grandisland,ny)獲得。dpbs和hbss也購自lifetechnologies(目錄號分別是：14190、14175)。核糖體蛋白質(zhì)s6測定試劑盒從perkinelmer(目錄號：tgrs6p2s10k)獲得。原代大鼠骨骼肌細胞(rskmc)培養(yǎng)。使用本文所述的方案分離rskmc，并且冷藏保存在液氮中。也在37℃、5％co2組織培養(yǎng)孵育器(3110型，thermofisherscientific)中，在t75組織燒瓶中，于rskmc培養(yǎng)基(cellapplications)中維持細胞。每3天在細胞達到約90％匯合時將它們拆分。在t75組織燒瓶中于rskmc培養(yǎng)基中培養(yǎng)rskmc細胞直至100％匯合。從培養(yǎng)燒瓶吸出培養(yǎng)基，并且用10mldpbs沖洗一次，接著添加1.5ml0.25％胰蛋白酶/edta至細胞中。在使細胞從燒瓶脫離之后，添加10ml培養(yǎng)基。用10ml吸移器上下吸移培養(yǎng)基以使細胞從燒瓶脫離。接著將細胞在每孔50,000個細胞的密度下接種至透明底部96孔組織培養(yǎng)板中。在37℃、5％co2孵育器中過夜培養(yǎng)之后，在37℃、5％co2組織培養(yǎng)孵育器中用無fbs和亮氨酸的饑餓dme/f12培養(yǎng)基在4小時的時期內(nèi)使細胞饑餓，接著與hank氏緩沖鹽溶液(hbss)一起再孵育1小時來使細胞饑餓。用于饑餓培養(yǎng)基中的不同濃度的亮氨酸刺激細胞15和30分鐘。細胞也用5nm雷帕霉素(r0395，sigma)或100nm胰島素(i9278，sigma)處理15和30分鐘。在室溫下在725rpm下振蕩下使細胞于20μl溶解緩沖液(perkinelmer)中溶解10分鐘。將細胞溶解產(chǎn)物儲存在-80℃下，并且次日進行測定。根據(jù)制造商手冊進行核糖體蛋白質(zhì)s6測定。圖37顯示在不同亮氨酸濃度下測量的相對alphascreen信號(y軸)，從而證明亮氨酸以劑量依賴性方式刺激原代rskmc的rps6磷酸化。這個刺激由mtor抑制劑雷帕霉素以劑量依賴性方式抑制。圖38顯示在完全氨基酸培養(yǎng)基(arg、his、lys、asp、glu、ser、thr、asn、gln、cys、gly、pro、ala、val、ile、met、phe、tyr、trp)以及僅在它們的dme/f12濃度(參見表e27b)下含有(arg、his、lys、thr、gln、cys、val、ile、met、phe、tyr和trp)的最低12種氨基酸的混合物兩者中，亮氨酸均以劑量依賴性方式刺激原代rskmc的rps6磷酸化。原代骨骼肌細胞從2只sprague-dawley大鼠的比目魚肌(sol)、腓腸肌(gs)和趾長伸肌(edl)獲得。圖39、40和41顯示使用分離的原代細胞，亮氨酸以劑量依賴性方式刺激mtorrps6路徑。精氨酸、酪氨酸和亮氨酸為完全刺激mtor路徑所需。如上所述使細胞在無胎牛血清的mod.4培養(yǎng)基中饑餓，接著于缺乏各相應(yīng)單一氨基酸的mod.4培養(yǎng)基中刺激(對于mod.4培養(yǎng)基的組成和dme/f12氨基酸水平，分別參見表e27a和e27b)。表e27a表e27b使原代肌肉細胞饑餓2小時，接著在37c、5％co2組織培養(yǎng)孵育器中用0μm或500μm單一氨基酸刺激30分鐘。一式三份進行處理。圖42證明亮氨酸、精氨酸和酪氨酸的組合為與所有20種氨基酸在它們的dme/f12濃度下的完全補充物在相同程度上活化rmskc的mtor路徑所必需和所足夠，并且leu、arg或tyr的個別或配對處理劑都不能夠具有類似應(yīng)答。圖43、44和45顯示各氨基酸(leu、arg、tyr)在所有其它19種氨基酸相對于其它2種氨基酸的背景中的劑量應(yīng)答(例如arg在tyr和leu的背景中的劑量應(yīng)答)對rps6磷酸化的影響。這些數(shù)據(jù)指示leu、arg和tyr之間的協(xié)同是劑量依賴性的。將低arg劑量下的20種氨基酸應(yīng)答與類似高leu和tyr背景中的應(yīng)答進行比較，存在由其它17種氨基酸引起的刺激程度降低。在高arg劑量下，兩種背景中的應(yīng)答相等。將低leu劑量下的20種氨基酸應(yīng)答與類似高arg和tyr背景中的應(yīng)答進行比較，在rps6磷酸化應(yīng)答方面不存在差異。將低tyr劑量下的20種氨基酸應(yīng)答與類似高leu和arg背景中的應(yīng)答進行比較，其它17種氨基酸可進一步增強mtor應(yīng)答。實施例28.測定富含亮氨酸的營養(yǎng)性多肽在由嚙齒動物口服消耗之后的安全性和無毒性。完成急性毒理學(xué)研究以確認營養(yǎng)性多肽seqid-00105、seqid-00363和seqid-00426在嚙齒動物中的預(yù)期安全性。各研究組含有5只雄性大鼠和5只雌性大鼠(10wistar，6-7周齡，雄性220-250g，雌性180-200g)。測試制劑是350g/l營養(yǎng)性多肽，并且水性緩沖液作為對照。動物在到達后被馴化1周，并且給與始終可獲得的常規(guī)食物膳食。在給藥之前，將動物稱重，并且進行預(yù)放血。通過口服管飼來完成10ml/kg的單次劑量。在第2、6和7天，獲取身體和食物重量。在第6天，將動物放血于edta和肝素鈉管中。在第7天，獲取重量，并且使動物安樂死，隨后進行立刻尸檢。移除8種器官(心臟、肝、肺、脾、腎、腦、膀胱和小腸)，稱重并儲存在10％甲醛中。在研究期間，每日對應(yīng)激、疼痛和異常活動的征象進行臨床觀察。對于所有3種測試營養(yǎng)性多肽，蛋白質(zhì)和緩沖液都被良好耐受，因為在動物中未見異常。動物的所有活動都正常，并且未觀察到其它疼痛或痛苦征象。實施例29：對營養(yǎng)性多肽可消化性的分析說明通過體外模擬消化測定來分析營養(yǎng)性多肽的消化。體外消化系統(tǒng)用于模擬多肽分解成生物可獲取的肽和氨基酸，如在穿過胃和腸時所體內(nèi)發(fā)生(kopf-bolanz,k.a.等,thejournalofnutrition2012；142:245-250；hur,s.j.等,foodchemistry2011；125:1-12)。模擬胃腸消化也預(yù)測潛在蛋白質(zhì)過敏原性，因為消化抗性多肽可被吸收并導(dǎo)致敏化(astwood等,naturebiotechnology1996；14:1269-1273)。營養(yǎng)性多肽在模擬消化期間的半衰期。一種用于定量多肽從完整形式分解成較小肽的量度是完整半衰期。在這個實驗中，使營養(yǎng)性多肽暴露于一系列在胃(胃蛋白酶)和腸(胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)中具有活性的蛋白酶，并且隨時間測量完整蛋白質(zhì)的存在。具體來說，營養(yǎng)性多肽首先在2g/l的濃度下在37℃下用模擬胃液(sgf)(0.03mnacl，用hcl滴定至ph1.5，具有1:20w/w的最終胃蛋白酶:多肽比率)處理。在各時間點從反應(yīng)取樣，并且通過添加0.2mna2co3來淬滅。在于sgf中120分鐘之后，使剩余反應(yīng)物與模擬腸液(sif)(18.4mmcacl2，50mmmes，ph6.5，具有1:4:400w/w的最終胰蛋白酶:胰凝乳蛋白酶:底物比率)50:50混合，并且用naoh中和至ph6.5。在各時間點從反應(yīng)取樣，并且通過添加胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶抑制劑(sigma)溶液來淬滅，直至240分鐘。通過芯片電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳或蛋白質(zhì)印跡來分析各時間點樣品的完整蛋白質(zhì)。對于芯片電泳(labchipgxii)，使用ht低分子量蛋白質(zhì)表達試劑盒(遵循制造商方案)來分析樣品。對于分子量測定(kda)和定量，每12個樣品裝載1個蛋白質(zhì)階梯。對于聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)制造商方案在bis-tris預(yù)澆制凝膠(lifetechnologies)上分離樣品(1μg)。使用simplybluetmsafestain(invitrogen)染色凝膠并使用chemidocxrs+(biorad)成像，或根據(jù)制造商方案，使用干印跡系統(tǒng)(lifetechnologies)和western檢測試劑盒(lifetechnologies)，轉(zhuǎn)移于硝化纖維素膜上。通過根據(jù)制造商方案，使用snap蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)(millipore)，用于bloktm-po阻斷緩沖液中3:5000稀釋的抗his[c末端]-hrp抗體進行印跡來檢測蛋白質(zhì)。根據(jù)制造商方案，用luminataclassicowesternhrp底物(millipore)處理印跡，并且在moleculargeldoctmxr+系統(tǒng)(bio-rad)上使用化學(xué)發(fā)光檢測來成像。通過使用imagelab(biorad)進行密度計量術(shù)來測定對完整蛋白質(zhì)的定量。對于所有分析方法，隨時間繪制在各時間點(如果檢測出)的多肽相對濃度，并且相對于指數(shù)曲線進行擬合以計算完整半衰期?；蛘?，通過測定在單一時間點剩余的完整蛋白質(zhì)的百分比來分析樣品(例如半衰期小于2分鐘)。具體來說，如所述通過芯片電泳、sds-page、蛋白質(zhì)印跡和/或lc-ms/ms來分析t＝0樣品(無酶對照)和由sgf消化獲得的t＝2分鐘樣品的完整蛋白質(zhì)。測定在各時間點的多肽相對量，并且測定在t＝2時剩余的完整蛋白質(zhì)的百分比。使用這個方法確定的完整半衰期值被報道為大于或小于2分鐘以分別指示大于或小于50％的蛋白質(zhì)在t＝2分鐘時保持完整。通過任一方法確定的完整sgf半衰期的結(jié)果報道于表e29a中。表e29a.由在sgf處理期間進行體外完整蛋白質(zhì)檢測所計算的完整半衰期。除非另外指示，否則所有蛋白質(zhì)都在大腸桿菌中產(chǎn)生。an＝黑曲霉，ao＝米曲霉，bs＝枯草芽孢桿菌，ba＝解淀粉芽孢桿菌，kl＝乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)，tl＝疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)，bl＝地衣芽孢桿菌。如本文所述產(chǎn)生α-甘露糖苷酶處理的seqid-00363和源于ao、ba、kl、tl和bl的蛋白質(zhì)。營養(yǎng)性多肽在模擬消化期間的氨基酸釋放。定量多肽消化的另一方法在于測量在暴露于模擬消化系統(tǒng)之后存在的游離氨基酸的量。在這個方法中，胰酶(酶混合物)用于模擬腸蛋白酶。具體來說，依次通過體外基于胰酶的消化測定和使用反相hplc(rp-hplc)進行的游離氨基酸分析來分析多肽消化成氨基酸。將營養(yǎng)性多肽在最終濃度4g/l下添加至sgf(0.92g/l胃蛋白酶(sigma)、0.03mnacl，用hcl滴定至ph1.5)中，并且在37℃下孵育120分鐘。在120分鐘之后，添加na2co3以獲得最終濃度16mm來淬滅胃蛋白酶反應(yīng)。使所得反應(yīng)與2x濃縮sif(0.78mg/ml豬胰酶(sigma)、18.4mmcacl2、50mmmes，ph6.5)50:50混合，并且孵育240分鐘。在各時間點從反應(yīng)取樣，并且通過加熱至95℃，持續(xù)5分鐘來淬滅。對照樣品不含蛋白酶。如henderson,j.w.等agilenttechnologies(2010)中所述使用rp-hplc氨基酸分析來分析各時間點的游離氨基酸。使用agilent1100系列系統(tǒng)進行分析。在室溫下使用鄰苯二甲醛(opa)在線將伯氨基酸柱前衍生化。使用zorbaxeclipse-aaa4.6x150mm，3.5μm柱在40℃下分離opa衍生物。在23分鐘內(nèi)，分離梯度從100％40mmna2hpo4(ph7.8)過渡至65％乙腈/甲醇/水混合物(45/45/10)。通過在340nmex/450nmem下的熒光來檢測分析物。圖46說明在胰酶消化seqid-00105期間，游離leu濃度的代表性時間過程。樣品在胰酶消化的120分鐘時間點的游離leu濃度概述于表e29b中。表e29b.在胰酶消化營養(yǎng)性多肽的120分鐘時間點檢測的游離leu。營養(yǎng)性多肽在模擬消化期間的肽釋放。通過lc-ms/ms來分析由本文所述的基于胰酶的模擬體外消化獲得的樣品的肽。為制備用于lc-ms/ms分析的樣品，用三氟乙酸(tfa)將樣品ph調(diào)整至ph3，并且使用親水-親脂平衡(hlb)固相提取柱筒(waters)來提取肽。柱筒用2ml乙腈活化，并且用2ml0.1％tfa平衡。裝載樣品，并且柱筒用2ml0.1％tfa洗滌并用1ml70％乙腈/0.1％tfa洗脫。使洗脫的肽完全干燥，并且于50μl0.1％tfa中復(fù)原。將洗脫的肽(4μl)裝載上柱，并且用聯(lián)接于thermofisherorbitrapvelospro的watersnanoacquityhplc系統(tǒng)，通過納米lc-ms/ms來分析。將肽裝載于捕集柱上，并且歷經(jīng)75μm分析柱在350nl/min下洗脫；兩個柱均填充有jupiterproteo樹脂(phenomenex)。采用1小時梯度。以數(shù)據(jù)依賴性模式操作質(zhì)譜儀，其中ms在60,000fwhm分辨率下在orbitrap質(zhì)量分析器中進行，而ms/ms在ltq線性離子阱質(zhì)譜儀中進行。15種最豐富的離子被選擇用于ms/ms。使用mascot相對于適當數(shù)據(jù)庫搜索數(shù)據(jù)以鑒定肽。將mascotdat文件解析至scaffold軟件中以進行驗證，過濾，并且創(chuàng)建每個樣品的非冗余清單。使用95％的最小蛋白質(zhì)值和50％的最小肽值來過濾數(shù)據(jù)。在體外消化給定seqid之后，通過lc-ms/ms來在胰酶消化的240分鐘時間點檢測獨特肽。對于seqid-00105樣品檢測的獨特肽是：lfdkdnngsis、fdkdnngs、fdkdnngsis/fdkdnngsis、fdkdnngsiss、fdkdnngsisssel、dkdnngsi、dkdnngsis、slglspse、neidvdgn、idvdgnh、idvdgnhq、idvdgnhqie/idvdgnhqie、kvfdkngdg、vfdkngdglis、dkngdgl、kltdaev、lrevsdgsgeiniqqf、revsdgsg、revsdgsge、revsdgsgei、revsdgsgein/revsdgsgein、revsdgsgeiniq、revsdgsgeiniqqf、evsdgsgei、evsdgsgein。對于seqid-00426樣品檢測的獨特肽是：ysfedsgvgdvt、ysfedsgvgdvtg、sfedsgvgdvtg、fedsgvgdv、edsgvgdvt、edsgvgdvtg、edsgvgdvtgf、dsgvgdvt、lrgngyd、lrgngydidv、ithtndivpr、htndivpr、tndivpr、ndivpr、yshsspe、divkiegidatggnnqpnipdipahl、kiegid、kiegidatggnnqpnipdipa、iegidatggnnqpnipdipa、egidatggnnqpnipdipa、gidatggnnqpnipdipa、idatggnnqpnipd、idatggnnqpnipdip、idatggnnqpnipdipa/idatggnnqpnipdipa、idatggnnqpnipdipah、datggnnqpnipdipa/datggnnqpnipdipa、atggnnqpnipd、atggnnqpnipdip、atggnnqpnipdipa/atggnnqpnipdipa、atggnnqpnipdipah、tggnnqpnipdipa、ggnnqpnipdip/ggnnqpnipdip、ggnnqpnipdipa/ggnnqpnipdipa/ggnnqpnipdipa、gnnqpnipdipa/gnnqpnipdipa、nnqpnipdipa、nqpnipdipa、pnipdipa。復(fù)雜混合物中的營養(yǎng)性多肽完整半衰期確定。使用上述模擬胃體外消化來確定復(fù)雜混合物中的多種多肽的體外完整半衰期。簡要來說，如本文所述通過克隆、轉(zhuǎn)化以及表達編碼168種蛋白質(zhì)的基因文庫來以單一混合物形式產(chǎn)生168種營養(yǎng)性多肽的文庫。如本文所述通過imac純化來從宿主細胞蛋白質(zhì)純化重組表達的蛋白質(zhì)。如上所述用sgf處理168種蛋白質(zhì)的文庫，并且通過lc-ms/ms來分析t＝0和t＝10分鐘樣品的完整蛋白質(zhì)。為開始分析，將10μg樣品裝載于10％sds-page凝膠(invitrogen)上，并且在凝膠中操作約5cm。將凝膠從100kd至染料前部切成10個部分，并且通過依次用25mm碳酸氫銨和乙腈洗滌來處理凝膠切片。凝膠部分接著在60℃下用10mm二硫蘇糖醇還原，隨后在室溫下用50mm碘乙酰胺進行烷基化。最后，樣品用胰蛋白酶(promega)在37℃下消化4小時，并且以添加甲酸來使消化淬滅。樣品接著使用聯(lián)接于thermofisherqexactive的easynlc1000hplc系統(tǒng)，通過納米lc/ms/ms來分析。將肽裝載于捕集柱上，并且歷經(jīng)75μm分析柱在350nl/min下洗脫；兩個柱均填充有pepmapc183μm樹脂(themofisher)。采用1小時梯度。以數(shù)據(jù)依賴性模式操作質(zhì)譜儀，其中ms和ms/ms分別在70,000fwhm分辨率和17,500fwhm分辨率下在orbitrap中進行。15種最豐富的離子被選擇用于ms/ms。使用mascot相對于適當數(shù)據(jù)庫搜索數(shù)據(jù)以鑒定肽。將mascotdat文件解析至scaffold軟件中以進行驗證，過濾，并且創(chuàng)建每個樣品的非冗余清單。在1％蛋白質(zhì)和肽假發(fā)現(xiàn)率(fdr)以及每種蛋白質(zhì)要求至少兩種獨特肽下過濾數(shù)據(jù)。