本發(fā)明涉及食品或保健品領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種利用益生菌發(fā)酵制備果蔬或谷物或藥食同源酵素保健食品的方法。

背景技術(shù)：

酵素類保健食品是基于新鮮水果和蔬菜等天然食用原料，利用微生物的發(fā)酵作用，大量產(chǎn)生和積累所需的代謝產(chǎn)物，最終獲得具有特殊營養(yǎng)和保健功能的食用產(chǎn)品。

酵素在國外已十分風(fēng)靡。在日本和我國臺(tái)灣地區(qū)，酵素類食品作為一種功能食品十分受歡迎。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，僅在日本，現(xiàn)有品牌就有幾百種，每年有超過2000萬人食用，市場反應(yīng)非常好。臺(tái)灣酵素類保健食品有40多年生產(chǎn)歷史，有百余種產(chǎn)品上市銷售。在亞洲其他地區(qū)如韓國、馬來西亞、印度尼西亞等地也非常暢銷。近期，在歐洲與美國、加拿大等地，酵素類保健食品也逐漸風(fēng)靡。目前國內(nèi)市場銷售的酵素類食品多數(shù)為國外進(jìn)口。

但是，傳統(tǒng)的酵素產(chǎn)品采用自然發(fā)酵法，發(fā)酵周期長，通常為一年左右甚至更長時(shí)間。同時(shí)自然發(fā)酵法不便于加工工藝的控制，產(chǎn)品穩(wěn)定性相對(duì)較差。因而效率低，產(chǎn)品價(jià)格昂貴。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種果蔬或谷物或藥食同源酵素保健食品及其制備方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備果蔬或谷物或藥食同源酵素發(fā)酵原液的方法，所述方法包括：以果蔬或谷物或藥食同源類食材提取物為發(fā)酵底物，以保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和青春雙歧桿菌作為發(fā)酵菌種進(jìn)行發(fā)酵，獲得果蔬或谷物或藥食同源酵素發(fā)酵原液。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的果蔬包括(但不限于)：木瓜、菠蘿、蘋果、梨、橙、葡萄、西瓜、龍眼、火龍果、櫻桃、獼猴桃、草莓、檸檬、柚子、水蜜桃、橘子、藍(lán)莓、香蕉、荔枝、石榴、無花果、金桔、蘆柑、香瓜、哈密瓜、杏、桑椹、枇杷、梅子、楊梅、芒果、椰子汁、山竹、橄欖、胡蘿卜、黃瓜、甘藍(lán)、西紅柿、蘑菇、海帶、木耳、冬瓜、山藥、秋葵、蘆筍等；或

所述的谷物包括(但不限于)：燕麥、青稞、小麥、大麥、黑米、紫米、綠豆、紅豆、大豆、薏米、玉米等；或

所述的藥食同源食材包括(但不限于)：紅棗、枸杞、桂圓、百合、蓮子、蜂蜜、山楂、沙棘、茯苓、芡實(shí)、金銀花、紫蘇、人參、玫瑰花等。

在另一優(yōu)選例中，所述的果蔬或谷物或藥食同源類食材提取物是果蔬或谷物或藥食同源類食材(所述的果蔬包括果蔬干或鮮果蔬肉)與水混合勻漿，用纖維素酶和果膠酶酶解后的產(chǎn)物；勻漿后經(jīng)過或不經(jīng)過酶水解；或所述的果蔬提取物是果蔬榨汁獲得的液態(tài)產(chǎn)物或果蔬破碎后與水混合勻漿的產(chǎn)物。

在另一優(yōu)選例中，所述的酶是分解纖維素或分解果膠質(zhì)的酶；較佳地為纖維素酶和/或果膠酶；或所述的酶是促進(jìn)淀粉水解的酶；較佳地為液化酶和/或糖化酶。

在另一優(yōu)選例中，所述的纖維素酶和果膠酶的比例為1:2～2:1(酶活性比)。

在另一優(yōu)選例中，所述的谷物與水混合勻漿時(shí)，料水比(質(zhì)量比)為1:5～15；較佳地為1:8～12。

在另一優(yōu)選例中，在酶解后，還包括過濾的過程；較佳地，以200目篩網(wǎng)進(jìn)行過濾，獲取濾液。

在另一優(yōu)選例中，所述的果蔬或谷物或藥食同源類食材提取物在經(jīng)過殺菌后用作發(fā)酵底物。

在另一優(yōu)選例中，所述的保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和青春雙歧桿菌(按照接種量)以(1～5)∶(1～5)∶(1～5)∶(1～5)；較佳地以(1～3)∶(1～3)∶(1～3)∶(1～3)的比例進(jìn)行混合，用于發(fā)酵；較佳地，以(1±0.1)∶(1±0.1)∶(1±0.1)∶(2±0.2)、(2±0.2)∶(2±0.2)∶(1±0.1)∶(1±0.1)或(1±0.1)∶(1±0.1)∶(1±0.1)∶(3±0.3)的比例進(jìn)行混合，用于發(fā)酵；較佳地，以(1±0.1)∶(1±0.1)∶(1±0.1)∶(2±0.2)進(jìn)行混合。

在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵菌種的接種量為4-12％；較佳地為8-10％。

在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵底物中可溶性固形物含量8-15％；較佳地8-11％。