產(chǎn)生檢測的蛋白質(zhì)和它們的光譜計數(shù)(spc)的完全清單，并且隨各收集的膠凝部分而變加以報道。spc是對于給定蛋白質(zhì)鑒定的光譜數(shù)的計數(shù)，并且用作相對蛋白質(zhì)豐度的量度(liu,h.等,analyticalchemistry2004,76:4193-4201)。為計算在sgf消化的10分鐘時間點剩余的完整蛋白質(zhì)的百分比，用代表t＝10分鐘樣品中的完整肽的spc數(shù)目除以代表t＝0分鐘樣品中的完整肽的spc數(shù)目。代表完整肽的spc數(shù)目定義為t＝0分鐘樣品中對那個蛋白質(zhì)指定的spc數(shù)目最高的部分和兩個側(cè)接部分中的spc的總和。在10分鐘時的完整蛋白質(zhì)％的結(jié)果顯示于表e20c中。在表e20d中比較14種多肽的純化蛋白質(zhì)的完整半衰期值(通過芯片電泳確定)和在168種seqid的文庫中檢測的蛋白質(zhì)在10分鐘時剩余的完整肽的百分比(通過lc-ms/ms分析確定)。分析在t＝10分鐘時保持完整的蛋白質(zhì)的百分比與半衰期之間的線性關(guān)系，并且r2值被確定為0.72。表e20c.在168種營養(yǎng)性多肽的文庫sgf消化的10分鐘時間點剩余的完整蛋白質(zhì)百分比。表e20d.純化蛋白質(zhì)的完整半衰期值(通過芯片電泳確定)和在168種營養(yǎng)性多肽的文庫中檢測的蛋白質(zhì)在10分鐘時剩余的完整肽的百分比(通過lc-ms/ms分析確定)的比較。實施例30：營養(yǎng)性多肽的粘度已證明存在強烈吸引性自締合相互作用會產(chǎn)生較高粘度溶液(yadav,sandeep等journalofpharmaceuticalsciences99.12(2010):4812-4829.)。具體來說，帶相反電荷殘基的靜電相互作用產(chǎn)生高粘度溶液(liu,jun等journalofpharmaceuticalsciences94.9(2005):1928-1940.)?？墒褂帽疚乃龅拿總€氨基酸凈電荷或電荷計算結(jié)果，以及選擇具有高度正性電荷或高度負性電荷的蛋白質(zhì)來選擇具有低粘度的營養(yǎng)性多肽。以這個方式選擇的蛋白質(zhì)將缺乏互補性靜電相互作用，并且將代之以具有限制自締合能力，由此降低溶液的粘度的總體排斥力。測量營養(yǎng)性多肽(seqid-00105)和乳清的溶液的相對粘度。兩種蛋白質(zhì)均用水再混懸以獲得為分析所需的濃度。使用具有cpe-40轉(zhuǎn)軸的brookfieldlvdv-ii+pro錐/板來測量粘度。所有測試都在4c和25c下進行。樣品體積是0.5ml。用brookfieldtc-550ap-115可編程溫度浴維持溫度。所有樣品都在4c下平衡至少2分鐘，以及在25c下平衡1分鐘。所有讀數(shù)都在10％與100％扭矩之間獲取。圖47顯示seqid-00105在4c(閉合圓圈)和25c(空心圓圈)下以及乳清在4c(閉合方塊)和25c(空心方塊)下以厘泊計量的粘度。本文已顯示seqid-00105跨越一定范圍的ph具有負性凈電荷，并且目前顯示在多種溫度和多肽濃度下，seqid-00105的粘度小于是無主要單一電荷的分散蛋白質(zhì)混合物的乳清。為產(chǎn)生粘度增加的溶液，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可用于產(chǎn)生由酶誘導(dǎo)的在營養(yǎng)性多肽之間的永久共價交聯(lián)組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，由此產(chǎn)生另外粘稠溶液。這個酶處理也可繼之以熱處理以制備含有營養(yǎng)性多肽的粘稠溶液。為產(chǎn)生含有使粘度增加的交聯(lián)的營養(yǎng)性多肽樣品，使樣品與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶溶液在ph7.0下混合以給出酶與蛋白質(zhì)重量比1:25。在大多數(shù)實驗中，在40℃下進行酶催化的交聯(lián)反應(yīng)。實施例31：對營養(yǎng)性多肽溶解度和熱穩(wěn)定性的分析說明。溶解度。通過測定復(fù)原凍干粉末離心過濾和/或超濾溶液的蛋白質(zhì)濃度來評估蛋白質(zhì)的溶解度(carpenter等(2002)rationaldesignofstablelyopholizedproteinformulations:theortyandpractice,kluweracademic/plenumpublishers,newyork,第109-133頁；milliporepublication,amiconultra:centrifugalfilterdevicesfortheconcentrationandpurificationofbiologicalsamples(2001)；oss等(1969)amembranefortherapidconcentrationofdiluteproteinsamplesinanultrafilter,clinicalchemistry,15(8):699-707)。通過使用制造商標準方案在freezone冷凍干燥系統(tǒng)(labconco)上凍干來干燥蛋白質(zhì)樣品，接著于緩沖液中再混懸以獲得所需濃度。離心和切向超濾用于從蛋白質(zhì)樣品選擇性移除緩沖液直至達到所需濃度。通過視蛋白質(zhì)大小而定，以分子量截斷值3kda、10kda或30kda在amicon離心過濾器(millipore)中離心(10,000xg)10mg蛋白質(zhì)來對蛋白質(zhì)溶液進行離心超濾，直至達到所需濃度。視蛋白質(zhì)大小而定，以分子量截斷值3kda、10kda或30kda，在交叉流速12l/m2/min下在hydrosart超濾盒(sartoriusstedim,bohemia,ny)上對蛋白質(zhì)溶液進行超濾。對于大多數(shù)過程，跨膜壓力維持在20psi下，并且執(zhí)行直至達到所需濃度。通過以下方法中的一個或組合來測量以上樣品的蛋白質(zhì)濃度：coomassie加強型蛋白質(zhì)測定、在280nm下的吸光度(a280)和總氨基酸分析。根據(jù)制造商方案進行coomassie加強型蛋白質(zhì)測定(pierce)。在nanodrop2000紫外-可見分光光度計上測量在280nm下的吸光度。使用a280值和使用protparam根據(jù)一級氨基酸序列計算的摩爾消光系數(shù)來測定蛋白質(zhì)濃度(gasteiger,elisabeth等theproteomicsprotocolshandbook.humanapress,2005.571-607.)。如henderson,j.w.等agilenttechnologies(2010)中所述在酸水解之后通過hplc來分析總氨基酸。表e31a.蛋白質(zhì)的溶解度。除非另外指示，否則所有蛋白質(zhì)都在大腸桿菌中產(chǎn)生。an＝黑曲霉，ao＝米曲霉，bs＝枯草芽孢桿菌，ba＝解淀粉芽孢桿菌，kl＝乳酸克魯維酵母，tl＝疏綿狀嗜熱絲孢菌，bl＝地衣芽孢桿菌。如本文所述產(chǎn)生α-甘露糖苷酶處理的seqid-00363和源于ao、ba、kl、tl和bl的蛋白質(zhì)。ph可溶性。于檸檬酸和磷酸氫二鈉的緩沖液混合物中在2.8至7.1的ph范圍內(nèi)測定蛋白質(zhì)的ph可溶性。如表e31b中所概述來制備ph溶液。使蛋白質(zhì)凍干，接著于緩沖液混合物中再混懸，或使蛋白質(zhì)濃縮，接著在最終蛋白質(zhì)濃度5至30mg/ml下外加至緩沖液混合物中。作為對照，也將蛋白質(zhì)溶解于8m尿素溶液中。在室溫下振蕩蛋白質(zhì)溶液10分鐘。通過在650nm下測量蛋白質(zhì)溶液的吸光度來測定蛋白質(zhì)的濁度。接著在1100xg下離心蛋白質(zhì)溶液10分鐘以集結(jié)未溶解或沉淀的蛋白質(zhì)。對可溶性蛋白質(zhì)部分(上清液)取樣，并且通過一種或多種以下方法來測量蛋白質(zhì)濃度：coomassie加強型蛋白質(zhì)測定(pierce)、芯片電泳、凝膠電泳和/或在280nm下的吸光度。如通過bradford和a650值所測定，所選蛋白質(zhì)保持大于80％可溶所處的ph范圍列于表e31c中。表e31b.用于ph可溶性篩選的緩沖液組成。表e31c.蛋白質(zhì)在ph范圍內(nèi)的溶解度。n/a：不適用。熱穩(wěn)定性。根據(jù)制造商標準方案，使用熱漂移穩(wěn)定性試劑盒(enzolifesciences)測定蛋白質(zhì)于檸檬酸和磷酸氫二鈉的在2.8至7.1的ph范圍內(nèi)的緩沖液混合物(以上在表e31b中所述的制劑)中的熱穩(wěn)定性。簡要來說，使用配備有板讀取器(synergymx,biotek)，同時用德克薩斯紅(texasred)濾光片監(jiān)測熒光的實時pcr(rtpcr)熱循環(huán)儀(biorad)，在每30秒0.5℃的速率下將含有1xproteostatts檢測試劑的蛋白質(zhì)溶液(約10mg/ml)從25℃加熱至95℃。聚集溫度(tagg)鑒定為在熒光強度隨溫度而變的跡線中觀察到最陡峭斜率所處的溫度。一子組蛋白質(zhì)在ph7.1下的聚集溫度列于表e31d中。一子組蛋白質(zhì)在一定ph范圍內(nèi)的聚集溫度列于表e31e中。表e31d.在ph7.1下的聚集溫度(tagg)表e31e.隨ph而變的聚集溫度(tagg)。ns＝熱穩(wěn)定性測定的其中蛋白質(zhì)不可溶的條件。熱展開。在appliedphotophysicscs/2chirascan分光光度計上通過圓二色性來監(jiān)測蛋白質(zhì)的熱展開。使用0.1cm光程長度槽，從20至90℃每5℃記錄于緩沖液(20mm磷酸鉀，ph7.5)中的蛋白質(zhì)溶液(0.5至1.0mg/ml)的遠紫外測量結(jié)果(200–260nm)。在90℃下收集光譜之后，使蛋白質(zhì)樣品立刻冷卻至20℃，并且記錄最終光譜。將熔解溫度(tmelt)計算為斜率最強烈的溫度，并且將最終光譜與初始20℃光譜進行比較以確定蛋白質(zhì)展開是否可逆或是否已發(fā)生永久結(jié)構(gòu)變化。圖48顯示seqid-00105的代表性cd光譜，從而證明營養(yǎng)性多肽在甚至90c下也未完全展開，并且當冷卻至20c時返回成它的原始折疊。實施例32：營養(yǎng)性多肽糖基化。存在于蛋白質(zhì)上的聚糖常影響諸如溶解度、活性和穩(wěn)定性的性質(zhì)。改變營養(yǎng)性肽的糖基化樣式也可影響它們的生物可用度、營養(yǎng)品質(zhì)和產(chǎn)品配制屬性。此外，基于氨基酸吸收的動力學(xué)與在人蛋白質(zhì)產(chǎn)生期間并入外源性聚糖兩者，營養(yǎng)性食物肽的特定糖樣式會加強對攝取分離的營養(yǎng)性食物肽的代謝應(yīng)答。用于達成糖基化狀態(tài)的宿主選擇。如本文所述，在多種宿主中產(chǎn)生營養(yǎng)性多肽。宿主的選擇對營養(yǎng)性多肽的具有生物物理學(xué)、消化和免疫原性牽涉的糖基化狀態(tài)具有影響。舉例來說，表達宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、人胚腎(hek)和中國倉鼠卵巢細胞(cho)。相較于諸如曲霉屬、釀酒酵母和畢赤酵母屬(pichia)的真核宿主，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌由于它們能夠產(chǎn)生具有未糖化(或最低限度糖化)骨架的多肽而用作表達宿主。歸因于黑曲霉的驅(qū)動向多肽骨架添加富含甘露糖的聚糖的獨特糖基化機構(gòu)，選擇它作為蛋白質(zhì)分泌宿主。歸因于先前證明的能夠替代廣泛寡甘露糖多糖來朝向聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜性降低對宿主糖基化機構(gòu)進行工程改造(kainz等n-glycanmodificationinaspergillusspecies,appl.environ.microbiol.,2008)，選擇構(gòu)巢曲霉作為蛋白質(zhì)分泌宿主。中國倉鼠卵巢(cho)細胞因它們能夠以類似于人細胞的樣式使蛋白質(zhì)糖基化而被選作表達宿主。差異包括galα1-3gal表位與n-羥乙?；窠?jīng)氨酸(neu5gc)兩者均已見于由cho細胞產(chǎn)生的糖蛋白上，但不見于正常人聚糖中(galili,uri等journalofbiologicalchemistry263.33(1988):17755-17762)。此外，在cho細胞中產(chǎn)生的某些蛋白質(zhì)具有更酸性亞型，從而表明唾液酸的含量較高。人胚腎293(hek293)細胞因它們能夠具有人糖基化蛋白質(zhì)而被選作表達宿主。凝膠電泳和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移。為分析糖基化，用識別特定聚糖抗原的抗體或凝集素進行蛋白質(zhì)印跡分析以評估和比較在真核生物和原核生物中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的糖基化分布。首先，根據(jù)制造商方案，使用bis-tris預(yù)澆制凝膠(lifetechnologies)，通過凝膠電泳來進行蛋白質(zhì)分離。根據(jù)制造商方案，使用干印跡系統(tǒng)(lifetechnologies)和western檢測試劑盒(lifetechnologies)，將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜。通過根據(jù)制造商方案，用g-250染色劑simplybluetmsafestain(lifetechnologies)染色聚丙烯酰胺凝膠來觀察蛋白質(zhì)條帶，并且使用moleculargeldoctmxr+系統(tǒng)(bio-rad)來成像。在大腸桿菌和黑曲霉中表達的seqid-00363的糖基化分布。根據(jù)制造商標準方案，使用糖蛋白檢測試劑盒(dig聚糖辨別試劑盒，roche)來考查蛋白質(zhì)的甘露糖含量。為開始考察，將來自用編碼seqid-00363的基因的表達載體(如本文所述)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌的全細胞提取物(5μg)和可溶性細胞溶解產(chǎn)物(5μg)、在黑曲霉中表達的seqid-00363(5μg)、以及dig聚糖辨別試劑盒陽性對照羧肽酶y(5μg)裝載于10％bis-tris凝膠(lifetechnologies)上。如本文所述進行蛋白質(zhì)分離和轉(zhuǎn)移。簡要來說，使硝化纖維素膜與地高辛(dig)標記的雪花蓮(galanthusnivalis)凝集素(gna)一起孵育，所述凝集素是一種結(jié)合末端甘露糖的凝集素。接著使膜與抗地高辛-堿性磷酸酶(ap)一起孵育，隨后與ap底物溶液(nbt/bcip)一起孵育。通過裸眼來定性觀察ap染色的強度，并且為膜拍照。圖49顯示從黑曲霉分離的seqid-00363和在大腸桿菌中重組表達的seqid-00363的代表性coomassie染色凝膠(圖版a)和gna探測的蛋白質(zhì)印跡膜(圖版b)。在泳道2中，約120kd的突出條帶代表糖基化seqid-00363。在泳道3中，約80kd的條帶代表非糖基化seqid-00363。這些結(jié)果證明在黑曲霉中表達的seqid-00363(圖49b，泳道2)是末端甘露糖基化蛋白質(zhì)(圖49b，泳道3)，而在大腸桿菌中表達的seqid-00363在它的聚糖上不含有末端甘露糖殘基。從食物提取蛋白質(zhì)以進行聚糖分析。亞麻籽(有機棕色亞麻籽，farmersdirectcoop)、鷹嘴豆(埃及豆(garbanzobeans)，365everydayvalueorganic)、玉米(冷凍超甜雙色玉米，365everydayvalueorganic)、馬鈴薯(常規(guī)黃色馬鈴薯)、蘑菇(有機白蘑菇)、花椰菜(冷凍綠花菜(broccoliflortes)，365everydayvalue)、番茄(常規(guī)羅馬番茄(romatomato))、藍莓(有機藍莓，littlebuckorganics)、葡萄(有機紅色無籽葡萄，anthony’sorganic)、牛肉(85％瘦性絞細牛肉)、雞肉(絞細雞大腿，無骨，無皮，airchilled)、羊羔肉(絞細新西蘭羊羔肉)、火雞肉(絞細火雞大腿)、鱈魚(野生鱈魚片)和豬肉(絞細豬肉)購自wholefoods。提供鹿肉。將各食物來源的等分試樣(50-2,500mg)冷凍在-80℃下。通過用研缽和研杵研磨樣品，隨后添加1.0ml提取緩沖液(8.3m尿素、2m硫脲、2％w/vchaps、1％w/vdtt)并用研杵再研磨來從食物來源提取蛋白質(zhì)。將樣品轉(zhuǎn)移至微量離心管中，并且在室溫下攪拌30分鐘，隨后添加500μl100μm鋯珠粒(opsdiagnostics)，并且再進一步攪拌30分鐘。接著在tissuelyserii(qiagen)上在30hz下使樣品溶解3分鐘，在21,130xg下離心10分鐘，并且收集上清液。通過溶解于提取緩沖液中來制備酵母(營養(yǎng)酵母，wholefoods)、大豆蛋白質(zhì)分離物(大豆蛋白質(zhì)粉，wholefoods)和稻米蛋白質(zhì)分離物(有機稻米蛋白質(zhì)，growingnaturals)。根據(jù)制造商標準方案，通過coomassie加強型蛋白質(zhì)測定(pierce)來測定樣品的總蛋白質(zhì)濃度。通過蛋白質(zhì)印跡分析來檢測n-羥乙?；窠?jīng)氨酸(neu5gc)。n-羥乙?；窠?jīng)氨酸(neu5gc)是見于大多數(shù)哺乳動物聚糖上的唾液酸，但不存在于人蛋白質(zhì)糖蛋白上。人生物化學(xué)路徑不將neu5gc唾液酸識別為外來的，從而導(dǎo)致在攝取至高爾基體中以及并于新合成的蛋白質(zhì)上之后有痕量見于人糖蛋白中。盡管以生物化學(xué)方式整合，然而，免疫系統(tǒng)將含有外部源性唾液酸的經(jīng)調(diào)整表面構(gòu)象識別為外來的，從而增加許多疾病的風(fēng)險。已在人血漿中檢測到的抗neu5gc抗體應(yīng)答于攝取含有neu5gc的蛋白質(zhì)來源而導(dǎo)致慢性炎癥(varki等“uniquelyhumanevolutionof唾液酸geneticsandbiology”,pnas2011)。neu5gc的主要來源包括羊羔肉、牛肉、豬肉以及甚至乳制品，其中痕量也見于魚中(tangvoranuntakul等,2003,pnas,100(21):12045-12050)。用抗neu5gc抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析以表征從食物提取的蛋白質(zhì)以及由細菌宿主重組表達的蛋白質(zhì)的neu5gc含量。從如本文所述的肉類來源提取蛋白質(zhì)。此外，通過如本文所述用個別表達載體轉(zhuǎn)化，或通過如本文所述用某一文庫的表達載體轉(zhuǎn)化來在大腸桿菌和/或枯草芽孢桿菌中重組表達蛋白質(zhì)。如本文所述通過imac純化來純化源于個別表達載體的蛋白質(zhì)，以及在一些情況下源于某一文庫的表達載體的蛋白質(zhì)。制備在大腸桿菌中重組表達的純化蛋白質(zhì)的混合物(蛋白質(zhì)混合物1)以在最終濃度約1mg/ml下含有各蛋白質(zhì)。這個混合物中包括的蛋白質(zhì)以及它們天然產(chǎn)生于其中的物種是seqid-00076(母牛)、seqid-00240(母牛)、seqid-00298(母牛)、seqid-00359(綿羊)和seqid-00510(火雞)。將各肉類提取物(牛肉、豬肉、鹿肉、羊羔肉、火雞肉、雞肉和鱈魚)的樣品、蛋白質(zhì)混合物1、在大腸桿菌(imac純化的溶解產(chǎn)物)和枯草芽孢桿菌(imac純化的溶解產(chǎn)物和未純化的上清液和溶解產(chǎn)物)中表達的168種營養(yǎng)性多肽的文庫、以及在大腸桿菌(rosetta、gamib和gami2可溶性溶解產(chǎn)物和rosetta全細胞)和枯草芽孢桿菌(ph951grac溶解產(chǎn)物)中表達的cdna文庫裝載于10％bis-tris凝膠(lifetechnologies)上。如本文所述進行蛋白質(zhì)分離和轉(zhuǎn)移。根據(jù)標準制造商方案，使用snap蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)(millipore)，用兩者均于bloktm-po阻斷緩沖液中3:5,000稀釋的雞抗neu5gc(igy)初級抗體(biolegend)和山羊抗雞igy辣根過氧化物酶(hrp)二級抗體檢測neu5gc。根據(jù)制造商方案，用luminataclassicowesternhrp底物(millipore)處理印跡，并且在moleculargeldoctmxr+系統(tǒng)(bio-rad)上使用化學(xué)發(fā)光檢測來成像。圖50顯示代表性coomassie染色凝膠(圖版a)和抗neu5gc探測蛋白質(zhì)印跡膜(圖版b)。這些結(jié)果證明盡管neu5gc存在于從母牛肉、豬肉、綿羊肉、火雞肉和雞肉提取的蛋白質(zhì)中，但它不存在于來自這些動物的已在大腸桿菌或枯草芽孢桿菌中重組表達的蛋白質(zhì)中。通過蛋白質(zhì)印跡分析來檢測木糖和海藻糖。木糖和海藻糖是常存在于植物糖蛋白上，并且可對人具有免疫原性的糖(bardor等,2003,glycobiology,13(6):427-434)。使用抗木糖和抗海藻糖抗體，通過蛋白質(zhì)印跡分析來考查從食物來源提取的蛋白質(zhì)和由細菌宿主重組表達的蛋白質(zhì)的木糖和海藻糖含量。如本文所述，通過從食物來源提取或通過復(fù)原購買的蛋白質(zhì)分離物來制備蛋白質(zhì)樣品。如本文所述在大腸桿菌中重組表達蛋白質(zhì)，并且通過imac純化來純化。制備在大腸桿菌中重組表達的純化蛋白質(zhì)的混合物(蛋白質(zhì)混合物2)以在最終濃度約1mg/ml下含有各蛋白質(zhì)。這個混合物中包括的蛋白質(zhì)以及它們天然產(chǎn)生于其中的物種是seqid-00103(稻米)、seqid-00104(玉米)、seqid-00352(玉米)、seqid-00485(鷹嘴豆)、seqid-00559(稻米)、seqid-00598(亞麻籽)和seqid-00605(蘑菇)。將各植物和真菌提取物(酵母、亞麻籽、鷹嘴豆、玉米、馬鈴薯、蘑菇、大豆、稻米、花椰菜、番茄、藍莓和葡萄)的樣品、蛋白質(zhì)混合物2、辣根過氧化物酶(陽性對照)和胎球蛋白(fetuin)(陰性對照)裝載于10％bis-tris凝膠(lifetechnologies)上。如本文所述進行蛋白質(zhì)分離和轉(zhuǎn)移。根據(jù)標準制造商方案，使用snap蛋白質(zhì)檢測系統(tǒng)(millipore)進行蛋白質(zhì)印跡分析。通過用分別于bloktm-po阻斷緩沖液中3:5,000和3:2,500稀釋的兔抗木糖初級抗體(agrisera)和驢抗兔igg-hrp二級抗體(abcam)進行印跡來檢測木糖。通過用分別于bloktm-po阻斷緩沖液中3:10,000和3:3,000稀釋的兔抗海藻糖初級抗體(agrisera)和驢抗兔igg-hrp二級抗體(abcam)進行印跡來檢測海藻糖。根據(jù)制造商方案，用luminataclassicowesternhrp底物(millipore)處理印跡，并且在moleculargeldoctmxr+系統(tǒng)(bio-rad)上使用化學(xué)發(fā)光檢測來成像。圖51說明代表性coomassie染色凝膠、抗木糖探測蛋白質(zhì)印跡膜和抗海藻糖探測蛋白質(zhì)印跡膜。這些結(jié)果證明盡管木糖與海藻糖兩者均存在于從亞麻籽、鷹嘴豆、玉米、馬鈴薯、大豆、稻米、花椰菜、番茄、藍莓和葡萄提取的植物蛋白質(zhì)中，但它們不存在于來自植物和真菌來源的已在大腸桿菌中重組表達的蛋白質(zhì)中。選擇具有高天冬酰胺、絲氨酸和/或蘇氨酸質(zhì)量組成的蛋白質(zhì)以降低營養(yǎng)性多肽糖基化。可通過選擇糖基化位點數(shù)較低的序列來降低營養(yǎng)性多肽的糖基化狀態(tài)。這些位點包括用于n連接的糖基化的天冬酰胺以及用于o連接的糖基化的絲氨酸和蘇氨酸。由于沿多肽結(jié)合的多糖組成水平降低，所以這些分離的多肽含有較高氨基酸質(zhì)量百分比，從而允許每克營養(yǎng)性多肽有較高可消化氨基酸劑量，并且在消耗后具有降低的免疫活性。沿營養(yǎng)性多肽骨架可用的聚糖接受體位點的n連接的糖基化主要發(fā)生在天冬酰胺氨基酸殘基處。表達由于它們的天冬酰胺水平較低而選擇的異源性多肽允許分離聚糖結(jié)構(gòu)降低的多肽。沿營養(yǎng)性多肽骨架可用的聚糖接受體位點的o連接的糖基化主要發(fā)生在絲氨酸和蘇氨酸氨基酸殘基處。表達由于它們的絲氨酸或蘇氨酸水平較低而選擇的異源性多肽允許分離聚糖結(jié)構(gòu)降低的多肽。選擇具有高天冬酰胺、絲氨酸和/或蘇氨酸質(zhì)量組成的蛋白質(zhì)以增加營養(yǎng)性多肽糖基化。可通過選擇富含糖基化位點的序列來增加營養(yǎng)性多肽的糖基化狀態(tài)。這些位點包括用于n連接的糖基化的天冬酰胺以及用于o連接的糖基化的絲氨酸和蘇氨酸。糖基化增加可使得能夠增加營養(yǎng)性多肽的溶解度和熱穩(wěn)定性。沿營養(yǎng)性多肽骨架可用的聚糖接受體位點的n連接的糖基化主要發(fā)生在天冬酰胺氨基酸殘基處。表達由于它們的天冬酰胺水平較高而選擇的異源性多肽允許分離聚糖結(jié)構(gòu)增加的多肽。沿營養(yǎng)性多肽骨架可用的聚糖接受體位點的o連接的糖基化主要發(fā)生在絲氨酸和蘇氨酸氨基酸殘基處。表達由于它們的絲氨酸或蘇氨酸水平較高而選擇的異源性多肽允許分離聚糖結(jié)構(gòu)增加的多肽。從分離的營養(yǎng)性多肽移除聚糖。營養(yǎng)性多肽的糖基化狀態(tài)可對結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)具有影響。如本文所述，在重組宿主中表達的營養(yǎng)性多肽具有的糖基化可不同于天然存在。如果產(chǎn)生具有糖基化的營養(yǎng)性多肽，那么可使用化學(xué)或酶促方法使聚糖釋放以改變結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)。聚糖釋放的常見化學(xué)方法是肼解和堿性/還原性條件(β-消除)(takasaki,seiichi等methodsinenzymology83(1981):263-268.)?？墒褂脙?nèi)切糖苷酶，諸如png酶f、endo-h、endof2、png酶a或o-聚糖酶，或使用外切糖苷酶，諸如唾液酸酶、α半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、己糖胺酶、半乳糖胺酶、α甘露糖苷酶、β甘露糖苷酶、α海藻糖苷酶，使聚糖從蛋白質(zhì)釋放，精確酶是基于寡糖組成和鍵聯(lián)加以選擇(merry,tony等capillaryelectrophoresisofcarbohydrates.humanapress,2003.27-40.)。png酶f是一種極其有效用于從糖蛋白移除幾乎所有n連接的寡糖的酶促方法。png酶f消化使天冬酰胺殘基脫氨基成為天冬氨酸，并且保持寡糖完整。為使用內(nèi)切糖苷酶使蛋白質(zhì)去除糖基化，將500ug糖蛋白再混懸于50ul50mm磷酸鈉(ph7.5)中。在0.1u/ml下添加png酶f，并且在37℃下孵育溶液24小時。通過sds-page來監(jiān)測反應(yīng)的完成。篩選ige介導(dǎo)的歸因于聚糖的過敏應(yīng)答。對營養(yǎng)性多肽的聚糖修飾的變化會影響ige結(jié)合相互作用。約20％或大于20％的過敏患者產(chǎn)生特異性抗聚糖ige，其常伴有igg(altmann,f.theroleofproteinglycosylationinallergy,intarchallergyimmunol.2007)。對于誘導(dǎo)ige介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的多肽(過敏原就是這樣的情況)，相較于在多肽的天然組成的情況下，如本文所述的聚糖修飾可降低分離的多肽的過敏原性。在這個實施例中，篩選在體外血清測定中進行ige結(jié)合以及根據(jù)皮膚點刺測試(如mari,a等igetocross-reactivecarbohydratedeterminants:analysisofthedistributionandappraisaloftheinvivoandinvitroreactivity,2002中所述)具有反應(yīng)性的多肽。可通過比較皮膚點刺測試與ige血清結(jié)合測定的結(jié)果來確定歸因于聚糖(稱為交叉反應(yīng)性碳水化合物決定簇)的過敏原性應(yīng)答。招募未經(jīng)選擇的呈現(xiàn)暗示過敏性疾病的呼吸癥狀，并且提交給過敏室的連串受試者。記錄各患者的人口統(tǒng)計和臨床數(shù)據(jù)。從研究排除具有臨床過敏史的患者。不排除先前尚未接受特定免疫療法(sit)過程的那些患者。所有處理患者都接受呈分離形式與呈天然組成形式兩者的營養(yǎng)性多肽的明礬吸附提取物。出于統(tǒng)計目的，僅評估花粉處理的患者?；颊呓?jīng)受使用上述過敏原性提取物，以標準化程序和記錄(mari,a.等specificigetocross-reactivecarbohydratedeterminantsstronglyaffecttheinvitrodiagnosisofallergicdiseases.jallergyclinimmunol1999)進行的皮膚點刺測試(spt)。在spt之后，從同意采血的患者獲得血清以進行體外診斷程序。將血清儲存在–20℃下直至需要。在過敏咨詢期間通過患者或護理者來獲得皮膚測試和采血的知情同意書。測定所有血清中的總ige(radim,pomezia,italy)。遵循制造商說明書(pharmacia,uppsala,sweden)，通過cap系統(tǒng)來檢測過敏原特異性ige。值60.4kua/l被視為陽性。因為不存在單一測試來檢測ccd-ige，所以對攜帶由ige識別的碳水化合物部分的營養(yǎng)性多肽的陽性體外測試與對相同糖蛋白的陰性spt之間的結(jié)果偏差被假定指示存在ccd-ige。對在對相同過敏原性提取物的spt中記錄為陰性的大量隨機血清樣品進行ige檢測。介導(dǎo)與ige的結(jié)合的聚糖結(jié)構(gòu)的修飾是通過在分離營養(yǎng)性多肽以及確認聚糖結(jié)構(gòu)改變后檢測到ccd-ige的患者中的分布轉(zhuǎn)變來觀察。實施例33.于動物中說明營養(yǎng)性多肽氨基酸藥物動力學(xué)。可進行藥物動力學(xué)(pk)研究以評估在口服施用營養(yǎng)性多肽制劑之后，氨基酸的血漿濃度。所述分析提供關(guān)于蛋白質(zhì)在胃腸道中的消化速率和程度以及在消化期間釋放的游離氨基酸和/或肽的生物可用度的信息。小腸轉(zhuǎn)送速率類似于成人(3-4小時)的生長中的大鼠被接受為一種適于以口服施用進行的藥物動力學(xué)研究的模型(desesso和jacobson(2001)anatomicalandphysiologicalparametersaffectinggastrointestinalabsorptioninhumansandrats,foodandchemicaltoxicology39:209-228)。大鼠藥物動力學(xué)研究。伴有置留性頸靜脈導(dǎo)管(jvc)的雄性spraguedawley大鼠購自harlanlaboratories，并且在研究啟始之前使其適應(yīng)于測試設(shè)施(agiluxlaboratories)至少2天。在劑量施用之前，使動物禁食過夜(11–13小時)，并且保持禁食直至完成研究。通過連接于注射器的球部尖端18規(guī)格不銹鋼管飼針來口服施用測試物品。在給藥之前和之后記錄所有給藥注射器的重量以更準確測定給藥溶液的量。在時間0(給藥前)以及給藥后0.25、0.5、1、2和4小時從jvc收集連續(xù)血液樣品(約300μl)。將血液樣品收集至含有抗凝劑k2edta(一般性蛋白酶抑制劑混合物)(sigmap8340，于全血中1:100稀釋)和dppiv抑制劑(milliporedpp4，于全血中1:100稀釋)的管中。在血液收集之后立刻將管渦旋并儲存在濕冰上直至在收集的1小時內(nèi)通過離心(3,500rpm，在5℃下)來處理成血漿。接著將血漿樣品轉(zhuǎn)移至新管中，并且儲存在-80℃下。在一些情況下，在終末血液收集之后，使動物安樂死，并且收集末端回腸和它的內(nèi)含物并如本文所述加以分析。如本文所述通過hplc氨基酸分析來測定血漿樣品中的glu、ser、his、gly、thr、arg、ala、tyr、val、met、phe、ile、leu和lys的濃度。在hplc氨基酸分析之前，通過離心(1100xg，在4℃下)10分鐘來從血漿樣品移除不溶性粒子。接著將25μl可溶性部分的樣品轉(zhuǎn)移至96孔板中，對于一些樣品，將內(nèi)標(正纈氨酸，agilent)在最終濃度0.5mm下添加至各血漿樣品中。通過使用包括提供于補充氨基酸試劑盒(agilent)中的個別標準物儲備物的標準混合物，以及將樣品的色譜分布與組合的標準物的色譜分布進行比較來分析在當前hplc氨基酸分析中未測出的氨基酸，包括gln、asn、trp、羥基脯氨酸(hyp)和肌氨酸(sar)。因為含有補充標準物的溶液在室溫下不穩(wěn)定，所以補充性氨基酸標準物是在使用之前立刻制備，并且不長于24小時加以使用。圖52顯示在表e33a中所列的劑量下口服施用指示的營養(yǎng)性多肽之后，在4小時內(nèi)從大鼠收集的血液樣品中測量的血漿氨基酸濃度的平均曲線下面積(auc)(±sd)(μm·h)的變化。圖53顯示seqid-00105作為口服施用營養(yǎng)性多肽，從而改變大鼠血漿中的氨基酸濃度的一實例。在口服施用之后在大鼠血漿中檢測的氨基酸的分布取決于營養(yǎng)性多肽的氨基酸序列。舉例來說，口服施用多肽seqid-00240、seqid-00338和seqid-00352使血漿lys的auc0-4h的變化增加，而施用多肽seqid-00363、seqid-00424和seqid-00426不改變血漿lys的auc0-4h的變化(圖52)。另外，營養(yǎng)性多肽seqid-00240充當能夠遞送必需氨基酸(eaa)，同時不導(dǎo)致血漿phe濃度波動的多肽的一實例。圖54說明向大鼠口服施用seqid-00105(2.85g/kg)的代表性血漿氨基酸濃度時間曲線。圖54說明在表e33a中指示的劑量下口服施用seqid-00105之后對血漿leu濃度的劑量-應(yīng)答效應(yīng)?？傊@些結(jié)果證明口服施用營養(yǎng)性多肽可用于在大鼠中向全身性循環(huán)遞送特定氨基酸分布。表e33a.用于大鼠藥物動力學(xué)研究中的營養(yǎng)性多肽和劑量的清單。na：不適用。實施例34：調(diào)節(jié)營養(yǎng)性多肽可消化性。多種蛋白質(zhì)修飾方法用于改變模型營養(yǎng)性多肽seqid-00363的結(jié)構(gòu)。執(zhí)行這些方法以評估特定結(jié)構(gòu)特征關(guān)于蛋白質(zhì)可消化性和生物可用度的相關(guān)性。這些修飾包括降低聚糖、水解蛋白質(zhì)、還原/烷基化二硫鍵以及熱變性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。使用體外消化測定以及在一些情況下體內(nèi)測定評估由這些修飾獲得的物質(zhì)的消化改進。這些方法或產(chǎn)生類似結(jié)構(gòu)變化結(jié)局的其它手段可應(yīng)用于其它營養(yǎng)性多肽。酶促去糖基化。預(yù)測seqid-00363含有高甘露糖o連接的糖基化(goto等,2007biosci.biotechnol.biochem.)。為評估糖基化對seqid-00363消化的影響，以酶促方式顯著降低甘露糖聚糖。非特異性α甘露糖苷酶(m7257，批號slbc4303v，sigmaaldrich,st.louis,mo)用于裂解o-聚糖內(nèi)的所有1-3、1-4和1-6糖苷鍵聯(lián)。這個α甘露糖苷酶不裂解任何非甘露糖糖苷鍵聯(lián)；預(yù)測這個酶針對n連接的聚糖釋放是無效的。去糖基化反應(yīng)從jafari-aghdam等,2005biochimicaetbiophysicaacta改適。