在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵時(shí)間6～10天；較佳地為7-9天。

在另一優(yōu)選例中，發(fā)酵后，進(jìn)行離心(較佳地為低溫離心)和膜過濾除菌。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種果蔬或谷物或藥食同源類食材酵素發(fā)酵原液，所述的果蔬或谷物或藥食同源類食材酵素發(fā)酵原液由所述的方法制備獲得。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的果蔬或谷物或藥食同源類食材酵素發(fā)酵原液的用途，用于制備果蔬或谷物或藥食同源酵素。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備果蔬或谷物或藥食同源酵素的方法，所述方法包括利用所述的果蔬或谷物或藥食同源酵素發(fā)酵原液制備果蔬或谷物或藥食同源酵素。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述方法還包括：還添加益生元、維生素和礦物質(zhì)。

在另一優(yōu)選例中，所述的益生元包括：低聚異麥芽糖和/或低聚木糖等。

在另一優(yōu)選例中，所述的維生素包括：維生素B₆、維生素B₁₂、葉酸、肌醇。

在另一優(yōu)選例中，所述的礦物質(zhì)包括：L-抗壞血酸鉀、乳酸鈣。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種果蔬或谷物或藥食同源類酵素或其加工制劑，其中包含所述的果蔬或谷物或藥食同源酵素發(fā)酵原液；較佳地，所述的果蔬或谷物或藥食同源酵素是由所述的方法制備獲得的；較佳地，所述的酵素中還包括：益生元、維生素和礦物質(zhì)。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的益生元、維生素和礦物質(zhì)包括如下：

在另一優(yōu)選例中，所述的果蔬或谷物或藥食同源酵素的加工制劑包括(但不限于)：凍干粉劑，濃縮液，顆粒劑，膠囊劑，口服液，片劑。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1、桂圓酵素發(fā)酵原液的制備流程示意圖。

圖2、桂圓酵素成品的加工流程示意圖。

圖3、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖4、DNS葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖5、甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖6、接種量對(duì)殘?zhí)橇康挠绊憽?/p>

圖7、接種量對(duì)胞外多糖的影響。

圖8、接種量對(duì)甘露醇的影響。

圖9、接種量對(duì)SOD影響。

圖10、底物濃度對(duì)殘?zhí)橇康挠绊憽?/p>

圖11、底物濃度對(duì)胞外多糖的影響。

圖12、底物濃度對(duì)甘露醇的影響。

圖13、發(fā)酵時(shí)間對(duì)殘?zhí)橇康挠绊憽?/p>

圖14、發(fā)酵時(shí)間對(duì)甘露醇的影響。

圖15、發(fā)酵時(shí)間對(duì)多糖(LP)的影響。

圖16、發(fā)酵時(shí)間對(duì)SOD影響。

圖17、桂圓酵素DPPH自由基清除能力。

圖18、桂圓酵素羥基自由基清除能力。

圖19、桂圓酵素超氧陰離子自由基清除能力。

圖20、紅棗酵素原液制備工藝流程圖。

圖21、紅棗酵素保健食品制備工藝流程圖。

圖22、木瓜酵素原液制備工藝流程圖。

圖23、木瓜酵素保健食品的制備工藝流程圖。

圖24、混合果蔬酵素制備工藝流程圖。

圖25、混合果蔬酵素粉保健食品制備工藝流程圖。

圖26、燕麥酵素原液制備工藝流程圖。

圖27、燕麥酵素制備工藝流程圖。

圖28、青稞酵素制備工藝流程圖。

圖29、青稞酵素保健食品制備工藝流程圖。

圖30、保加利亞乳桿菌生長曲線。

圖31、嗜熱鏈球菌生長曲線。

圖32、嗜酸乳桿菌生長曲線。

圖33、青春雙歧桿菌生長曲線。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，篩選到合適的發(fā)酵菌種，以果蔬或谷物或藥食同源類食材為發(fā)酵原材料，優(yōu)化了發(fā)酵工藝，獲得了果蔬或谷物或藥食同源酵素發(fā)酵原液，經(jīng)后續(xù)加工獲得果蔬或谷物或藥食同源酵素產(chǎn)品。該果蔬或谷物或藥食同源酵素富含發(fā)酵過程中累積的功效成分胞外多糖、甘露醇和SOD，是一種理想的保健食品。

術(shù)語

如本文所用，所述的“果蔬或谷物或藥食同源酵素發(fā)酵原液”是指以果蔬或谷物或藥食同源類食材提取物為發(fā)酵底物，利用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和青春雙歧桿菌四種菌株的混合菌株進(jìn)行發(fā)酵，獲得的發(fā)酵產(chǎn)物。其也被簡稱為“發(fā)酵產(chǎn)物”。

如本文所用，所述的“果蔬或谷物或藥食同源酵素”是指將果蔬或谷物或藥食同源酵素發(fā)酵原液進(jìn)行調(diào)配、除菌等處理后獲得的成品，其可作為保健品或食品。