seqid-00363的蛋白質(zhì)儲備物由凍干粉末于以下去糖基化反應(yīng)緩沖液中再混懸以獲得酶濃度100g/l：20mm乙酸鈉、2mm氯化鋅、0.01％2-巰基乙醇，ph4.3。將試劑儲備物稀釋至去糖基化反應(yīng)物中以獲得最終體積0.5l。在10g/l的seqid-00363濃度和每mgseqid-003630.5eu的α甘露糖苷酶濃度下進行反應(yīng)。將反應(yīng)物于20l去糖基化反應(yīng)緩沖液中經(jīng)0.2um過濾器無菌過濾直接進入7x70ml3.5kd透析盒中。以透析進行反應(yīng)以降低所提出的由釋放的(單/多)糖對α甘露糖苷酶的反饋抑制。接著將反應(yīng)物在37℃下儲存6天。在整個反應(yīng)過程期間，約10％的seqid-00363由于不溶性聚集體形成而損失。在終末(6天)時間點，從透析收集反應(yīng)物，無菌過濾，濃縮，并且透濾至10％磷酸鹽緩沖鹽水(ph7.4)中。通過根據(jù)如本文所述的sds-page和抗gna蛋白質(zhì)印跡的大小降低來監(jiān)測甘露糖聚糖的成功降低。為產(chǎn)生去糖基化seqid-00363的高蛋白質(zhì)濃度制劑，在amicon旋轉(zhuǎn)濃縮器(emdmillipore,billerica,ma)中濃縮剩余匯合物直至最終濃度接近250g/l。高濃度制劑在4℃下保持可溶，并且被保持在那個溫度下以進行長期儲存。蛋白質(zhì)水解。用以相對于天然蛋白質(zhì)的制劑來增加生物可用度的另一方法是水解成短肽。通過枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)介導(dǎo)的蛋白水解來酶促產(chǎn)生諸如乳清(perea等,1993enzymemicrob.technol.)和大豆(kong等,2008bioresourcetechnology)的商品蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物?？莶輻U菌蛋白酶在ph8.5和55℃下最具活性(alder-nissen,1986)。出于這個實驗的意圖，將模型蛋白質(zhì)酶的凍干制劑再混懸于100mm碳酸鈉中以獲得275g/l來使所得蛋白質(zhì)溶液的ph達到約ph8。將枯草桿菌蛋白酶(堿性蛋白酶(alcalase)2.4l，sigmaaldrich,st.louis,mo)在每mg模型蛋白質(zhì)酶5.93x10-4u的濃度下添加至蛋白質(zhì)溶液中。接著將反應(yīng)物稀釋以獲得250g/l模型蛋白質(zhì)酶，并且轉(zhuǎn)移至55℃，持續(xù)24小時。一旦完成，即將水解物質(zhì)儲存在4℃下。通過使用superdex75(5x150mm)柱(gehealthcare,uppsala,sweden)進行尺寸排阻色譜法(sec)，并且也通過sds-page分析來監(jiān)測反應(yīng)進展。蛋白質(zhì)還原和烷基化?？墒购卸蚧锏牡鞍踪|(zhì)還原和烷基化以破壞二硫鍵并使游離硫醇穩(wěn)定。這個修飾破壞所有二硫橋鍵結(jié)構(gòu)，并且此外防止二硫橋鍵在分子內(nèi)或分子外再形成。seqid-00363含有10個半胱氨酸和4個二硫鍵，如通過scratch蛋白質(zhì)預(yù)測器所預(yù)測(cheng等,2005nucleicacidsres.)。使用bio-radreadyprep還原/烷基化試劑盒(bio-rad,hercules,ca)在最終濃度6g/l下使seqid-00363還原和烷基化。如由制造商說明書所推薦來進行還原/烷基化反應(yīng)。在50mm磷酸鹽(ph8.0)中使seqid-00363還原和烷基化。通過非還原性sds-page分析來分析樣品。熱誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)去穩(wěn)定化。蛋白質(zhì)變性涉及破壞分子的有序結(jié)構(gòu)；即使所有四級、三級和二級結(jié)構(gòu)減為一級結(jié)構(gòu)。變性破壞所有非共價分子內(nèi)相互作用；即氫鍵合、離子相互作用、vanderwaals相互作用和疏水性相互作用。熱可用于破壞這些相互作用，并且使天然蛋白質(zhì)減為它的一級結(jié)構(gòu)(除二硫鍵之外)。將seqid-00363于10％pbs(ph7.4)中稀釋至30g/l，并且快速加熱至95℃。在煮沸后，從熱處理移除蛋白質(zhì)并且立刻轉(zhuǎn)移至如本文所述的體外消化分析。seqid-00363的修飾形式的體外可消化性。使用本文所述的方法評估天然seqid-00363和seqid-00363的修飾形式(即去糖基化、還原和烷基化、以及熱變性)的可消化性。簡要來說，seqid-00363的天然和修飾形式用模擬胃液(sgf)處理，并且如本文所述通過凝膠電泳來分析在各種時間點剩余的完整蛋白質(zhì)的存在性。另外，如本文所述通過反相hplc氨基酸分析來分析在暴露于基于胰酶的模擬消化系統(tǒng)之后存在的游離氨基酸的量。由sgf消化seqid-00363的天然和修飾形式獲得的結(jié)果證明通過去糖基化、還原和烷基化、以及熱變性對seqid-00363的修飾會在不同程度上增強蛋白質(zhì)的可消化性。由胰酶消化seqid-00363的天然和修飾形式獲得的結(jié)果證明通過去糖基化和熱變性而非還原和烷基化對seqid-00363的修飾使消化期間游離leu的釋放增強。表e34a列出由指數(shù)衰減曲線計算的半衰期值和在120分鐘時間點的游離leu(μm)。表e34a.以分鐘計的sgf半衰期(t1/2)和在胰酶消化修飾的營養(yǎng)性多肽的120分鐘時間點的游離leu(μm)seqid-00363的修飾形式的生物可用度。使用本文所述的方法評估seqid-00363的天然和修飾形式(即去糖基化和水解)的生物可用度。簡要來說，向插有頸靜脈內(nèi)導(dǎo)管的大鼠口服施用seqid-00363的天然和修飾形式，并且通過hplc氨基酸分析來測定在4小時時期內(nèi)收集的血漿樣品中的游離氨基酸的濃度。對在seqid-00363的天然和修飾形式的大鼠藥物動力學(xué)研究中收集的血漿樣品的氨基酸分析顯示于圖55中。這些結(jié)果證明水解seqid-00363使亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸以及一般來說必需氨基酸(eaa)的生物可用度增加。盡管seqid-00363的去糖基化不增加亮氨酸或eaa的生物可用度，但它使絲氨酸和蘇氨酸的生物可用度增加。seqid-00363的修飾形式的回腸可消化性。蛋白質(zhì)品質(zhì)隨氨基酸組成、可消化性和生物可用度而變?；啬c可消化性測定可用于測量蛋白質(zhì)的內(nèi)含物(即氨基酸、氮、干物質(zhì)重量)與在攝取蛋白質(zhì)之后末端回腸中的消化物的內(nèi)含物之間的差異。由回腸可消化性測定獲得的結(jié)果可用于計算氨基酸、氮和干物質(zhì)回腸可消化性系數(shù)，并且提供關(guān)于蛋白質(zhì)的可消化性和氨基酸生物可用度的認識(darragh和hodgkinson,2000,journalofnutrition,130(7):1850s-1856s)。由于大腸中的微生物代謝，所以歷經(jīng)整個消化道確定的糞便可消化性系數(shù)傾向于過高估計氨基酸可消化性和生物可用度。因為蛋白質(zhì)消化和氨基酸吸收主要發(fā)生在上部小腸中，并且截至回腸末端有效完成，所以回腸可消化性測定現(xiàn)時被接受為用于確定單胃哺乳動物中的蛋白質(zhì)和氨基酸可消化性的所選方法。小腸轉(zhuǎn)送速率類似于成人(3-4小時)的生長中的大鼠被接受為一種適于回腸可消化性測定的模型(amidon等,1986,thejournalofpharmacyandpharmacology,38(5):363-368)。如本文所述以口服施用seqid-00363的天然和修飾形式來進行大鼠藥物動力學(xué)研究。將不可消化標志物edta鈷在50mg/l下配制于給藥蛋白質(zhì)溶液中以監(jiān)測處理組與個別大鼠之間的腸轉(zhuǎn)送速率差異。在最終血液收集(在t＝4小時)之后，使大鼠安樂死，并且將末端回腸(在盲腸之前的20cm小腸)和它的內(nèi)含物(消化物)收集至預(yù)稱重管中。回腸用鹽水沖洗，并且與消化物匯合。用hcl將消化物的ph調(diào)整至約3.0以使所有酶失活。將回腸樣品放置至單獨預(yù)稱重15ml錐形管中。所有樣品都快速冷凍在液氮中，并且儲存在-80℃下直至進一步分析。計算并記錄各樣品的個別回腸和回腸內(nèi)含物重量。以含有不溶性粒子的異質(zhì)溶液形式存在的消化物的樣品如本文所述在coomassie加強型蛋白質(zhì)測定中用于測定蛋白質(zhì)濃度。從施用媒介物、天然seqid-00363、去糖基化的seqid-00363和水解的seqid-00363的大鼠收集的消化物樣品中的平均總蛋白質(zhì)濃度分別是0.1、0.9、0.9和0.3mg/ml?；谑占南锏捏w積，從施用媒介物、天然seqid-00363、去糖基化的seqid-00363和水解的seqid-00363的大鼠收集的消化物樣品中的總蛋白質(zhì)質(zhì)量分別是1.2、6.9、7.7和2.2mg。這些結(jié)果證明施用天然和去糖基化的seqid-00363的大鼠的消化物中的蛋白質(zhì)的濃度和總質(zhì)量高于施用媒介物或水解的seqid-00363的大鼠中。總之，這些結(jié)果表明在大鼠胃腸系統(tǒng)中，水解的seqid-00363比天然或去糖基化的seqid-00363更完全被消化。為確定回腸可消化性系數(shù)，分析給藥樣品的等分試樣和回腸消化物樣品的總氨基酸含量(通過反相hplc氨基酸分析)(lookhart和jones,1985,cerealchemistry,62(2):97-102)、總氮含量(通過kjeldhal分析)(lynch和barbano,1999,journalofaoacinternational,82(6):1389-1398)和鈷含量(通過電感耦合等離子體質(zhì)譜測定法(icp-ms))(taylor,h.e.,inductivelycoupledplasma-massspectrometry:practicesandtechniques,academicpress,2001)以確定回腸氨基酸和氮可消化性系數(shù)。實施例35.處理營養(yǎng)性多肽以達成活性降低修飾酶活性營養(yǎng)性多肽可改變蛋白質(zhì)的酶活性與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性兩者。對于口服施用的營養(yǎng)性多肽，可為有利的是缺乏不為遞送氨基酸營養(yǎng)物所需的活性。此外，去活化指示可比它的天然對應(yīng)物更可消化和生物可用的去穩(wěn)定化。通過化學(xué)或熱處理來實現(xiàn)酶修飾。通過體外測定來測量酶活性?；钚詼y定。通過葡糖淀粉酶活性測定來測試seqid-00363的失活。葡糖淀粉酶起將對硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷水解成對硝基苯酚(pnp)和葡萄糖的作用。通過在400nm下測量釋放的pnp的吸光度(方法從葡糖淀粉酶活性測定(u.s.pharmacopeia.foodchemicalscodex,第8版；2012:1314-1315.)改適)來測定以每ml的單位數(shù)(u)計的酶活性。于0.3m碳酸鈉中在0.12、0.06、0.03、0.015和0.0075μmol/ml下的pnp標準物用于使用以下等式確定毫摩爾消光系數(shù)(ε)：ε＝a400nm/c，其中考慮的是平均值，其中a400nm是在400nm下使用分光光度計在10mm光程下測量的吸光度，并且c是以μmol/ml計的標準濃度。于0.1m乙酸鈉(ph4.5)中在屬于標準物的吸光度范圍內(nèi)的稀釋度下制備樣品。使100μl樣品在50℃下孵育5分鐘，隨后添加100μl已在50℃下平衡至少15分鐘的pnpg溶液(100mgpnpg于0.1m乙酸鈉(ph4.5)中稀釋至100ml)。接著在50℃下孵育樣品，并且在pnpg添加之后10分鐘添加100μl0.3m碳酸鈉以終止反應(yīng)。接著測量在400nm下的吸光度，并且如下計算以u/ml計的活性：活性＝[(a樣品–a空白)x0.3mlx稀釋因數(shù)]/εx10分鐘x0.10μmol/min/單位x0.1ml，其中a樣品是樣品吸光度，并且a空白是400nm下的空白吸光度，0.3ml是反應(yīng)體積，10分鐘是反應(yīng)時間，0.10μmol/min是每單位酶裂解的pnp的量，并且0.1ml是樣品等分試樣。1:1:1:0.1m乙酸鈉ph4.5:0.3m碳酸鈉:pnpg溶液用作空白?；钚员粓蟮罏楸然钚?u/ml或u/mg)或相對活性(即相較于對照蛋白質(zhì))。用于去活化的蛋白質(zhì)修飾。可通過化學(xué)誘導(dǎo)的使分子的酶活性位點去穩(wěn)定化來使蛋白質(zhì)酶去活化。進行篩選包括以下的一子組代表不同化學(xué)類別和作用機理的試劑的實驗：氧化(漂白劑、h2o2、氧化乙烯)；還原(dtt、bme、tcep)；離液劑(cacl2、尿素、gndhcl、nascn)；高ph(na2co3、tris堿、na2hpo4)；低ph(檸檬酸三鈉、trishcl、乙酸、硼酸)；中性ph(檸檬酸鈉、mops酸、mes酸、乙酸鈉)；去污劑(吐溫80、triton-x-100、chaps、sds、mpd)；螯合(edta、檸檬酸鹽)。于水中配制seqid-00363以獲得300g/l，并且10倍稀釋以獲得一系列化學(xué)去活化條件(最終濃度＝30g/l)。隨后在10分鐘去活化和4天去活化之后測定seqid-00363的酶活性(表e35a)。表e35a.對seqid-00363的化學(xué)去活化。在4天時間點的酶活性測定結(jié)果。所有酶活性都相對于陰性對照(水)加以標準化。相對于水去活化陰性對照，seqid-00363在強離液劑，諸如6mgnd·hcl和4m尿素；高ph碳酸鈉制劑；和強氧化劑次氯酸鈉(家用漂白劑)中顯示最大去活化。在t＝4天時，這些條件都顯示在4天處理之后的相對酶活性小于20％。由于與消耗劇烈氧化劑和強離液劑相關(guān)的健康風(fēng)險，在高ph下處理seqid-00363被鑒定為用于使酶去活化的最佳條件。相對于10分鐘時間點，在4天時間點獲取的樣品表明在室溫下進行化學(xué)去活化不是快速起效過程。在許多測定條件下，去活化的動力學(xué)可能不是極其快速的。測試在多種緩沖條件下由熱量對seqid-00363的實驗測量去活化。將seqid-00363于20mm磷酸鈉(ph7)、20mm磷酸鈉(ph9)、20mm碳酸鈉(ph11)和水中稀釋至3g/l。接著在pcr熱循環(huán)儀中在環(huán)境溫度、60℃、70℃、80℃和90℃下處理各緩沖液的100μl樣品5分鐘。通過葡糖淀粉酶活性測定來測試各酶的活性，并且各活性相對于在環(huán)境溫度下于水中的活性(對照)加以標準化。結(jié)果以下顯示于表e35b中。表e35b.對seqid-00363的化學(xué)去活化。在4天時間點的酶活性測定結(jié)果。所有酶活性都相對于陰性對照(水)加以標準化。條件活性(環(huán)境水％)水，環(huán)境100％水，60℃84％水，70℃14％水，80℃3％水，90℃3％20mm磷酸鈉，ph7，環(huán)境101％20mm磷酸鈉，ph7，60℃53％20mm磷酸鈉，ph7，70℃2％20mm磷酸鈉，ph7，80℃1％20mm磷酸鈉，ph7，90℃1％20mm磷酸鈉，ph9，環(huán)境99％20mm磷酸鈉，ph9，60℃27％20mm磷酸鈉，ph9，70℃2％20mm磷酸鈉，ph9，80℃1％20mm磷酸鈉，ph9，90℃1％20mm碳酸鈉，ph11，環(huán)境93％20mm碳酸鈉，ph11，60℃0％20mm碳酸鈉，ph11，70℃0％20mm碳酸鈉，ph11，80℃0％20mm碳酸鈉，ph11，90℃1％進行測定溫度和ph在不同暴露時間下對seqid-00363的酶活性的影響的另一多因素實驗。將seqid-00363配制成100g/l，并且在0小時至24小時的時間過程內(nèi)，相對于跨越25℃至70℃的溫度梯度來測試高ph外加或向高ph緩沖液中透濾的影響。在分析后，使用外加1m乙酸鈉緩沖液來使樣品中和至約ph7。seqid-00363實驗概述和設(shè)計如下。將seqid-00363再混懸成100g/l，并且外加以0.25m碳酸鈉(ph10)，透濾至50mm碳酸鈉(ph10)中，或透濾至10％磷酸鹽緩沖鹽水(ph9.0)中?？缭桨ㄔ趖＝0、1、2、4和24小時的取樣點的時間過程，在40、50、60或70℃下孵育樣品。如本文所述使用活性測定來測定seqid-00363的失活。通過比活性(u/mg)和目視可溶性來將樣品分析為凝膠、粘液或流體。這個研究發(fā)現(xiàn)溫度與ph兩者均使seqid-00363在酶性方面去活化。一些處理導(dǎo)致營養(yǎng)性多肽的不可逆聚集和凝膠形成；不分析這些樣品的酶活性。這個實驗的結(jié)果表明可在25℃下在ph10下使seqid-00363可溶性去活化。當反應(yīng)溫度增加時，蛋白質(zhì)保持去活化，但變得不可溶。因此，ph被確定為關(guān)于seqid-00363去活化的關(guān)鍵過程變量。進行隨后研究以探究在室溫下隨ph而變的seqid-00363去活化?？稍谑覝叵逻M行的過程比加熱過程花費更少以及更易于按比例擴大。將seqid-00363在ph3.6下配制成100g/l，并且使用超濾膜，使緩沖液交換成一系列碳酸鈉緩沖液。在緩沖液交換的過程期間，seqid-00363溶液ph從3.6增加至11.0。在緩沖液交換的過程期間，從超濾系統(tǒng)有序獲取蛋白質(zhì)的樣品，從而產(chǎn)生一組跨越所述ph范圍的樣品。將這些樣品保持在室溫下，并且將各樣品一分為二。在2-5小時之后，使各樣品的一半中和至乙酸鈉緩沖液中。接著如所述測定中和樣品的酶活性，并且結(jié)果在表e35c中。表e35c.在ph范圍內(nèi)的2-5小時孵育對活性的影響。ph相對活性(％)3.61004915836827898869569.754103710.913也通過葡糖淀粉酶活性測定來測試由水解seqid-00363達成的去活化。