如本文所用，所述的“藥食同源類食材”是指具有有益健康的功效且也常被作為食品的一類食材。

生產(chǎn)工藝

本發(fā)明的制備果蔬或谷物或藥食同源酵素發(fā)酵原液的方法包括：以果蔬或谷物或藥食同源類食材提取物為發(fā)酵底物，以保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和青春雙歧桿菌作為發(fā)酵菌種進(jìn)行發(fā)酵，獲得果蔬或谷物或藥食同源類食材酵素發(fā)酵原液。在以往的技術(shù)中，制作酵素主要以自然發(fā)酵為主，所需時(shí)間較長且發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量難以控制。因此，本發(fā)明人考察了多種類的有益菌，最終篩選到保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和青春雙歧桿菌，利用該四種菌株作為發(fā)酵菌種對(duì)果蔬或谷物或藥食同源類食材提取物進(jìn)行發(fā)酵，可以獲得富含胞外多糖、甘露醇和SOD等有益成分的發(fā)酵產(chǎn)物。并且，利用該四種菌株作為發(fā)酵菌株對(duì)果蔬或谷物或藥食同源類食材提取物進(jìn)行發(fā)酵，能夠在很短的時(shí)期內(nèi)(約1周)獲得發(fā)酵產(chǎn)物，與采用自然發(fā)酵法生產(chǎn)酵素相比，極大地降低了生產(chǎn)時(shí)間，使得果蔬或谷物或藥食同源酵素的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌和青春雙歧桿菌以(1～5)∶(1～5)∶(1～5)∶(1～5)；較佳地以(1～3)∶(1～3)∶(1～3)∶(1～3)的比例進(jìn)行混合，用于發(fā)酵；較佳地，以(1±0.1)∶(1±0.1)∶(1±0.1)∶(2±0.2)、(2±0.2)∶(2±0.2)∶(1±0.1)∶(1±0.1)或(1±0.1)∶(1±0.1)∶(1±0.1)∶(3±0.3)的比例進(jìn)行混合，用于發(fā)酵；較佳地，以(1±0.1)∶(1±0.1)∶(1±0.1)∶(2±0.2)進(jìn)行混合。在上述配比下混合用于發(fā)酵，可在發(fā)酵產(chǎn)物中獲得較多的胞外多糖、甘露醇和SOD等有益健康的營養(yǎng)物質(zhì)。

關(guān)于混合菌株的初始接種量，本發(fā)明研究后發(fā)現(xiàn)，采用較大的接種量能快速合成產(chǎn)物，但如果接種量過大，也可能使菌種生長過快、營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，而出現(xiàn)菌體早衰，發(fā)酵液黏度增加，發(fā)酵后勁不足，從而影響乳酸產(chǎn)量及功效成分的得率。如果接種量過少，菌體增長緩慢，會(huì)延長發(fā)酵周期，不利于菌株適應(yīng)酶解液高產(chǎn)。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的發(fā)酵菌種的接種量為4-12％；較佳地為8-10％。

根據(jù)原材料的不同，需進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚韥慝@得發(fā)酵底物，例如對(duì)于水份含 量充分且營養(yǎng)成分能被保留在榨汁后的液體中的果蔬，可以采用壓榨的方法獲得發(fā)酵底物；對(duì)于淀粉含量豐富的谷物類，則需要加以液化或淀粉酶解。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，發(fā)酵底物中可溶性固形物含量(即發(fā)酵底物濃度)8-11％。在該范圍內(nèi)，殘?zhí)橇颗c固形物含量比值較低，說明乳酸菌發(fā)酵快，對(duì)碳源利用率高，胞外多糖和甘露醇得率相對(duì)較高。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，發(fā)酵時(shí)間6～10天。較佳地為7-9天，在該時(shí)間范圍內(nèi)，發(fā)酵液中胞外多糖、SOD、甘露糖產(chǎn)生較多而殘?zhí)橇枯^低。

本發(fā)明優(yōu)化的工藝可保證產(chǎn)品的加工穩(wěn)定性，同時(shí)大大縮短了發(fā)酵周期，顯著提高有效成分提取率。

在獲得了果蔬或谷物或藥食同源酵素發(fā)酵原液后，可將之進(jìn)行調(diào)配、除菌，來制備可食用的果蔬或谷物或藥食同源酵素。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在發(fā)酵后，通過離心、較佳地為低溫離心去除固形物后，再通過膜過濾的方法進(jìn)行除菌。采用該工藝可有效地實(shí)現(xiàn)除菌，并且更完全地保留有效成分的活性。本發(fā)明首次將膜過濾除菌技術(shù)應(yīng)用于酵素產(chǎn)品加工工藝中，替代傳統(tǒng)加熱殺菌方法，有效降低因高溫對(duì)產(chǎn)品營養(yǎng)成分產(chǎn)生的破壞作用，提高產(chǎn)品營養(yǎng)價(jià)值和有效成分利用率。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在制備果蔬或谷物或藥食同源酵素時(shí)，除了果蔬或谷物或藥食同源酵素發(fā)酵原液以外，根據(jù)需要，還可在其中添加益生元(包括：低聚異麥芽糖和/或低聚木糖等)和維生素，從而使得所述果蔬或谷物或藥食同源酵素具備均衡有效的營養(yǎng)物質(zhì)，有益于身體健康。添加的益生元、維生素等有益物質(zhì)的種類可以根據(jù)需要而定，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的范圍內(nèi)。

果蔬或谷物或藥食同源酵素產(chǎn)品

本發(fā)明還提供了應(yīng)用所述的制備果蔬或谷物或藥食同源酵素發(fā)酵原液的方法制備獲得的果蔬或谷物或藥食同源酵素發(fā)酵原液，以及由該果蔬或谷物或藥食同源酵素發(fā)酵原液經(jīng)加工獲得的可食用(或服用)的果蔬或谷物或藥食同源酵素。所述的果蔬或谷物或藥食同源酵素的加工制劑包括但不限于凍干粉劑，濃縮液，顆粒劑，膠囊劑，口服液，片劑。

本發(fā)明的果蔬或谷物或藥食同源酵素可被制備成食品、保健品或藥品。

本發(fā)明的果蔬或谷物或藥食同源酵素當(dāng)用于服用時(shí)，一般每天服用量50-200ml/人是較為適宜的。當(dāng)然，根據(jù)個(gè)人體質(zhì)或根據(jù)保健醫(yī)生的推薦，還可以對(duì)服用量進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