本文描述蛋白質(zhì)水解的程序。發(fā)現(xiàn)相對于對照，水解使活性降低至7％。也測試其它淀粉酶營養(yǎng)性多肽去活化。如本文所述通過葡糖淀粉酶活性測定，但代之以利用ph5.0乙酸鹽緩沖液(推薦用于米曲霉源性酶)來測試seqid-00424的去活化。如本文所述通過水解或通過煮沸來使樣品去活化。相對于對照，煮沸使活性降低至0％，而水解使活性降低至51％。實施例36：破壞營養(yǎng)性多肽酶活性。構(gòu)建突變蛋白質(zhì)。測試多種突變以確定可對已知具有酶活性的模型蛋白質(zhì)(seqid-00338，uniprotid：p07170)實現(xiàn)的酶失活程度。在這個蛋白質(zhì)中，底物結(jié)合位點包括位置42、134、167和178。此外，在位置91處存在鎂離子結(jié)合位點。在若干底物結(jié)合位置處進行單一氨基酸突變。表達突變體并測試酶活性。通過pcr擴增兩段來構(gòu)建單一氨基酸突變蛋白質(zhì)。使用具有可與his標簽相容的突出部分的結(jié)合基因的5’末端的正向引物(atcaccaccatcaccatcatagcagcagcgaaagcattcgtatg)和含有大腸桿菌中用于靶標氨基酸的最常見密碼子和在突變的上游和下游的20bp側(cè)接區(qū)的反向引物(表e36a)來擴增第一段。第二段在使用對突變位置具有特異性的正向引物(表e36a)和結(jié)合基因的3’末端的反向引物(tgttagcagccggatccttaatctttgcccagtttattcagaatatc)下緊接在突變位點之后擴增蛋白質(zhì)的3’末端。標準pcr反應(yīng)條件用于所有段，所述反應(yīng)條件含有0.5um正向引物、0.5um反向引物、1xphusion聚合酶主混合物(newenglandbiolabs)和1-100ng模板dna，于50ul最終體積中。熱循環(huán)條件是在98℃下初始變性30秒，以在98℃下的變性溫度持續(xù)10秒、在55-60℃下的退火溫度持續(xù)15秒、在72℃下的延伸溫度每kb產(chǎn)物持續(xù)15秒來循環(huán)30次。通過添加1uldpni(newenglandbiolabs)和5ul10xcutsmart緩沖液，以及在37℃下孵育1小時來從最終產(chǎn)物移除模板dna。遵循凝膠回收試劑盒(zymoresearch)來使各pcr產(chǎn)物清潔和濃縮，并且洗脫于20ul無菌水中，隨后繼續(xù)前進至下一組裝步驟。表e36a.用于擴增突變體的pcr段1的反向引物的清單。突變通過呈它的單字母縮寫形式的原始氨基酸繼之以位置和呈它的單字母縮寫形式的最終氨基酸來指定。通過gibson組裝將各pcr擴增段插入表達質(zhì)粒中，并且轉(zhuǎn)化至t7express(newenglandbiolabs)細胞中以用于表達。使用引物ggatccggctgctaacaaagcc和atgatggtgatggtggtgatgatgac，通過pcr來擴增含有t7啟動子、8xhis標簽和終止密碼子的表達質(zhì)粒pet15b，以使在各pcr段之間將存在20bp重疊，以便它們將通過gibson組裝來被適當組裝。在gibson組裝中，使1ul各pcr段與1xgibson組裝主混合物(newenglandbiolabs)一起組合成10ul最終體積，并且在50℃下孵育1小時。通過添加20ul水來將組裝反應(yīng)混合物稀釋3倍。將3ul稀釋混合物轉(zhuǎn)化至30ult7express(newenglandbiolabs)細胞中。挑選單一菌落，并且提取質(zhì)粒并確認序列，隨后繼續(xù)移動至表達研究。表達和純化突變蛋白質(zhì)。單一菌落用于接種于各孔中具有1ml含100mg/l羧芐青霉素的lb培養(yǎng)基的2ml深孔塊。將培養(yǎng)物在深孔塊振蕩器中在37℃和900rpm下振蕩過夜。深孔塊用于接種具有1ml含600mu/l葡糖淀粉酶的biosiltaenbase培養(yǎng)基的另一深孔塊以獲得od6000.1。在37℃和900rpm下振蕩培養(yǎng)物16小時，此時添加1mmiptg以誘導(dǎo)培養(yǎng)物，并且添加額外enbase補充培養(yǎng)基和另外600mu/l葡糖淀粉酶以對培養(yǎng)物進行補充。在37℃和900rpm下再進行表達6小時。通過在室溫下在3,000xg下旋轉(zhuǎn)深孔塊10分鐘來收集培養(yǎng)物。在離心之后，小心移除上清液，將細胞集結(jié)塊冷凍在-20℃下。使冷凍細胞集結(jié)塊解凍，并且添加0.3g0.1mm鋯珠粒至各樣品中，隨后添加0.5mlpbs。通過在配備有96孔板適配器的qiagentissuelyserii(qiagen,hilden,germany)中進行珠粒敲打5分鐘來在冷室(4℃)中使細胞溶解。在3000rpm下離心細胞溶解產(chǎn)物10分鐘，并且移除上清液，取樣并通過芯片電泳來分析蛋白質(zhì)濃度。通過添加2μl樣品至7μl樣品緩沖液中，在95c下加熱5分鐘，接著添加35μl水來制備樣品。使用ht低分子量蛋白質(zhì)表達試劑盒或ht蛋白質(zhì)表達試劑盒(遵循制造商方案)來完成分析。對于分子量測定(kda)和定量(ng/μl)，每12個樣品操作1個蛋白質(zhì)階梯。根據(jù)制造商方案，使用hismultitraphp(gehealthcare)系統(tǒng)來純化突變蛋白質(zhì)。通過用coomasie藍染色的sds-page和在280nm下的吸光度來測量蛋白質(zhì)的濃度。將蛋白質(zhì)于40mmtris緩沖液中稀釋以進行激酶活性測定。測定seqid-00338的激酶活性。adp-glotmmax測定從promega(目錄號v7001，madison,wi)獲得。單磷酸腺苷從sigma-aldrich(目錄號a1752，st.louis,mo)獲得。用1.211gtris堿(目錄號bp152-2，fisherbioreagents,pittsburgh,pa)、692μl12％鹽酸溶液(目錄號bdh3026-500mlp，vwr,radnor,pa)、10.0ml500mm氯化鎂(目錄號bp214-500，fisherbioreagents,pittsburgh,pa)制備5x激酶緩沖液，并且用milliq水使體積達到50ml并經(jīng)0.22μmpes過濾器(目錄號scgp00525，millipore,billerica,ma)過濾至無菌50ml管中。將于tris緩沖液中在35μg/ml下的12種his標簽純化突變蛋白質(zhì)和野生型蛋白質(zhì)連續(xù)稀釋至7.0和1.4μg/ml。通過用適當體積的含10mmamp和10mmatp的milliq水稀釋5x激酶緩沖液來在0.5mmamp/0.5mmatp下制備激酶反應(yīng)混合物以測試活性，以及在0mmamp/0mmatp下制備激酶反應(yīng)混合物以測定背景活性。通過混合9μl反應(yīng)混合物與6μl稀釋seqid-00338，通過上下吸移進行混合，以及將5μl分配至384孔白色optiplate(perkinelmer,waltham,ma)中來制備一式兩份反應(yīng)物。通過于milliq水中連續(xù)稀釋4mmadp，以及添加激酶緩沖液直至1x來制取關(guān)于在0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3和4mmadp下的標準物的adp標準曲線。將板用箔板密封物覆蓋，并且在30℃下孵育30分鐘。在激酶反應(yīng)之后，添加5μladp-glotm試劑至各孔中。將板用箔板密封物密封，并且在室溫下在450rpm下于水平板振蕩器上放置2分鐘。從板振蕩器移除板，并且在室溫下孵育40分鐘。接著在1109xrcf下將板離心15秒，并且添加10μladp-glotmmax檢測試劑。將板用箔板密封物密封，并且在室溫下在450rpm下在水平板振蕩器上振蕩2分鐘。接著從板振蕩器移除板，并且在室溫下孵育60分鐘。在1109xrcf下將板離心15秒，并且在enspirealpha板讀取器(perkinelmer,waltham,ma)上讀取發(fā)光。adp標準曲線用于確定在存在或不存在底物下，樣品孔中的adp濃度。通過對x＝log(x)變換的adp標準物發(fā)光值進行非線性4參數(shù)邏輯回歸來確定濃度。發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)樣品中，背景adp低于檢測限。當在不存在底物下的adp背景濃度可計算時，從底物孵育孔中的計算adp濃度中減去那些值的平均值。通過在相同濃度下相對于純化野生型蛋白質(zhì)的活性百分比來計算活性剔除。表e36b列出變體相對于純化野生型蛋白質(zhì)的平均活性百分比。所有變體相較于野生型蛋白質(zhì)都具有降低的活性。在7μg/ml下，激酶變體展現(xiàn)活性差異。表e36b.活性比例計算為在30℃下在30分鐘反應(yīng)期間由seqid-00338在7μg/ml下轉(zhuǎn)化的amp+atp→2adp百分比。激酶avgsdn野生型100.0％11.2％2d91f0.9％0.60％2d91i0.4％0.20％2r134m0.3％0.09％2r134y0.2％0.08％2r42a0.9％0.08％2r42c1.8％0.14％2r42g1.2％0.06％2r42i1.5％0.07％2r42k2.2％0.14％2r42l1.7％0.08％2r42q1.2％0.05％2r42t1.9％0.06％2實施例37.工程改造分泌多肽以達成酶活性降低構(gòu)建突變蛋白質(zhì)以降低營養(yǎng)性多肽的酶活性。預(yù)測seqid-00407的活性位點是殘基d217和e249，其是處于催化結(jié)構(gòu)域的中心的酸性殘基。為產(chǎn)生不含酶活性，以及富含對營養(yǎng)和健康重要的氨基酸的多肽，我們使那兩個位點突變以破壞seqid-00407的催化活性。seqid-00407中的d217和e249可充當親核試劑和質(zhì)子供體或接受體以與它們的配體形成氫鍵。為從seqid-00407移除酶活性，我們以在e249處的使它從谷氨酸變?yōu)楸奖彼岬膯我话被嵬蛔儊砉こ谈脑斓鞍踪|(zhì)。通過組裝兩個pcr片段來構(gòu)建突變體。第一片段含有酶的在突變位點的下游多達20bp的5’末端。第二片段含有酶的緊接在突變位點之后起始的3’末端。在第一pcr片段中，特定pcr引物被設(shè)計以結(jié)合靶向突變位點，并且并入所需突變氨基酸密碼子。選擇ttt密碼子，因為它是枯草芽孢桿菌中最常用于苯丙氨酸的密碼子。使用gibson組裝方法(nebgibson組裝主混合物)在50℃下持續(xù)1小時將兩個pcr片段組裝并插入質(zhì)粒載體中。在大腸桿菌中構(gòu)筑構(gòu)建體，并且通過dna測序來確認，隨后轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌中以用于分泌和酶活性測定。營養(yǎng)性多肽從枯草芽孢桿菌分泌?？莶菅挎邨U菌表達菌株的三個單獨菌落用于接種于深孔塊(96方孔)中的1ml具有cm5的2xl-mal培養(yǎng)基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨和10g/l酵母提取物、75g/l麥芽糖)。培養(yǎng)塊用多孔粘附性板密封物覆蓋，并且在微型表達室(glas-col,terrehaute,in)中在37℃和880rpm下孵育過夜。過夜培養(yǎng)物用于接種于深孔塊中的新鮮2xl-malcm5培養(yǎng)物以獲得起始od600＝0.1。在37℃、880rpm下孵育這些表達培養(yǎng)物直至od600＝1.0(約4小時)，此時通過在最終濃度0.1m下添加異丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)以及繼續(xù)孵育4小時來誘導(dǎo)它們。在4小時之后，測量各培養(yǎng)物的細胞密度(od600)，并且通過離心(3000rpm，10分鐘，室溫)來收集細胞。在離心之后，小心移除培養(yǎng)上清液，并且轉(zhuǎn)移至新塊中，并將細胞集結(jié)塊冷凍在-80℃下。為測定分泌蛋白質(zhì)的水平，通過芯片電泳來測定上清液以測定分泌目標蛋白質(zhì)(poi)的水平。簡要來說，通過添加2μl樣品至7μl樣品緩沖液中，在95c下加熱5分鐘，接著添加35μl水來制備樣品。使用ht低分子量蛋白質(zhì)表達試劑盒或ht蛋白質(zhì)表達試劑盒(遵循制造商方案)來完成分析。對于分子量測定(kda)和定量(ng/μl)，每12個樣品操作1個蛋白質(zhì)階梯。淀粉酶活性測定。seqid-00407是枯草芽孢桿菌中具有將多糖(諸如淀粉)分解成單糖或二糖的活性的α-淀粉酶。為證明特定突變體已移除酶活性，將分泌酶的枯草芽孢桿菌涂鋪于含有淀粉的瓊脂板上。如果存在酶活性，那么分泌的酶將分解淀粉，并且在用碘染色后，將存在圍繞枯草芽孢桿菌菌落的暈圈。通過組合25gluria肉湯-miller、10g淀粉、15g細菌瓊脂和1l水來制備1％淀粉板。在瓊脂已固化之后，添加10mmiptg至淀粉板中。將表達突變多肽的枯草芽孢桿菌菌株的單一菌落接種在5mllb中，在37℃下持續(xù)4小時，并且將50μl液體培養(yǎng)物點樣在淀粉板的中心處。在20小時的生長和誘導(dǎo)分泌之后，添加10％碘至淀粉板中以染色淀粉。當分泌野生型酶時，它在細胞周圍產(chǎn)生大暈圈。然而，當分泌工程改造的酶時，暈圈的面積降低，這類似于表達無酶空載體的陰性對照菌株。表e37a相對于細胞面積定量暈圈面積。顯示的是對于野生型來說，暈圈與細胞之間的面積差異大于工程改造的突變體。根據(jù)顯示的數(shù)據(jù)，我們說明了酶活性降低的分泌營養(yǎng)性多肽的工程改造。表e37a.以in2計量的定量細胞、暈圈面積和它們的差異。蛋白質(zhì)細胞面積(in2)暈圈面積(in2)暈圈/細胞無蛋白質(zhì)對照0.4130.61.45野生型1.272.2461.77e249f樣品10.3310.4961.50e249f樣品21.3351.9361.45實施例38：工程改造營養(yǎng)性多肽氨基酸含量以調(diào)節(jié)多肽活性以及增濃必需氨基酸含量。為說明氨基酸含量增濃的分泌多肽的工程改造，我們選擇已知在高水平下分泌蛋白質(zhì)的微生物枯草芽孢桿菌。seqid-00407被鑒定為枯草芽孢桿菌中的主要分泌蛋白質(zhì)。使用seqid-00407的序列保守性和晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，我們鑒定各蛋白質(zhì)內(nèi)被預(yù)測會耐受突變，而不負面影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和/或宿主生物體分泌蛋白質(zhì)的能力的連續(xù)區(qū)域。我們分析以結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫條目1ua7報道的seqid-00407的二級結(jié)構(gòu)。我們鑒定蛋白質(zhì)序列內(nèi)不為α螺旋或β折疊的一部分的19個環(huán)區(qū)域。這些環(huán)區(qū)域由以下氨基酸殘基界定：73-76、130-133、147-152、157-161、189-192、222-227、239-244、283-286、291-298、305-308、318-323、336-340、356-360、365-368、387-392、417-421、428-432、437-442和464-466。長度小于4個氨基酸的環(huán)區(qū)域不考慮用于突變。歷經(jīng)進化空間的序列保守性也被考慮用于鑒定可經(jīng)受工程改造，同時維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和分泌勝任性的位置。在同源性序列的家族內(nèi)保守性較小的位置是固有可變的，并且可能更可經(jīng)受突變而不影響固有地與結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)的活性。為發(fā)現(xiàn)保守性較小的位置，我們從ncbi保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫下載pfam00128的比對結(jié)果，所述數(shù)據(jù)庫含有31種包括seqid-00407催化結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列(marchler-bauera.,zhengc.,chitsazf.,derbyshirem.k.,geerl.y.,geerr.c.,gonzalesn.r.,gwadzm.,hurwitzd.i.,lanczyckic.j.,luf.,lus.,marchlerg.h.,songj.s.,thankin.,yamashitar.a.,zhangd.和s.h.bryant.nucleicacidsres.(2013)41:d348-52)。我們也使用seqid-00407進行ncbi蛋白質(zhì)參照序列數(shù)據(jù)庫的psi-blast搜索(pruittk.d.,tatusovat.和d.r.maglott.nucleicacidsres.(2005)33:d501-504)，并且獲得500種與seqid-00407同源的序列。在兩種情況下，使用blosum62位置特異性評分矩陣、空位罰分-11、空位延伸罰分-1和比對納入e值截斷值0.005進行單次迭代(altschuls.f.,nucleicacidsres.(1997)25:3389-3402)。所有蛋白質(zhì)序列比對都用于產(chǎn)生對各查詢序列具有特異性的位置特異性評分矩陣(pssm)作為psi-blast搜索的一部分。根據(jù)pssm，我們通過計數(shù)在各環(huán)內(nèi)的各位置處與正性pssm評分相關(guān)的不同氨基酸的數(shù)目以及對在各位置處進行必需氨基酸取代的pssm評分的總和和平均值來鑒定被預(yù)測會耐受突變的區(qū)域。此外，根據(jù)從各psi-blast搜索獲得的多重序列比對結(jié)果，我們計算在各位置處的氨基酸熵，如由sj＝-∑i∈aapilnpi所確定，其中sj是在位置j處的熵，并且pi是在位置j處觀察到氨基酸i的概率。使用突變耐受性的這些量度，我們鑒定四個被預(yù)期會耐受突變成必需氨基酸的環(huán)區(qū)域。為在必需氨基酸方面增濃鑒定的區(qū)域，我們使用組合密碼子文庫，其中任何所選位置可為f、i、l、v或m(表示為z)或r、k、t、i或m(表示為x)。在選擇用于突變成必需氨基酸的各環(huán)區(qū)域中，各可變位置視它的相對疏水性殘基耐受性(基于它們的相應(yīng)pssm值)而定被指定為z或x。耐受疏水性殘基的位置被指定為z，并且使用密碼子ntn進行遺傳編碼。更耐受親水性殘基的位置被指定為x，并且使用密碼子anr進行遺傳編碼。我們指示在seqid-00407的一個鑒定的可變區(qū)(147-153)中，甘氨酸殘基被插入環(huán)的中心中以試圖增強這個區(qū)域的構(gòu)象可撓性。對于seqid-00407，鑒定的區(qū)域的序列概述于表e38a中。表e38a.起始殘基編號原始簡并148yaaixxgxx240ntsazxxz291shyasdxzyxxz389qpeexpzzx＝ntn，編碼f、l、i、m、vz＝anr，編碼i、m、t、k、r文庫設(shè)計和構(gòu)建?；趯勺儏^(qū)的鑒定，我們設(shè)計可擴增如本文說明的各可變區(qū)的引物。舉例來說，如果存在四個可變區(qū)，那么我們需要四對引物來產(chǎn)生四個可變片段。在步驟1中，我們使用pes1205作為模板，其含有與n末端amyq信號肽和pgrac啟動子的下游融合的seqid-00407。pes1205是載體pht43(mobitec)的衍生物，含有編碼來自枯草芽孢桿菌的amye基因(減去編碼amye信號肽的初始93bp)加c末端1xflag標簽的1905bpdna片段。與pht43上編碼的samyq序列同框克隆amye::1xfl:ag序列。對于片段1、2、3、4，正向引物id-45053、引物id-45054、引物id-45055和引物id-45056含有在可變區(qū)之前的恒定序列繼之以用以代表可變區(qū)的簡并序列的25個堿基和在可變區(qū)的下游的恒定序列的25個堿基。對于片段1、2、3，反向引物：引物id-45061、引物id-45062和引物id-45063分別含有在下一可變區(qū)的上游的反向互補序列的25個堿基。對于片段4，反向引物：引物id-45064含有離可變區(qū)4任意距離的反向互補序列的25個堿基。使用phusiondna聚合酶(newenglandbiolabs,beverly,ma)和由制造商推薦的反應(yīng)參數(shù)來操作四個單獨pcr擴增。關(guān)于單獨反應(yīng)，分別使用作為模板的pes1205以及引物對引物id-45057和引物id-45061、引物id-45058和引物id45062、引物id-45059和引物id-45063、以及引物id-45060和引物id-45064來產(chǎn)生四個野生型片段wt-frag-1、wt-frag-2、wt-frag-3和wt-frag-4。凝膠純化所有pcr片段。在步驟2中，設(shè)置兩個單獨pcr反應(yīng)。第一pcr反應(yīng)含有等摩爾比率的片段1和2作為模板，以及引物id-45057和引物id-45062作為引物。第二pcr反應(yīng)含有等摩爾比率的片段3和4，以及引物id-45059和引物id-45064作為引物。在兩個反應(yīng)中，以存在于各可變片段中的文庫成員的摩爾比添加相應(yīng)野生型片段。凝膠純化片段5和6，并且以等摩爾比率用作步驟3中的模板。用于pcr反應(yīng)中的引物包括引物id-45057和引物id-45064。使用pes1205和引物對引物id-45065和引物id-45066產(chǎn)生載體pcr產(chǎn)物。凝膠純化片段7與載體pcr產(chǎn)物兩者，并且使用gibson組裝主混合物(newenglandbiolabs,beverly,ma)一起克隆并根據(jù)制造商說明書轉(zhuǎn)化至克隆宿主大腸桿菌turbo(newenglandbiolabs)中。對50個菌落測序以確定文庫的多樣性。接著將瓊脂板上的菌落混懸于lb培養(yǎng)基中，并且收集以進行質(zhì)粒純化。以類似方式，我們產(chǎn)生seqid-00407的9種特定變體，其在突變體設(shè)計中鑒定的每個可變位置處以9種特定氨基酸f、l、i、m、v、t、k、r、w加以改變。特定變異引物在列舉時通過單字母氨基酸縮寫來表示。所有引物都列于表e38b中。表e38b.枯草芽孢桿菌菌株構(gòu)建?？莶菅挎邨U菌菌株wb800n(mobitec,germany)用作表達宿主。wb800n是充分研究的菌株(枯草芽孢桿菌168)的衍生物，并且它已通過缺失編碼8種細胞外蛋白酶的基因(npre、apre、epr、bpr、mpr、nprb、vpr和wpra)來工程改造以降低分泌蛋白質(zhì)的蛋白酶降解。根據(jù)制造商說明書進行枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化。將約5μgseqid-00407變異構(gòu)建體的文庫轉(zhuǎn)化至wb800n中，并且通過涂鋪在含有5.0μg/ml氯霉素(cm5)的lb瓊脂上來在37℃下選擇單一菌落。對于9種特定變體，將約1μg特定seqid-00407變體轉(zhuǎn)化至wb800n中，并且通過涂鋪在含有5.0μg/ml氯霉素(cm5)的lb瓊脂上來在37℃下選擇單一菌落。枯草芽孢桿菌文庫篩選?？莶菅挎邨U菌seqid-00407文庫的約800個個別轉(zhuǎn)化體用于接種于深孔塊(96方孔)中的具有cm5的2x-mal培養(yǎng)基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨和10g/l酵母提取物、75g/l麥芽糖)的個別1ml培養(yǎng)物。除文庫菌株之外，接種含有具有amye和samyq前導(dǎo)肽的質(zhì)粒的菌株作為陽性對照，并且接種含有不具有目標基因的質(zhì)粒的菌株作為陰性對照。培養(yǎng)塊用多孔粘附性板密封物覆蓋，并且在微型表達室(glas-col,terrehaute,in)中在37℃和880rpm下孵育過夜。過夜培養(yǎng)物用于接種于深孔塊中的新鮮2x-malcm5培養(yǎng)物以獲得起始od600＝0.1。在37℃、880rpm下孵育表達培養(yǎng)物直至od600＝1.0(約4小時)，此時通過在最終濃度1mm下添加異丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)以及繼續(xù)孵育4小時來誘導(dǎo)它們。在4小時之后，測量各培養(yǎng)物的細胞密度(od600)，并且通過離心(3000rpm，10分鐘，室溫)來收集細胞。在離心之后，小心移除培養(yǎng)上清液，并且轉(zhuǎn)移至新塊中，并將細胞集結(jié)塊冷凍在-80℃下。為測定分泌蛋白質(zhì)的水平，首先通過0.45μm過濾器，隨后通過0.22μm過濾器來過濾0.5ml培養(yǎng)上清液等分試樣。接著通過芯片電泳系統(tǒng)來測定濾液以測定分泌目標蛋白質(zhì)(poi)的水平，并且與基礎(chǔ)構(gòu)建體的分泌水平進行比較。簡要來說，通過添加2μl樣品至7μl樣品緩沖液中，在95c下加熱5分鐘，接著添加35μl水來制備樣品。使用ht低分子量蛋白質(zhì)表達試劑盒或ht蛋白質(zhì)表達試劑盒(遵循制造商方案)來完成分析。對于分子量測定(kda)和定量(ng/μl)，每12個樣品操作1個蛋白質(zhì)階梯。通過對目標凝膠條帶的lc/ms/ms來確認seqid-00690和seqid-00702。使所選命中物與含有5％β-巰基乙醇的invitrogenlds樣品緩沖液混合，煮沸，并且裝載于10％bis-tris凝膠(lifetechnologies)上。在操作之后，使用simplybluetmsafestain(lifetechnologies)來染色凝膠，并且切除所需條帶并提交以進行分析。洗滌凝膠條帶，還原并烷基化，接著用胰蛋白酶消化4小時，隨后用甲酸淬滅。消化物接著用聯(lián)接于thermofisherqexactive的watersnanoacquityhplc系統(tǒng)，通過納米lc/ms/ms來分析。將肽裝載于捕集柱上，并且歷經(jīng)75μm分析柱在350nl/min下洗脫；兩個柱均填充有jupiterproteo樹脂(phenomenex)。以數(shù)據(jù)依賴性模式操作質(zhì)譜儀，其中ms和ms/ms分別在70,000fwhm分辨率和17,500fwhm分辨率下在orbitrap中進行。15種最豐富的離子被選擇用于ms/ms。使用mascot相對于附有相關(guān)變異蛋白質(zhì)序列的相關(guān)宿主數(shù)據(jù)庫搜索所得肽數(shù)據(jù)。稀釋的過夜培養(yǎng)物用作含有cm5的lb肉湯培養(yǎng)物的接種物。使這些培養(yǎng)物在37c下生長直至它們達到對數(shù)期。使這些培養(yǎng)物的等分試樣與甘油(20％最終濃度)混合，并且冷凍在-80℃下。接著使用instagene基質(zhì)(biorad,usa)純化前30名命中物，并且使用cttgaaattggaagggagattc和gtataaacttttcagttgcagac進行擴增，并使用相同引物進行測序以鑒定seqid-00407變異序列?？莶菅挎邨U菌分泌文庫分析。分析seqid-00407的所有分泌變體(seqid45002-45028)以確定相對于存在于初始遺傳文庫中的預(yù)期位置特異性偏倚，是否有任何位置特異性氨基酸偏倚存在于分泌變體中。為此，對各氨基酸在各位置處進行精確二項檢驗以確定各氨基酸的觀察數(shù)目顯著(p<0.05)大于或小于機會預(yù)期的可能性。表e38c顯示這個單尾檢驗的p值，其中那些突顯組成部分具有p值<0.05。應(yīng)注意除全都顯著高于預(yù)期的野生型值之外，所有其它顯著不同氨基酸頻率都小于預(yù)期。預(yù)期位置特異性氨基酸偏倚顯示于表e38d中，并且通過在文庫已被構(gòu)建并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中之后對47種隨機選擇的變體測序來發(fā)現(xiàn)。假定被設(shè)計為x的所有位置都從l、i、v、f和m密碼子的相同分布(即對于所有x位置，不存在位置特異性氨基酸偏倚)有效取樣。因此，跨越各位置聚集各氨基酸的觀察計數(shù)以確定所有x位置的預(yù)期氨基酸可能性。對被設(shè)計為z的所有位置都進行類似假定。如可在表e38c中所見，除在各位置處朝向野生型序列的強烈偏倚之外，存在許多不同氨基酸被觀察到顯著小于預(yù)期，從而指示在分泌文庫中在那個位置處存在與那些氨基酸的偏離。這個數(shù)據(jù)提供用于設(shè)計在各位置處具有特定突變的特定合理設(shè)計變體的其它信息。舉例來說，為在亮氨酸方面增濃分泌變體，位置241和291可為合乎需要性較小的選擇?；蛘?，為在纈氨酸方面增濃分泌變體，位置149、241、242、291、294、295和389可為合乎需要性較小的選擇。表e38c：評估seqid-450001的分泌變體中的位置特異性氨基酸偏倚的單尾二項檢驗p值表e38d：構(gòu)建的seqid-450001文庫中的位置特異性預(yù)期氨基酸可能性變體的枯草芽孢桿菌表達測試?？莶菅挎邨U菌表達菌株的三個單獨菌落用于接種于深孔塊(96方孔)中的1ml具有cm5的2x-mal培養(yǎng)基(20g/lnacl、20g/l胰蛋白胨和10g/l酵母提取物、75g/l麥芽糖)。培養(yǎng)塊用多孔粘附性板密封物覆蓋，并且在微型表達室(glas-col,terrehaute,in)中在37℃和880rpm下孵育過夜。過夜培養(yǎng)物用于接種于深孔塊中的新鮮2x-malcm5培養(yǎng)物以獲得起始od600＝0.1。在37℃、880rpm下孵育這些表達培養(yǎng)物直至od600＝1.0(約4小時)，此時通過在最終濃度0.1m下添加異丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)以及繼續(xù)孵育4小時來誘導(dǎo)它們。在4小時之后，測量各培養(yǎng)物的細胞密度(od600)，并且通過離心(3000rpm，10分鐘，室溫)來收集細胞。在離心之后，小心移除培養(yǎng)上清液，并且轉(zhuǎn)移至新塊中，并將細胞集結(jié)塊冷凍在-80℃下。為測定分泌蛋白質(zhì)的水平，首先通過0.45μm過濾器，隨后通過0.22μm過濾器來過濾0.5ml培養(yǎng)上清液等分試樣。接著通過芯片電泳來測定濾液以測定分泌目標蛋白質(zhì)(poi)的水平。簡要來說，通過添加2μl樣品至7μl樣品緩沖液中，在95c下加熱5分鐘，接著添加35μl水來制備樣品。使用ht低分子量蛋白質(zhì)表達試劑盒或ht蛋白質(zhì)表達試劑盒(遵循制造商方案)來完成分析。對于分子量測定(kda)和定量(ng/μl)，每12個樣品操作1個蛋白質(zhì)階梯。通過對目標凝膠條帶的lc/ms/ms來確認seqid-45025、seqid-45026、seqid-45027和seqid-45028。使所選命中物與含有5％β-巰基乙醇的invitrogenlds樣品緩沖液混合，煮沸，并且裝載于10％bis-tris凝膠(lifetechnologies)上。在操作之后，使用simplybluetmsafestain(lifetechnologies)來染色凝膠，并且切除所需條帶并提交以進行分析。洗滌凝膠條帶，還原并烷基化，接著用胰蛋白酶消化4小時，隨后用甲酸淬滅。消化物接著用聯(lián)接于thermofisherqexactive的watersnanoacquityhplc系統(tǒng)，通過納米lc/ms/ms來分析。將肽裝載于捕集柱上，并且歷經(jīng)75μm分析柱在350nl/min下洗脫；兩個柱均填充有jupiterproteo樹脂(phenomenex)。以數(shù)據(jù)依賴性模式操作質(zhì)譜儀，其中ms和ms/ms分別在70,000fwhm分辨率和17,500fwhm分辨率下在orbitrap中進行。15種最豐富的離子被選擇用于ms/ms。使用mascot相對于附有相關(guān)變異蛋白質(zhì)序列的相關(guān)宿主數(shù)據(jù)庫搜索所得肽數(shù)據(jù)。工程改造的多肽的淀粉酶活性測定。測試一種工程改造的多肽以證明酶活性。seqid-00407是枯草芽孢桿菌中具有將多糖(諸如淀粉)分解成單糖或二糖的活性的α-淀粉酶。為證明seqid-00690已保留酶活性，將分泌酶的枯草芽孢桿菌涂鋪于含有淀粉的瓊脂板上。如果存在酶活性，那么分泌的酶將分解淀粉，并且在用碘染色后，將存在圍繞枯草芽孢桿菌菌落的暈圈。通過組合25gluria肉湯-miller、10g淀粉、15g細菌瓊脂和1l水來制備1％淀粉板。在瓊脂已固化之后，添加10mmiptg至淀粉板中。將表達突變多肽的枯草芽孢桿菌菌株的單一菌落接種在5mllb中，在37℃下持續(xù)4小時，并且將50μl液體培養(yǎng)物點樣在淀粉板的中心處。在20小時的生長和誘導(dǎo)分泌之后，添加10％碘至淀粉板中以染色淀粉。當seqid-00690被涂鋪在淀粉板上時，酶被分泌，并且在細胞周圍產(chǎn)生大暈圈，其類似于野生型菌株，并且比表達無酶空載體的陰性對照菌株大得多。表e38e相對于細胞面積定量暈圈面積。根據(jù)顯示的數(shù)據(jù)，我們說明了保留酶活性的富含必需氨基酸的分泌營養(yǎng)性多肽的工程改造。表e38e.以in2計量的定量細胞、暈圈面積和它們的差異。蛋白質(zhì)細胞面積(in2)暈圈面積(in2)暈圈/細胞無蛋白質(zhì)對照0.4130.6001.45野生型1.2702.2461.77seqid-006900.4691.2342.63實施例39：測定在口服消耗富含亮氨酸的營養(yǎng)性多肽之后人受試者的肌肉蛋白質(zhì)分數(shù)合成速率?？诜z取亮氨酸或含有亮氨酸的蛋白質(zhì)會刺激肌肉蛋白質(zhì)合成(layman和walker,2006,thejournalofnutrition:136:319–323)。許多本文所述的富含亮氨酸的營養(yǎng)性多肽是高度水溶性的，并且在人受試者中易于消化和吸收。此處描述如通過營養(yǎng)性多肽遞送的氨基酸的藥物動力學(xué)以及它們對肌肉蛋白質(zhì)合成的影響。在表觀健康的受試者中測量富含亮氨酸的營養(yǎng)性多肽對肌肉蛋白質(zhì)合成的影響。以單盲方式將十二(12)名年齡在50歲與70歲之間的表觀健康的受試者(平均高度：1.7m，重量：78.5kg，年齡：56.2以及bmi：26.8)隨機指定于一連串處理劑。一組6名受試者接受seqid-105的制劑和90％乳清蛋白質(zhì)分離物(wpi)對照，而另一組接受seqid-363和90％乳清蛋白質(zhì)分離物對照。交錯進行處理以使各個體在單獨日子(相隔2-3天)接受35克各營養(yǎng)性多肽制劑以允許洗脫初始制劑。在受試者內(nèi)交叉比較中，各受試者充當他們自身的對照。如果受試者滿足任何以下排除準則，那么將他們從研究排除：糖尿病史。在先前6個月中惡性腫瘤史。先前胃腸旁路手術(shù)(束帶等)。慢性炎癥性病狀或疾病(狼瘡、hiv/aids等)。已知對乳清蛋白質(zhì)、霉菌孢子或真菌敏感或過敏。在他們參與這個研究期間未節(jié)制進食動物性蛋白質(zhì)。在他們參與這個研究期間不能節(jié)制消耗蛋白質(zhì)或氨基酸補充劑。在研究時期期間不能節(jié)制抗阻訓(xùn)練。當前參與用探究性產(chǎn)品進行的另一研究調(diào)查。在篩選就診時血紅蛋白小于9.5mg/dl。相伴使用皮質(zhì)類固醇或睪固酮補充療法(攝取、注射或經(jīng)皮)。根據(jù)醫(yī)務(wù)人員的判斷，如果他們參與，那么將會將受試者置于增加的損害風(fēng)險下的任何其它疾病或病狀。所有受試者都被要求維持他們的當前膳食習(xí)慣，維持他們的每日生活活動，以及在研究期間不參與任何抗阻運動。使用肌肉蛋白質(zhì)合成的分數(shù)速率(fsr)來衡量各營養(yǎng)性制劑的合成代謝作用(smith,villareal和mittendorfer,2007,americanjournalofphysiology-endocrinologyandmetabolism:293:e666–e671)。研究程序包括在灌注恒定輸注l-[環(huán)-d5]-苯丙氨酸(cambridgeisotopelaboratories,tewksbury,ma)期間進行靜脈血液抽取和股外側(cè)肌活檢。