本發(fā)明的果蔬或谷物或藥食同源酵素是現(xiàn)代生物工程技術(shù)與中醫(yī)藥理論相結(jié)合的產(chǎn)物。其不但保持了果蔬或谷物或藥食同源類食材中原有的植物粗多糖、黃酮等功效成分，還含有有機(jī)酸、益生元、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，同時(shí)，可以改善腸道菌群平衡，造成不利于病原菌生存的環(huán)境，使腸道內(nèi)有害菌群減少，刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)提高其免疫力。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

一、試驗(yàn)材料

1、主要原材料

桂圓(桂圓干或鮮桂圓)。

低聚異麥芽糖(益生元)。

2、實(shí)驗(yàn)菌種

保加利亞乳桿菌6098、嗜熱鏈球菌6219、嗜酸乳桿菌6085、青春雙歧桿菌6176，均由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供，培養(yǎng)溫度均為37℃。

3、主要培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(CICC指導(dǎo))：蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5g，檸檬酸二銨2.0g，吐溫80 1.0g，K₂HPO₄2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，CaCO₃20.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH6.8。培養(yǎng)基滅菌條件：121℃，15min。

4、主要試劑

葡萄糖，苯酚、濃硫酸，濃鹽酸，高碘酸鈉，L-鼠李糖，醋酸銨，冰乙酸， 乙酰丙酮，3,5-二硝基水楊酸，氫氧化鈉，酒石酸鉀鈉，重蒸酚；亞硫酸鈉，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，鄰苯三酚，試劑均為分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司。

5、主要儀器設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)Thermo；酶標(biāo)儀Thermo；-80℃超低溫冰箱Thermo；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；pH計(jì)梅特勒-托利多儀器公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器、電子分析天平、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、阿貝折光儀。

二、分析方法

1、可溶性固形物含量Brix測定

阿貝折光儀(手持式)。

2、發(fā)酵液pH值測定

精密pH計(jì)。

3、還原糖濃度測定

發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛鹊臏y定采用DNS法：

(1)DNS試劑：6.3g 3,5-二硝基水楊酸溶于262ml 2mol/L的氫氧化鈉溶液中。將此溶液與500ml含有182g酒石酸鉀鈉的熱水混合。向該溶液中再加入5g重蒸酚和5g亞硫酸鈉，充分?jǐn)嚢枋怪芙猓芤豪鋮s后，用水稀釋到1000ml。儲(chǔ)存于棕色瓶中(需在冰箱中放置一周后方可使用)。

(2)還原糖含量的測定采用DNS法

稱取大于1g的葡萄糖置于熱風(fēng)干燥箱98℃干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取1.000g葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至1000ml。分別按表3-1進(jìn)行配置操作，充分混勻后于沸水浴中加熱煮沸5min。流水沖冷卻后再分別向各試管中加入蒸餾水4ml，混勻。以管1為空白對(duì)照，540nm波長下測各管的吸光度。繪制吸光度-葡萄糖含量曲線。

4、多糖(LP)含量測定

采用苯酚-硫酸法。

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

配制100μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL溶液于試管中，用蒸餾水補(bǔ)至2.0mL，順序加入1mL 6％的苯酚和5mL濃硫酸，加入1.0mL的6％苯酚溶液，混合均勻后再加入5.0mL濃硫酸進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)混合液靜置10min后在25～30℃水浴中放置25min。待溶液顏色穩(wěn)定后，以試劑空白為對(duì)照，于490nm下測定吸光值。以吸光值A(chǔ)為縱橫坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，做出苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)胞外多糖的測定

桂圓發(fā)酵液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后，4800rpm離心20min，取上清液5毫升，加入4倍體積的無水乙醇充分振蕩后過夜以沉淀多糖。4800r/min轉(zhuǎn)速下離心20min獲得淡黃色沉淀。沉淀加入20mL無水乙醇，充分?jǐn)嚢韬笤儆?800r/min下離心20min。獲得的沉淀重復(fù)以上操作4-5次，以清除粗多糖沉淀中的單糖雜質(zhì)，直至離心后所得上清液，采用硫酸-苯酚法測定不顯色，以證實(shí)無糖類物質(zhì)的存在。

多糖沉淀用水進(jìn)行溶解定容至100mL，若濃度大再取出1mL定容至50mL(即稀釋50×100倍)，并用硫酸-苯酚法檢測多糖含量。按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的實(shí)驗(yàn)步驟測定吸光值，再由上述標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算多糖含量。

5、甘露醇的測定

采用比色法。

甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取25mL比色管分別準(zhǔn)確加入50μg·ml-1的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0m1，再用蒸餾水分別補(bǔ)充至1ml，然后在每支比色管中加入1ml高碘酸鈉溶液，混勻，放10min，后加入2ml0.1％L-鼠李糖溶液，充分混勻后加入Nash試劑4ml，53℃水浴保溫15min，取出用水冷卻，用10mm光徑的比色皿，在412nm波長下測定吸光度，以吸光度對(duì)甘露醇濃度作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：將終止反應(yīng)后的發(fā)酵液過濾、離心后，取上清液適當(dāng)稀釋后，準(zhǔn)確吸取1.0ml，使其中甘露醇的含量在10～50μg·ml-1范圍內(nèi)，然后按測定 甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作測定吸光度。

6、超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

按照GB/T 5009.171-2003的方法。

7、菌落總數(shù)檢測：GB4789.2-2010。

8、大腸菌群計(jì)數(shù)：GB4789.3-2010。

9、金黃色葡萄球菌檢測：GB4789.10-2010。

10、益生菌生長曲線測定方法

配置MRS液體培養(yǎng)基分裝于24只試管中，每只試管裝液量為10ml。分別接入10μl活化好的四種益生菌種子液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48h。從0h開始，每隔2h取出一瓶，在600nm波長下測定菌體OD值。以未接菌的液體培養(yǎng)基為對(duì)照，同時(shí)測定剛剛接種菌種時(shí)的菌體OD值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體OD值為縱坐標(biāo)，繪制菌種的生長曲線。

11、益生菌種子發(fā)酵液濃度測定

將益生菌種子發(fā)酵液分別作10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10稀釋。取10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8稀釋倍數(shù)的菌液涂布平板，37℃靜置培養(yǎng)24hrs，測量菌落數(shù)，計(jì)算菌液濃度。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1、菌種的保藏

采用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，傳代三次后，接入MRS固體斜面培養(yǎng)基，采用低溫定期移植法放入4℃冰箱中保藏。

2、益生菌種子發(fā)酵液的制備

自菌種保藏斜面刮取一環(huán)生長良好的菌體，接入裝有50ml液體種子培養(yǎng) 基的250ml三角瓶中，37℃靜置培養(yǎng)15-24hrs。以10％的接種量，將已活化好的種子培養(yǎng)液接入裝有100ml生產(chǎn)培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37℃靜置培養(yǎng)15-24hrs后備用。

實(shí)施例1、發(fā)酵底物的制備及菌株

桂圓酵素發(fā)酵原液的制備流程如圖1所示。

1、桂圓水溶性提取物的制備

桂圓果干剪碎后稱重，按料水比1:10(質(zhì)量比)加水，90℃浸泡30min后，用高速組織搗碎機(jī)進(jìn)行打漿，將纖維素酶和果膠酶按照1:1的比例(酶活性比)添加進(jìn)行酶解，兩種酶總的添加量0.2％(質(zhì)量比)，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間120min，酶解結(jié)束后90℃滅酶10min，酶解液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，取濾液，即得桂圓水溶性提取物。

2、殺菌

桂圓水溶性提取物經(jīng)95℃殺菌15min，作為發(fā)酵底物。

3、發(fā)酵菌株

以前面制備的發(fā)酵底物作為底物，針對(duì)大量候選菌株經(jīng)過大規(guī)模篩選，最終確定將保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌四種菌株組合用于進(jìn)行發(fā)酵。

發(fā)酵規(guī)模為：2L搖瓶；發(fā)酵溫度為37℃，兼性厭氧培養(yǎng)，無需通氣。

以胞外多糖、甘露醇、超氧化物歧化酶、殘?zhí)橇康茸鳛樵u(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵工藝條件。胞外多糖、甘露醇、超氧化物歧化酶這些有益成分越高，則表明獲得的發(fā)酵產(chǎn)物功效成分含量越高。菌種利用發(fā)酵底物中的糖類物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵，殘?zhí)橇吭降停ǔＵf明糖被利用的越充分，發(fā)酵進(jìn)行的程度越高，發(fā)酵產(chǎn)物也越多。

實(shí)施例2、標(biāo)準(zhǔn)曲線

1、胞外多糖測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用苯酚-硫酸法進(jìn)行多糖含量測定。如前方法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，制作數(shù)據(jù)如 表1。

表1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作數(shù)據(jù)

獲得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3。吸光值(A490nm)與葡萄糖濃度(×Csug，100μg/mL)的關(guān)系為：y＝0.0088x+0.097，相關(guān)系數(shù)R²＝0.9958；表明葡萄糖溶液在5-50μg/mL呈良好的線性關(guān)系。

2、殘?zhí)橇繕?biāo)準(zhǔn)曲線測定

制作DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線，制作數(shù)據(jù)如表2。

表2、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液配制

測定不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，以葡萄糖含量X為橫坐標(biāo)，以吸光值Y為縱坐標(biāo)，作出的葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。

由圖4可見，在波長540nm處特征吸收的吸光度Y與葡萄糖含量X之間的關(guān)系為Y＝2.8473x+0.0266(相關(guān)系數(shù)R²＝0.9987)，此葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線用作測 定結(jié)果的計(jì)算依據(jù)。

3、甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用比色法進(jìn)行甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。制作數(shù)據(jù)如表3。

表3、甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

由圖5可見，在波長412nm處特征吸收的吸光度Y與甘露醇含量X之間的關(guān)系為Y＝0.0098x+0.13486(相關(guān)系數(shù)R²＝0.9999)，表明甘露醇含量在10～50μg·ml^-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

實(shí)施例3、菌種生長曲線

1、保加利亞乳桿菌生長曲線

從圖30的生長曲線可以看出，保加利亞乳桿菌OD值從10h至22hrs呈對(duì)數(shù)快速增長，這一階段為對(duì)數(shù)生長期。24h至38h菌種生長代謝穩(wěn)定，菌體OD值一直保持在2.8左右，這一階段為菌種生長的穩(wěn)定期。40h后菌體OD值開始逐漸下降，為菌體生長的衰亡期。

2、嗜熱鏈球菌生長曲線

從圖31的生長曲線可以看出，嗜熱鏈球菌菌體OD值在0h至8h增長緩慢，為菌種生長的延遲期。菌種在10h至22h開始大量繁殖，菌體OD值也呈對(duì)數(shù)快速增長，這一階段為對(duì)數(shù)生長期。22h至38h菌種生長代謝穩(wěn)定，菌體OD值一直保持在1.0左右，穩(wěn)定期相對(duì)較長。38h后菌體OD值開始出現(xiàn)了波動(dòng)。