通過在灌注恒定輸注l-[環(huán)-d5]-苯丙氨酸期間進行肌肉活檢來測量肌肉蛋白質(zhì)合成的分數(shù)速率(fsr)。具體來說，在過夜禁食(>8小時)之后，使用穩(wěn)定同位素示蹤劑并入技術(shù)，由在啟始穩(wěn)定同位素示蹤劑輸注之后2、4和7小時進行的股外側(cè)肌活檢來在禁食人受試者中測量肌肉蛋白質(zhì)合成的分數(shù)速率(fsr)。也在開始穩(wěn)定同位素示蹤劑輸注之后在指定時間點(即2、3、4、4+30、5、5+30、6、6+30和7小時)收集血液樣品以評估氨基酸濃度變化。對于各受試者，在研究的早晨以及在過夜禁食(8小時)之后，將18-22規(guī)格聚乙烯導(dǎo)管插入各臂中。將一個導(dǎo)管插入遠端靜脈中以進行加熱采血來獲得背景血液樣品(5ml)，并且另一導(dǎo)管插入前臂中以輸注穩(wěn)定同位素示蹤劑。在插入外周導(dǎo)管之后，開始灌注(5.04μmol/kg)恒定(0.084μmol/kg/min)輸注穩(wěn)定同位素(gras物質(zhì))環(huán)-d5-苯丙氨酸。穩(wěn)定同位素從cambridgeisotopelaboratories(tewksbury,ma)獲得，并且測試無菌性和致熱原性(通過cil和配制性藥房-pharmacare)。在輸注之前，用無菌鹽水復(fù)原示蹤劑。在輸注期間，穩(wěn)定同位素經(jīng)放置在輸注管線中的無菌0.22微米(millipore)過濾器過濾。在開始同位素輸注之后在指定時間點(2、3、4、4+30、5、5+30、6、6+30和7小時)將血液樣品(5ml)收集于血清分離管中。在整個研究期間抽取約60ml血液，并且這個體積用與穩(wěn)定同位素示蹤劑一起輸注的鹽水替換。在示蹤劑輸注的2、4和7小時進行股外側(cè)肌的肌肉活檢。在4小時時的活檢之后，口服施用營養(yǎng)性蛋白質(zhì)制劑。所有肌肉活檢都在局部麻醉(使用無菌1％利多卡因，無腎上腺素)下進行以達成正常疼痛管理和嚴格無菌程序。在各肌肉活檢之前，使用無菌皮膚制備試劑盒(必妥碘(betadine))清潔皮膚，并且皮膚和以下組織用局部麻醉劑(利多卡因)注射以使疼痛最小。通過小切口(約1cm)，將5mm針“o”推進至肌肉中，并且施加抽吸。接著用針移除一塊肌肉(約50–100mg)。接著洗凈皮膚，用1/4英寸x1.5英寸粘附性steri條帶使邊緣接近，并且將透明透氣薄膜敷料(tegaderm)施加于部位。維持穩(wěn)固壓力直至在部位處的流血停止。為使感染和瘀傷的風(fēng)險最小，在將受試者解脫之前由醫(yī)務(wù)人員分別施加抗生素軟膏劑和壓力敷料(具有自粘性彈性繃帶)。如下計算以(％/h)計量的fsr：其中增濃(ep1、ep2和em)表示為摩爾百分比過量(mpe)，并且計算為一旦示蹤劑濃度已平穩(wěn)，標記的苯丙氨酸示蹤劑與未標記的苯丙氨酸示蹤劑的比率(ttr)。ep1和ep2分別是在第一和第二活檢(或第二和第三)中結(jié)合的環(huán)-2h5-苯丙氨酸的增濃，并且em是細胞內(nèi)池中環(huán)-2h5-苯丙氨酸的增濃的平均值?！皌”是在以分鐘計的第1肌肉活檢與第2肌肉活檢之間(或在第二與第三之間)消逝的以分鐘計的時間。60min/h和100的恒定換算因數(shù)用于以每小時百分比表示fsr。通過配對t檢驗來分析結(jié)果變量(肌肉蛋白質(zhì)合成和血液氨基酸濃度)。將統(tǒng)計顯著性先驗確定在p<0.05下，并且趨勢被接受為0.051<p<0.10。表e39a-c顯示在急性口服劑量的各營養(yǎng)性蛋白質(zhì)制劑之前和之后對各受試者計算的fsr數(shù)據(jù)，并且圖56顯示平均fsr的變化。顯示的數(shù)據(jù)是平均值+/-平均值標準誤差。應(yīng)注意來自wpi組中的受試者3的禁食fsr值具有極其升高的fsr，這與正常禁食值不一致，其中z值是2.85。雙尾grubbs’異常值檢驗指示它是顯著(p<0.05)異常值，并且在計算如圖56中所示的平均值和標準誤差時將它移除。表e39a表e39b表e39c當移除受試者3時，配對t檢驗比較各組的禁食和供食應(yīng)答指示wpi處理的受試者的供食應(yīng)答顯著不同于禁食應(yīng)答。(p＝0.007)，與考查對wpi的fsr應(yīng)答的先前研究(paddon-jones,d.,sheffield-moore,m.,katsanosc.s.,xiao-junz.,wolfe,r.r.differentialstimulationofmuscleproteinsynthesisinelderlyhumansfollowingisocaloricingestioninaminoacidsorwheyprotein.exp.gerontol.(2006)41:215-219)一致。如果包括受試者3，那么差異喪失顯著性(p＝0.45)。seqid-105供食組中的禁食和供食fsr應(yīng)答顯著不同(p＝0.04)，但seqid-363供食組中的禁食和供食fsr應(yīng)答不顯著不同(p＝0.68)。實施例40：含有營養(yǎng)性多肽的制劑的口服藥物動力學(xué)對蛋白質(zhì)攝取的合成代謝應(yīng)答是以必需氨基酸的遞送為基礎(chǔ)。這個研究的目的在于在240分鐘的時期內(nèi)考查應(yīng)答于各種蛋白質(zhì)的血漿氨基酸濃度變化。以雙盲方式將4名年齡在18歲與50歲之間的表觀健康的受試者隨機指定于一連串處理劑，以170ml的體積口服接受20克乳清蛋白質(zhì)分離物或seqid-105。受試者在口服藥物動力學(xué)研究之前被禁食過夜(>8小時)。在口服攝取營養(yǎng)性多肽之后在指定時間點(即0、15、30、60、90、120、150、180、210和240分鐘)收集靜脈血液樣品以評估血漿氨基酸濃度變化。通過questdiagnostics或laboratorycorporationofamerica來定量血漿氨基酸濃度。圖57-60顯示關(guān)于wpi和seqid-105的各測量氨基酸以及各聚集組，即必需氨基酸(eaa)、支鏈氨基酸(bcaa)和總氨基酸(taa)的血漿時間過程。使用單因素anova檢驗以評估關(guān)于wpi的在測量時間點之間的血漿氨基酸水平的顯著差異，這些數(shù)據(jù)指示asn、ile、leu、lys、met、phe、pro、trp、tyr、eaa、bcaa和taa隨時間存在顯著差異(p<0.05)。使用單因素anova檢驗以評估關(guān)于seqid-105的營養(yǎng)性制劑的在測量時間點之間的血漿氨基酸水平的顯著差異，這些數(shù)據(jù)指示arg、asn、asp、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、ser、tyr、val、eaa、bcaa和taa隨時間存在顯著差異(p<0.05)。圖61-63顯示關(guān)于wpi和seqid-105的各測量氨基酸以及各聚集組，即必需氨基酸(eaa)、支鏈氨基酸(bcaa)和總氨基酸(taa)的積分曲線下面積(auc)。使用t檢驗以比較wpi與seqid-105之間各氨基酸或氨基酸組的auc，在asp(p＝0.01)、his(p＝0.04)、leu(0.023)、met(0.002)、phe(0.04)、pro(p<0.01)、ser(p＝0.03)和trp(p＝0.002)應(yīng)答方面存在顯著差異。在另一研究中，分別以100ml和1151ml向6名年齡在18歲與50歲之間的表觀健康的受試者口服給與35克劑量的seqid-105和wpi。圖64-67顯示關(guān)于wpi和seqid-105的各測量氨基酸以及各聚集組，即必需氨基酸(eaa)、支鏈氨基酸(bcaa)和總氨基酸(taa)的血漿時間過程。使用單因素anova檢驗以評估關(guān)于wpi的在測量時間點之間的血漿氨基酸水平的顯著差異，這些數(shù)據(jù)指示arg、asn、asp、gln、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr、val、eaa、bcaa和taa隨時間存在顯著差異(p<0.05)。使用單因素anova檢驗以評估關(guān)于seqid-105的營養(yǎng)性制劑的在測量時間點之間的血漿氨基酸水平的顯著差異，這些數(shù)據(jù)指示arg、asn、asp、glu、his、ile、ley、lys、met、phe、ser、thr、trp、val、eaa、bcaa和taa隨時間存在顯著差異(p<0.05)。圖68-70顯示關(guān)于在35g下給藥的wpi和seqid-105的各測量氨基酸以及各聚集組，即必需氨基酸(eaa)、支鏈氨基酸(bcaa)和總氨基酸(taa)的積分曲線下面積(auc)。使用雙尾不等方差t檢驗以比較wpi與seqid-105之間各氨基酸或氨基酸組的auc，在asn(p＝0.006)、his(p＝0.01)、ile(p＝0.03)、lys(p＝0.02)、met(p<0.001)、phe(p<0.001)、pro(p＝0.002)、ser(p＝0.005)、thr(p＝0.004)、trp(p<0.001)、tyr(p＝0.003)和val(p＝0.012)應(yīng)答方面存在顯著差異。在考查通過營養(yǎng)性多肽進行氨基酸遞送的藥物動力學(xué)的另一研究中，以雙盲方式將3名年齡在18歲與50歲之間的表觀健康的受試者隨機指定于一連串處理劑，口服接受20克乳清蛋白質(zhì)分離物或seqid-363。受試者在口服藥物動力學(xué)研究之前被禁食過夜(>8小時)。在口服攝取營養(yǎng)性多肽之后在指定時間點(即0、15、30、60、90、120、150、180、210和240分鐘)收集靜脈血液樣品以評估血漿氨基酸濃度變化。通過questdiagnostics或laboratorycorporationofamerica來定量血漿氨基酸濃度。圖71-74顯示關(guān)于wpi和seqid-363的各測量氨基酸以及各聚集組，即必需氨基酸(eaa)、支鏈氨基酸(bcaa)和總氨基酸(taa)的血漿時間過程。使用單因素anova檢驗以評估關(guān)于wpi的在測量時間點之間的血漿氨基酸水平的顯著差異，這些數(shù)據(jù)指示gln、ile、leu、lys、phe、ser、tyr、val、eaa、bcaa和taa隨時間存在顯著差異(p<0.05)。使用單因素anova檢驗以評估關(guān)于seqid-363的在測量時間點之間的血漿氨基酸水平的顯著差異，這些數(shù)據(jù)指示隨時間不存在顯著差異(p<0.05)。實施例41：使用營養(yǎng)性多肽慢性治療年長虛弱受試者的肌肉減少癥和身體功能喪失補充含有亮氨酸或亮氨酸的蛋白質(zhì)會改進運動之后的肌肉質(zhì)量積累，并且維持長期廢用期間的骨骼肌質(zhì)量(layman和walker,2006,thejournalofnutrition:136:319–323)。本文描述富含亮氨酸和必需氨基酸的營養(yǎng)性多肽。以雙盲方式將年長虛弱受試者隨機指定于特定治療組：對照組接受等熱量對照或3劑分類中的一個，治療組別持續(xù)30天每日3次接受15、30或40克劑量的營養(yǎng)性多肽制劑。在整個試驗時期期間，基于個體的身體質(zhì)量指數(shù)(bmi)和身體活動向招募的受試者提供以對照膳食。記錄食物和卡路里攝取。招募的受試者維持他們的常規(guī)每日活動。通過身體活動跟蹤器(fitbitflex腕帶)來測量每日身體活動和卡路里消耗。在第1天(在營養(yǎng)性多肽給藥之前)以及在治療已結(jié)束之后第31天通過mri(müller,m.j.等"assessmentanddefinitionofleanbodymassdeficiencyintheelderly."europeanjournalofclinicalnutrition(2014))或雙能x射線吸光測定術(shù)(dexa；nielsen,pallekjrerulff,jorgenladefoged和klausolgaard."leanbodymassbydualenergyx-rayabsorptiometry(dexa)andbyurineanddialysatecreatininerecoveryincapdandpre-dialysispatientscomparedtonormalsubjects."advperitdial10(1994):99-103.)來測量瘦性身體質(zhì)量以評估骨骼肌質(zhì)量的變化。也在治療時期開始和結(jié)束時使用簡短身體性能連串評分(volpato,stefano等"predictivevalueoftheshortphysicalperformancebatteryfollowinghospitalizationinolderpatients."thejournalsofgerontologyseriesa:biologicalsciencesandmedicalsciences66.1(2011):89-96.)、步態(tài)速度的量度、6分鐘行走測試(6mwt)和定時起立并行走測試(tugs；podsiadlo,d；richardson,s."thetimed'up&go':atestofbasicfunctionalmobilityforfrailelderlypersons".journaloftheamericangeriatricssociety(1991)39:142–8)來評估身體功能。在治療組別之間以及相對于對照來比較瘦性身體質(zhì)量以及sppb評分、步態(tài)速度、6mwt和tugs從基線的絕對變化和變化百分比以評估治療功效。實施例42：含有缺乏甲硫氨酸的營養(yǎng)性多肽的制劑的口服藥物動力學(xué)這個研究的目的在于在240分鐘的時期內(nèi)考查應(yīng)答于缺乏甲硫氨酸的營養(yǎng)性蛋白質(zhì)的血漿氨基酸濃度變化。以雙盲方式將4名年齡在18歲與50歲之間的表觀健康的受試者隨機指定于一連串處理劑，以170ml的體積口服接受20克seqid-426。使受試者禁食過夜(>8小時)，并且次日早晨在口服攝取營養(yǎng)性多肽之后在指定時間點(即0、15、30、60、90、120、150、180、210和240分鐘)收集靜脈血液樣品以評估血漿氨基酸濃度變化。通過questdiagnostics或laboratorycorporationofamerica來定量血漿氨基酸濃度。圖75-78顯示關(guān)于seqid-426的各測量氨基酸以及各聚集組，即必需氨基酸(eaa)、支鏈氨基酸(bcaa)和總氨基酸(taa)的血漿時間過程。使用單因素anova檢驗以評估關(guān)于seqid-426的在測量時間點之間的血漿氨基酸水平的顯著差異，這些數(shù)據(jù)指示glu和eaa隨時間存在顯著差異(p<0.05)?？疾檠獫{eaa時間過程的dunnett多重比較檢驗進一步指示在30和60分鐘時間點的血漿eaa水平顯著不同于在時間0分鐘的基礎(chǔ)水平。甲硫氨酸顯示隨時間無顯著變化。實施例43：在廢用性肌肉萎縮的嚙齒動物模型中預(yù)防肌肉質(zhì)量損失和恢復(fù)肌肉質(zhì)量廢用性骨骼肌萎縮常見于身體活動減少的持續(xù)時期期間。廢用性骨骼肌萎縮也可由腦中風(fēng)后神經(jīng)病變或神經(jīng)根病變相關(guān)的麻痹、去神經(jīng)支配或脊髓灰質(zhì)炎病毒性感染所致。長期身體活動減少和肌肉廢用導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)合成的基礎(chǔ)和餐后速率下降以及肌肉蛋白質(zhì)分解增加(wall和vanloon,2013,nutritionreviews:71:195–208)。膳食性補充必需氨基酸，具體來說支鏈氨基酸和亮氨酸，已顯示會減弱廢用性骨骼肌萎縮以及恢復(fù)肌肉質(zhì)量(wall和vanloon,2013,nutritionreviews:71:195–208)(martin等,2013,plosone:8:e75408)。在骨骼肌中，肌球蛋白ii是產(chǎn)生驅(qū)動肌肉收縮的力量的運動蛋白質(zhì)。肌球蛋白ii由包含兩個重鏈和四個輕鏈的異聚蛋白質(zhì)組成。骨骼肌合成代謝增加應(yīng)導(dǎo)致肌球蛋白重鏈亞型的濃度增加(和lundholm,2012,journaloftranslationalmedicine:10:238)。使用酶聯(lián)免疫吸附測定和實時定量pcr以測量骨骼肌的肌球蛋白重鏈亞型含量是評估化合物促進肌肉蛋白質(zhì)合成和肌肉組織增加的體外或體內(nèi)能力的適用手段(和lundholm,2012,journaloftranslationalmedicine:10:238)。將慢性劑量的本文所述的由于富含必需氨基酸和亮氨酸而選擇的營養(yǎng)性多肽于廢用性肌肉萎縮的嚙齒動物模型中慢性給藥以測量化合物預(yù)防和恢復(fù)肌肉質(zhì)量的功效。通過將膝部于延伸位置以及踝部于跖屈位置非手術(shù)固定(khan和sahani,2013,canadianjournalofphysiologyandpharmacology:8:1–8)(lee等,2014,anesthesiology:120:76–85)或通過石膏固定(martin等,2013,plosone:8:e75408)來在小鼠的單一后肢中誘發(fā)廢用性骨骼肌萎縮(pellegrino等,2011,thejournalofphysiology:589:2147–60)。肌肉固定導(dǎo)致比目魚肌質(zhì)量的損失在3、7、14和21天分別是它的原始質(zhì)量的11％、22％、39％和45％(khan和sahani,2013,canadianjournalofphysiologyandpharmacology:8:1–8)。通過將膝部于延伸位置以及踝部于跖屈位置非手術(shù)固定(khan和sahani,2013,canadianjournalofphysiologyandpharmacology:8:1–8)來在雄性c57bl/6小鼠(8周齡)的右后肢中誘發(fā)比目魚肌的廢用性骨骼肌萎縮。通過測量骨骼肌質(zhì)量和功能性質(zhì)來評估在嚙齒動物中營養(yǎng)性多肽對肌肉損失的保護作用。通過非手術(shù)固定雄性c57bl/6小鼠(8周齡)的右后肢(khan和sahani,2013,canadianjournalofphysiologyandpharmacology:8:1–8)來誘發(fā)比目魚肌的廢用性骨骼肌萎縮。