3、嗜酸乳桿菌生長曲線

從圖32的生長曲線可以看出，嗜酸乳桿菌菌體OD值在0h至8h增長緩慢，為菌種生長的延遲期。菌種在10h至20h開始大量繁殖，菌體OD值也呈對(duì)數(shù)快速 增長，這一階段為對(duì)數(shù)生長期。28h至38h菌種生長代謝穩(wěn)定，菌體OD值一直保持在2.0左右，這一階段為菌種生長的穩(wěn)定期。40h后菌體OD值開始逐漸下降，為菌體生長的衰亡期。

4、青春雙歧桿菌生長曲線

如圖33所示，青春雙歧桿菌生長曲線與其它三種乳酸菌菌種的生長曲線不同，菌種的四個(gè)生長周期比較顯著。菌體OD值在0h至5h增長緩慢，此時(shí)菌種不斷適應(yīng)新環(huán)境，因此這一階段為菌種生長的延遲期。菌種在5h至15h大量繁殖，菌體OD值迅猛增長，為對(duì)數(shù)生長期。在15h至22h菌種生長代謝穩(wěn)定，這一階段為菌種生長的穩(wěn)定期。22h后菌體OD值開始逐漸下降，為菌體生長的衰亡期。

5、菌種種子液濃度

根據(jù)測定的菌種生長曲線確定種子培養(yǎng)液的最佳培養(yǎng)時(shí)間。通常選擇對(duì)數(shù)生長期菌株作為發(fā)酵種子液。采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定四種益生菌種子發(fā)酵液對(duì)數(shù)生長期時(shí)的活菌數(shù)，經(jīng)測定四種益生菌菌液活菌數(shù)分別為：保加利亞乳桿菌5.0×10⁸CFU/mL、嗜熱鏈球菌1.2×10⁸CFU/mL、嗜酸乳桿菌4.2×10⁷CFU/mL、青春雙歧桿菌1.7×10⁷CFU/mL。符合發(fā)酵劑菌液濃度要求。

實(shí)施例4、桂圓酵素發(fā)酵工藝

1、菌株接種量及接種比例的確定

設(shè)置菌種比例(嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌＝1:1:1:1)，發(fā)酵底物濃度可溶性固形物含量(Brix)＝10％，將益生菌按照接種量2％、4％、6％、8％、10％、12％(均為v/v)接種到發(fā)酵底物中，37℃條件下靜置發(fā)酵，發(fā)酵7天后測定發(fā)酵液中的胞外多糖、甘露醇、SOD，確定最佳接種量。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用較大的接種量能快速合成產(chǎn)物，但如果接種量過大，也可能使菌種生長過快、營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，而出現(xiàn)菌體早衰，發(fā)酵液黏度增加，發(fā)酵后勁不足，從而影響乳酸產(chǎn)量及功效成分的得率。如果接種量過少，菌體增長緩慢，會(huì)延長發(fā)酵周期，不利于菌株適應(yīng)酶解液高產(chǎn)。

乳酸菌利用發(fā)酵底物中的碳源進(jìn)行發(fā)酵將會(huì)使發(fā)酵液中的還原糖含量減少。由圖6接種量對(duì)殘?zhí)橇康挠绊懣梢钥闯?，接種量從6％增加到10％時(shí)，殘 糖量隨著接種量增加而減少，接種量為10％時(shí)，殘?zhí)橇孔畹停臃N量增加到12％時(shí)，殘?zhí)橇糠炊黾印?/p>

由圖7、圖8接種量對(duì)胞外多糖和SOD的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種量從4％增加到10％，胞外多糖和SOD隨著接種量的增加而增加，接種量在10％時(shí)，胞外多糖和SOD均達(dá)到最大值，接種量繼續(xù)增加到12％時(shí)，胞外多糖和SOD反而減少。

圖9接種量對(duì)甘露醇的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種量為8％時(shí)，甘露醇達(dá)到最大值4.42mg/ml，接種量增加甘露醇含量則減少。以上原因，可能是接種量過大時(shí)，使得菌體在前期生長過快、造成發(fā)酵液黏度增加，菌體早衰，出現(xiàn)發(fā)酵后勁不足，影響了功效成分得率。

因此，發(fā)酵試驗(yàn)的較佳接種量為4-12％；并且，確定8-10％的接種量作為益生菌發(fā)酵桂圓水溶物質(zhì)的最適宜接種量。

2、發(fā)酵液底物濃度

制備不同濃度的發(fā)酵底物(4％、6％、8％、10％、12％(Brix))，將混合菌株(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌＝1:1:1:1)按照10％(v/v)接種量接種到發(fā)酵底物中，37℃條件下靜置發(fā)酵，發(fā)酵7天后測定發(fā)酵液中的胞外多糖、甘露醇、SOD，確定最佳底物濃度。

如圖10，底物濃度對(duì)殘?zhí)橇康挠绊懡Y(jié)果表明，底物濃度在8％至10％之間時(shí)，殘?zhí)橇颗c固形物含量比值較低，說明乳酸菌發(fā)酵快，對(duì)碳源利用率高。

由圖11和圖12可以看出，底物濃度對(duì)胞外多糖和甘露醇含量的影響趨勢相近，底物濃度為8％時(shí)，胞外多糖和甘露醇得率最高。

綜合底物濃度對(duì)殘?zhí)橇考鞍舛嗵呛透事洞嫉挠绊懀_定可溶性固形物含量8-10％作為適宜的底物濃度；最優(yōu)選8％。

3、菌種比例

調(diào)整發(fā)酵底物濃度為10％(Brix)，接種量10％(v/v)，將保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌按照不同菌種比例接種到發(fā)酵底物中。37℃條件下靜置發(fā)酵，發(fā)酵7天后測定發(fā)酵液中的胞外多糖、甘露醇、SOD，確定最佳菌種比例。

結(jié)果如表4。

表4、菌種比例對(duì)益生菌發(fā)酵

由菌種比例對(duì)益生菌發(fā)酵桂圓水溶提取物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)菌種比例(保加利亞乳桿菌∶嗜熱鏈球菌∶嗜酸乳桿菌∶青春雙歧桿菌)在1∶1∶1∶2、2∶2∶1∶1、1∶1∶1∶3時(shí)，功效成分指標(biāo)胞外多糖、甘露醇、超氧化物歧化酶相對(duì)較高。其中，以1∶1∶1∶2效果最為理想。

4、發(fā)酵時(shí)間

設(shè)置菌種比例(嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌＝1:1:1:1)，發(fā)酵底物濃度Brix＝10％(Brix)，將益生菌按照接種量10％(v/v)接種到發(fā)酵底物中，37℃條件下靜置發(fā)酵，考察不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中的胞外多糖、甘露醇、SOD的影響，確定最佳發(fā)酵時(shí)間。

發(fā)酵時(shí)間對(duì)益生菌發(fā)酵桂圓汁的影響如圖13、圖14、圖15和圖16所示，由圖15、圖16可以看出，發(fā)酵時(shí)間從2天增加到8天，胞外多糖、SOD隨著 發(fā)酵時(shí)間增加而增加，發(fā)酵時(shí)間為8天時(shí)，兩指標(biāo)均達(dá)到最大值，相對(duì)應(yīng)殘?zhí)橇窟_(dá)到最低(如圖13)。圖14中，發(fā)酵時(shí)間6天和8天時(shí)，甘露醇含量出現(xiàn)最高值。

因此，發(fā)酵時(shí)間在6天～10天為宜。并且，確定發(fā)酵時(shí)間8天為益生菌發(fā)酵桂圓汁的最適宜發(fā)酵時(shí)間。

5、桂圓水溶提取物最佳發(fā)酵條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過正交試驗(yàn)對(duì)乳酸菌發(fā)酵桂圓水溶提取物條件優(yōu)化后，確定了最佳發(fā)酵工藝條件，以確定的最優(yōu)組合實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考察胞外多糖、甘露醇和SOD，試驗(yàn)組合對(duì)照，從而確定最佳發(fā)酵工藝條件。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)的方法研究益生菌發(fā)酵桂圓汁最佳工藝。選取接種量、發(fā)酵底物、菌種比例和發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，采用L9(3⁴)正交試驗(yàn)表，以胞外多糖、甘露醇、超氧化物歧化酶(SOD)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，見表5。

表5、L₉(3⁴)正交試驗(yàn)表

表6、益生菌發(fā)酵桂圓正交試驗(yàn)結(jié)果

由表6的因素極差值大小看出，以胞外多糖為評(píng)價(jià)指標(biāo)，影響桂圓酵素發(fā)酵工藝的因素主次順序?yàn)椋築發(fā)酵底物濃度>D發(fā)酵時(shí)間>A接種量>C菌種比例。最優(yōu)條件組合是B₃D₂A₂C₁，接種量9％，發(fā)酵底物濃度9％，濃度菌種比例1∶1∶1∶2，發(fā)酵時(shí)間8天。

以甘露醇為評(píng)價(jià)指標(biāo)，影響桂圓酵素發(fā)酵工藝的因素主次順序?yàn)椋築發(fā)酵底物濃度>A接種量>C菌種比例>D發(fā)酵時(shí)間。最優(yōu)條件組合是B₂A₃C₂D₂，接種量10％，發(fā)酵底物濃度8％，濃度菌種比例2∶2∶1∶1，發(fā)酵時(shí)間8天。

以超氧化物歧化酶為評(píng)價(jià)指標(biāo)，影響桂圓酵素發(fā)酵工藝的因素主次順序?yàn)椋篋發(fā)酵時(shí)間>B發(fā)酵底物濃度>A接種量>C菌種比例。最優(yōu)條件組合是D₃B₁A₂C₃，接種量9％，發(fā)酵底物濃度7％，濃度菌種比例1∶1∶1∶3，發(fā)酵時(shí)間9天。

以胞外多糖、甘露醇與超氧化物歧化酶作為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果不同。三個(gè)指標(biāo)中，胞外多糖與甘露醇相對(duì)比較穩(wěn)定，超氧化物歧化酶熱穩(wěn)定性差。本產(chǎn)品的功效成分確定為胞外多糖為主，最佳實(shí)驗(yàn)條件確定以胞外多糖為指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果，即接種量9％，發(fā)酵底物濃度9％，濃度菌種比例1∶1∶1∶2，發(fā)酵時(shí)間8天，在此條件下制備桂圓酵素發(fā)酵液中胞外多糖含量1.1086mg/mL。

6、發(fā)酵液過濾、純化

發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液經(jīng)85℃殺菌10min，200目篩網(wǎng)初濾，4800rpm/min離心20min，再經(jīng)30～50微米過濾，即得桂圓酵素發(fā)酵原液。

實(shí)施例5、桂圓酵素產(chǎn)品的制備

桂圓酵素產(chǎn)品的制備流程如圖2。

1、調(diào)配

在酵素原液中添加適當(dāng)比例的益生元(低聚異麥芽糖或低聚木糖等)、維生素等營養(yǎng)強(qiáng)化劑。添加量如表7所示。

表7

2、均質(zhì)

將調(diào)配后的桂圓酵素產(chǎn)品在65℃，25Mpa條件下進(jìn)行均質(zhì)。

3、灌裝、殺菌

經(jīng)65℃殺菌30min后，熱灌裝即得桂圓酵素成品。

4、桂圓酵素產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)