動物經(jīng)受右后肢非手術(shù)固定，并且以每組10個動物隨機指定于媒介物或營養(yǎng)性多肽治療的治療組。通過在固定之后持續(xù)21天每日口服管飼來施用1-5g/kg的治療劑量。向一組年齡匹配的未固定后肢的對照小鼠提供營養(yǎng)性多肽以充當正常肌肉對照組。在第0天通過mri來評估基線比目魚肌質(zhì)量，并且在第3、7、10、14、17和21天通過mri來評估比目魚肌質(zhì)量的變化。在第21天處死動物。收集來自右后肢的萎縮性比目魚肌和來自左后肢的非萎縮性比目魚肌。記錄肌肉重量。使骨骼肌組織在冰上解凍。通過添加1:100蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物2和3至tper中來在使用之前立刻制備提取緩沖液。將組織樣品稱重于2ml螺旋蓋管中，并且在每g組織5ml的比率下添加提取緩沖液。添加2個無菌鋼珠至管中，并且在tissuelyserii(qiagen,valencia,ca)中在30hz下使樣品連續(xù)三次均質(zhì)化5分鐘。接著將管在12,000xg下離心5分鐘以集結(jié)細胞碎片。接著將上清液收集至標記的2ml管中。如本文所述測量從比目魚肌提取的蛋白質(zhì)中的肌球蛋白重鏈亞型2和4的蛋白質(zhì)水平(pellegrino等,2011,thejournalofphysiology:589:2147–60)(desaphy等,2005,neurobiologyofdisease:18:356–365)。或者，如本文所述通過定量pcr來測量比目魚肌中的肌球蛋白重鏈亞型2和4的mrna水平(和lundholm,2012,journaloftranslationalmedicine:10:238)。通過非萎縮性左后肢與萎縮性右肢之間比目魚肌中的肌球蛋白重鏈亞型2和4的蛋白質(zhì)或mrna水平或比目魚肌重量的比率來計算骨骼肌合成代謝。將營養(yǎng)性多肽對廢用性骨骼肌合成代謝的功效與接受媒介物的對照動物進行比較。在另一實驗中，測試在一段時期的肢體固定之后，營養(yǎng)性多肽恢復(fù)肌肉質(zhì)量的能力。通過非手術(shù)固定右后肢14天來在雄性c57bl/6小鼠(8周齡)中誘發(fā)比目魚肌的廢用性骨骼肌萎縮。一組年齡匹配的未固定后肢的對照小鼠充當正常肌肉對照。使患有由非手術(shù)固定所致的比目魚肌萎縮的動物從后肢固定解脫，并且隨機指定于各治療組。通過持續(xù)21天每日口服管飼來施用1-5g/kg的治療劑量。在第0天(后肢固定的最后一天)通過mri來評估基線比目魚肌質(zhì)量，并且在用提供的營養(yǎng)性多肽治療的第3、7、10、14、17和21天通過mri來評估比目魚肌質(zhì)量的變化。在第21天處死動物。收集來自右后肢的萎縮性比目魚肌和來自左后肢的非萎縮性比目魚肌。記錄肌肉重量。如本文所述測量從比目魚肌提取的蛋白質(zhì)中的肌球蛋白重鏈亞型2和4的蛋白質(zhì)和mrna水平。通過非萎縮性左后肢與萎縮性右肢之間比目魚肌中的肌球蛋白重鏈亞型2和4的蛋白質(zhì)或mrna水平或比目魚肌重量的比率來計算骨骼肌合成代謝。將營養(yǎng)性多肽對骨骼肌恢復(fù)的功效與接受媒介物的對照動物進行比較。用于檢測肌球蛋白重鏈2和4的酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)。用于肌球蛋白重鏈2和肌球蛋白重鏈4的elisa試劑盒從cloudclonecorp.(目錄號分別是sed416mu和sea755mu；wuhan,hubei,prc)獲得。磷酸鹽緩沖鹽水從lifetechnologies(目錄號20012，grandisland,ny)獲得。吐溫20從fisherscientific(目錄號bp337-100，pittsburgh,pa)獲得。在elx50微板條帶洗滌器(biotek,winooski,vt)上洗滌各板。在synergymx基于單色器的多模式微板讀取器(biotek,winooski,vt)上讀取各板。組織蛋白質(zhì)提取試劑(tper)從thermoscientific(目錄號78510，waltham,ma)獲得。蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物2和3從sigma-aldrich(目錄號分別是p8340、p0044和p5726；st.louis,mo)獲得。無菌2ml螺旋蓋管從fisherscientific(目錄號0553869c，pittsburgh,pa)獲得。不銹鋼5mm珠粒從qiagen(目錄號69989，valencia,ca)獲得。在tissuelyserii(qiagen,valencia,ca)上使組織樣品均質(zhì)化。使用來自thermoscientific(目錄號23236，waltham,ma)的coomassie加強型(bradford)蛋白質(zhì)測定來測定蛋白質(zhì)濃度。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析數(shù)據(jù)。將提取的蛋白質(zhì)上清液于提取緩沖液中稀釋至1mg/ml。用elisa試劑盒標準稀釋劑將這些標準化上清液稀釋4倍(用于肌球蛋白重鏈4)，或用elisa試劑盒標準稀釋劑將這些標準化上清液稀釋2.5倍(用于肌球蛋白重鏈2)。用相同比例的提取緩沖液和標準稀釋劑(25％(用于肌球蛋白重鏈4)和40％(用于肌球蛋白重鏈2))復(fù)原標準物，并且如制造商說明書中所述于相同濃度的提取緩沖液和標準稀釋劑中稀釋以產(chǎn)生標準曲線。遵循制造商說明書在100μl/孔下一式兩份操作標準物和樣品。在synergymx板讀取器上在450nm的吸光度下讀取各板。在excel中減去0pg/ml標準物吸光度的平均值之后產(chǎn)生各標準物、對照和樣品的一式兩份讀數(shù)的平均值。通過繪制各標準物的平均吸光度來產(chǎn)生標準曲線，并且在進行標準x＝log(x)變換之后，使用4參數(shù)邏輯等式，利用非線性回歸來在graphpadprism6上計算未知樣品濃度。使用graphpadprism6軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計檢驗。用于檢測肌球蛋白重鏈2和4的定量pcr。使用quick-rna試劑盒(zymoresearch,irvine,ca)從比目魚肌提取總rna。使用大容量cdna庫試劑盒(appliedbiosystems,forstercity,ca)從總rna合成cdna。肌球蛋白重鏈2和4的引物序列和定量pcr方案如本文所述(和lundholm,2012,journaloftranslationalmedicine:10:238)。使用c1000熱循環(huán)儀(bio-rad,forstercity,ca)進行定量pcr。通過相對于內(nèi)源性基因β-肌動蛋白和hprt進行標準化來計算相對mrna表達水平。使用graphpadprism6軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計檢驗。實施例43：在廢用性肌肉萎縮的嚙齒動物模型中預(yù)防肌肉質(zhì)量損失和恢復(fù)肌肉質(zhì)量廢用性骨骼肌萎縮常見于身體活動減少的持續(xù)時期期間。廢用性骨骼肌萎縮也可由腦中風(fēng)后神經(jīng)病變或神經(jīng)根病變相關(guān)的麻痹、去神經(jīng)支配或脊髓灰質(zhì)炎病毒性感染所致。長期身體活動減少和肌肉廢用導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)合成的基礎(chǔ)和餐后速率下降以及肌肉蛋白質(zhì)分解增加(wall和vanloon,2013,nutritionreviews:71:195–208)。膳食性補充必需氨基酸，具體來說支鏈氨基酸和亮氨酸，已顯示會減弱廢用性骨骼肌萎縮以及恢復(fù)肌肉質(zhì)量(wall和vanloon,2013,nutritionreviews:71:195–208)(martin等,2013,plosone:8:e75408)。在骨骼肌中，肌球蛋白ii是產(chǎn)生驅(qū)動肌肉收縮的力量的運動蛋白質(zhì)。肌球蛋白ii由包含兩個重鏈和四個輕鏈的異聚蛋白質(zhì)組成。骨骼肌合成代謝增加應(yīng)導(dǎo)致肌球蛋白重鏈亞型的濃度增加(和lundholm,2012,journaloftranslationalmedicine:10:238)。使用酶聯(lián)免疫吸附測定和實時定量pcr以測量骨骼肌的肌球蛋白重鏈亞型含量是評估化合物促進肌肉蛋白質(zhì)合成和肌肉組織增加的體外或體內(nèi)能力的適用手段(和lundholm,2012,journaloftranslationalmedicine:10:238)。將慢性劑量的本文所述的由于富含必需氨基酸和亮氨酸而選擇的營養(yǎng)性多肽于廢用性肌肉萎縮的嚙齒動物模型中慢性給藥以測量化合物預(yù)防和恢復(fù)肌肉質(zhì)量的功效。通過將膝部于延伸位置以及踝部于跖屈位置非手術(shù)固定(khan和sahani,2013,canadianjournalofphysiologyandpharmacology:8:1–8)(lee等,2014,anesthesiology:120:76–85)或通過石膏固定(martin等,2013,plosone:8:e75408)來在小鼠的單一后肢中誘發(fā)廢用性骨骼肌萎縮(pellegrino等,2011,thejournalofphysiology:589:2147–60)。肌肉固定導(dǎo)致比目魚肌質(zhì)量的損失在3、7、14和21天分別是它的原始質(zhì)量的11％、22％、39％和45％(khan和sahani,2013,canadianjournalofphysiologyandpharmacology:8:1–8)。通過將膝部于延伸位置以及踝部于跖屈位置非手術(shù)固定(khan和sahani,2013,canadianjournalofphysiologyandpharmacology:8:1–8)來在雄性c57bl/6小鼠(8周齡)的右后肢中誘發(fā)比目魚肌的廢用性骨骼肌萎縮。通過測量骨骼肌質(zhì)量和功能性質(zhì)來評估在嚙齒動物中營養(yǎng)性多肽對肌肉損失的保護作用。通過非手術(shù)固定雄性c57bl/6小鼠(8周齡)的右后肢(khan和sahani,2013,canadianjournalofphysiologyandpharmacology:8:1–8)來誘發(fā)比目魚肌的廢用性骨骼肌萎縮。動物經(jīng)受右后肢非手術(shù)固定，并且以每組10個動物隨機指定于媒介物或營養(yǎng)性多肽治療的治療組。通過在固定之后持續(xù)21天每日口服管飼來施用1-5g/kg的治療劑量。向一組年齡匹配的未固定后肢的對照小鼠提供營養(yǎng)性多肽以充當正常肌肉對照組。在第0天通過mri來評估基線比目魚肌質(zhì)量，并且在第3、7、10、14、17和21天通過mri來評估比目魚肌質(zhì)量的變化。在第21天處死動物。收集來自右后肢的萎縮性比目魚肌和來自左后肢的非萎縮性比目魚肌。記錄肌肉重量。使骨骼肌組織在冰上解凍。通過添加1:100蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物2和3至tper中來在使用之前立刻制備提取緩沖液。將組織樣品稱重于2ml螺旋蓋管中，并且在每g組織5ml的比率下添加提取緩沖液。添加2個無菌鋼珠至管中，并且在tissuelyserii(qiagen,valencia,ca)中在30hz下使樣品連續(xù)三次均質(zhì)化5分鐘。接著將管在12,000xg下離心5分鐘以集結(jié)細胞碎片。接著將上清液收集至標記的2ml管中。如本文所述測量從比目魚肌提取的蛋白質(zhì)中的肌球蛋白重鏈亞型2和4的蛋白質(zhì)水平(pellegrino等,2011,thejournalofphysiology:589:2147–60)(desaphy等,2005,neurobiologyofdisease:18:356–365)?；蛘撸绫疚乃鐾ㄟ^定量pcr來測量比目魚肌中的肌球蛋白重鏈亞型2和4的mrna水平(和lundholm,2012,journaloftranslationalmedicine:10:238)。通過非萎縮性左后肢與萎縮性右肢之間比目魚肌中的肌球蛋白重鏈亞型2和4的蛋白質(zhì)或mrna水平或比目魚肌重量的比率來計算骨骼肌合成代謝。將營養(yǎng)性多肽對廢用性骨骼肌合成代謝的功效與接受媒介物的對照動物進行比較。在另一實驗中，測試在一段時期的肢體固定之后，營養(yǎng)性多肽恢復(fù)肌肉質(zhì)量的能力。通過非手術(shù)固定右后肢14天來在雄性c57bl/6小鼠(8周齡)中誘發(fā)比目魚肌的廢用性骨骼肌萎縮。一組年齡匹配的未固定后肢的對照小鼠充當正常肌肉對照。使患有由非手術(shù)固定所致的比目魚肌萎縮的動物從后肢固定解脫，并且隨機指定于各治療組。通過持續(xù)21天每日口服管飼來施用1-5g/kg的治療劑量。在第0天(后肢固定的最后一天)通過mri來評估基線比目魚肌質(zhì)量，并且在用提供的營養(yǎng)性多肽治療的第3、7、10、14、17和21天通過mri來評估比目魚肌質(zhì)量的變化。在第21天處死動物。收集來自右后肢的萎縮性比目魚肌和來自左后肢的非萎縮性比目魚肌。記錄肌肉重量。如本文所述測量從比目魚肌提取的蛋白質(zhì)中的肌球蛋白重鏈亞型2和4的蛋白質(zhì)和mrna水平。通過非萎縮性左后肢與萎縮性右肢之間比目魚肌中的肌球蛋白重鏈亞型2和4的蛋白質(zhì)或mrna水平或比目魚肌重量的比率來計算骨骼肌合成代謝。將營養(yǎng)性多肽對骨骼肌恢復(fù)的功效與接受媒介物的對照動物進行比較。用于檢測肌球蛋白重鏈2和4的酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)。用于肌球蛋白重鏈2和肌球蛋白重鏈4的elisa試劑盒從cloudclonecorp.(目錄號分別是sed416mu和sea755mu；wuhan,hubei,prc)獲得。磷酸鹽緩沖鹽水從lifetechnologies(目錄號20012，grandisland,ny)獲得。吐溫20從fisherscientific(目錄號bp337-100，pittsburgh,pa)獲得。在elx50微板條帶洗滌器(biotek,winooski,vt)上洗滌各板。在synergymx基于單色器的多模式微板讀取器(biotek,winooski,vt)上讀取各板。組織蛋白質(zhì)提取試劑(tper)從thermoscientific(目錄號78510，waltham,ma)獲得。蛋白酶抑制劑混合物和磷酸酶抑制劑混合物2和3從sigma-aldrich(目錄號分別是p8340、p0044和p5726；st.louis,mo)獲得。無菌2ml螺旋蓋管從fisherscientific(目錄號0553869c，pittsburgh,pa)獲得。不銹鋼5mm珠粒從qiagen(目錄號69989，valencia,ca)獲得。在tissuelyserii(qiagen,valencia,ca)上使組織樣品均質(zhì)化。使用來自thermoscientific(目錄號23236，waltham,ma)的coomassie加強型(bradford)蛋白質(zhì)測定來測定蛋白質(zhì)濃度。使用microsoftexcel14.0.7128.5000版(microsoftcorporation,redmond,wa)和用于windows的graphpadprism6.03版(graphpadsoftware,lajolla,ca)分析數(shù)據(jù)。將提取的蛋白質(zhì)上清液于提取緩沖液中稀釋至1mg/ml。用elisa試劑盒標準稀釋劑將這些標準化上清液稀釋4倍(用于肌球蛋白重鏈4)，或用elisa試劑盒標準稀釋劑將這些標準化上清液稀釋2.5倍(用于肌球蛋白重鏈2)。用相同比例的提取緩沖液和標準稀釋劑(25％(用于肌球蛋白重鏈4)和40％(用于肌球蛋白重鏈2))復(fù)原標準物，并且如制造商說明書中所述于相同濃度的提取緩沖液和標準稀釋劑中稀釋以產(chǎn)生標準曲線。遵循制造商說明書在100μl/孔下一式兩份操作標準物和樣品。在synergymx板讀取器上在450nm的吸光度下讀取各板。在excel中減去0pg/ml標準物吸光度的平均值之后產(chǎn)生各標準物、對照和樣品的一式兩份讀數(shù)的平均值。通過繪制各標準物的平均吸光度來產(chǎn)生標準曲線，并且在進行標準x＝log(x)變換之后，使用4參數(shù)邏輯等式，利用非線性回歸來在graphpadprism6上計算未知樣品濃度。使用graphpadprism6軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計檢驗。用于檢測肌球蛋白重鏈2和4的定量pcr。使用quick-rna試劑盒(zymoresearch,irvine,ca)從比目魚肌提取總rna。使用大容量cdna庫試劑盒(appliedbiosystems,forstercity,ca)從總rna合成cdna。肌球蛋白重鏈2和4的引物序列和定量pcr方案如本文所述(和lundholm,2012,journaloftranslationalmedicine:10:238)。使用c1000熱循環(huán)儀(bio-rad,forstercity,ca)進行定量pcr。通過相對于內(nèi)源性基因β-肌動蛋白和hprt進行標準化來計算相對mrna表達水平。使用graphpadprism6軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計檢驗。盡管本發(fā)明已參照優(yōu)選實施方案和各種替代性實施方案加以特定顯示和描述，但相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員將了解可在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下在其中進行各種形式和細節(jié)變化。在本說明書的主體內(nèi)引用的所有參考文獻、授予的專利和專利申請都出于所有目的據(jù)此以引用的方式整體并入本文。表1當前第1頁12當前第1頁12