感官指標(biāo)如表8。

表8

功效成分：

多糖含量≥800mg/L；

益生元(低聚異麥芽糖)≥2.8g/100mL。

理化指標(biāo)：

總固形物含量：≥10％；

pH值：3.6～4.2。

微生物指標(biāo)：

菌落總數(shù)cfu/mL＜100

大腸菌群，MPN/100mL＜3

致病菌未檢出。

實(shí)施例6、桂圓酵素抗氧化性能研究

1、DPPH自由基清除能力

40μL桂圓酵素原液樣品加入到4mL 0.1mmol/L DPPH-甲醇溶液中，再加入450L 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(7.4)，25℃下恒溫水浴30min。以去離子水為參比溶液。在517nm下測定吸光度。

DPPH自由基清除能力(％)＝[(A0-(A1-A2)/A0]×100％ 式(1)

式(1)中：A0為空白對(duì)照液的吸光度；A1為樣品測定管的吸光度；A2為樣品本底管的吸光度。

桂圓酵素中含有胞外多糖、甘露醇、活性酶類及多酚、維生素等成分，因此具有抗氧化能力。如圖17，桂圓酵素DPPH自由基清除能力隨著桂圓酵素濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)桂圓酵素濃度從可溶性固形物含量Brix 2％增加到Brix16％時(shí)，DPPH自由基清除能力增加迅速，桂圓酵素濃度達(dá)到16％以后，DPPH自由基清除能力增加趨于穩(wěn)定。原因可能是當(dāng)桂圓酵素濃度增加到一定程度，桂圓酵素中清除自由基的成分與自由基反應(yīng)速度減慢。

2、羥基自由基清除能力

135μL桂圓酵素原液樣品加入到1.4mL 6mmol/L H₂O₂，然后加入0.6mL20mmol/L水楊酸鈉和2mL 1.5mmol/L硫酸亞鐵，37℃下恒溫水浴1h。以去離子水為參比溶液。在562nm下測定吸光度。羥基自由基清除能力計(jì)算按照式(1)。

桂圓酵素羥基自由基清除能力如圖18所示，當(dāng)桂圓酵素Brix量從2％增加到14％時(shí)，羥基自由基清除能力增加迅速，濃度達(dá)到14％以后，羥自由基清除能力增加緩慢，趨于穩(wěn)定。

3、超氧陰離子自由基清除能力測定

取0.05mol/L pH8.2的Tris·HCI緩沖液4.5ml，置于25℃水浴中預(yù)熱20min， 分別加入1ml不同濃度的桂圓酵素原液和0.4ml 25mmol/L的鄰苯三酚溶液，混勻后于25℃水浴中反應(yīng)5min，加入8mol/L HCl1.0ml終止反應(yīng)，以Tris-HCI緩沖液作參比，在299nm處測定吸光度，計(jì)算清除率。空白對(duì)照組以1ml試樣溶劑代替樣品.每個(gè)處理均做三個(gè)重復(fù)。清除率的計(jì)算公式：超氧陰離子自由基清除率(％)＝100％(A1-A2)/A1，其中A1為空白的平均吸光度，A2為試樣的平均吸光度。

鄰苯三酚自氧化法測桂圓酵素超氧陰離子自由基清除能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)桂圓酵素濃度在10％至20％范圍內(nèi)，Brix為16％時(shí)，超氧陰離子自由基清除能力最強(qiáng)(圖19)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桂圓酵素原液具有DPPH自由基、羥自由基清除能力，超氧陰離子自由基清除能力，因此具有高的抗氧化性能。

實(shí)施例7、紅棗酵素及相應(yīng)保健食品的制備

1、紅棗酵素制備工藝

實(shí)驗(yàn)原料：紅棗、純凈水。

酶制劑：纖維素酶、果膠酶，諾維信生物(中國)投資有限公司提供。

實(shí)驗(yàn)菌種：保加利亞乳桿菌6098、嗜熱鏈球菌6219、嗜酸乳桿菌6085、青春雙歧桿菌6176，均由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)提供，培養(yǎng)溫度均為37℃。

主要培養(yǎng)基：同桂圓酵素中所用。

主要試劑：同桂圓酵素中所用。

主要儀器設(shè)備：膜過濾時(shí)，采用0.4μm濾膜，Masterflex L/S Easy-Load螺動(dòng)泵(美國Millipore公司)；其它同桂圓酵素中所用。

鑒定分析方法：同桂圓酵素中所用。

紅棗酵素原液制備工藝流程圖如圖20。主要流程如下：

(1)紅棗水提液的制備

紅棗去核后稱重，按料水比1:10加水，90℃浸泡30min后，用高速組織搗碎機(jī)進(jìn)行打漿，將纖維素酶和果膠酶按照1:1的比例添加進(jìn)行酶解，酶總的添加量800U/g，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間120min，酶解結(jié)束后90℃滅酶10min，酶解液經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾，即得紅棗水提液，調(diào)整可溶性固形物含量至10％。

(2)殺菌

紅棗水提液經(jīng)85℃殺菌15min，作為發(fā)酵底物。

(3)益生菌發(fā)酵紅棗水提液

采用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌對(duì)紅棗水提液進(jìn)行接種發(fā)酵，發(fā)酵底物濃度10％，保加利亞乳桿菌:嗜熱鏈球菌:嗜酸乳桿菌:青春雙歧桿菌為1∶1∶1∶2(v/v)，接種量9％(v/v)，發(fā)酵時(shí)間8天。

分析紅棗酵素胞外多糖、甘露醇、超氧化物歧化酶SOD等功效成分含量。

(4)發(fā)酵液過濾、純化

發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液經(jīng)4800rpm/min離心20min，取上清液在0.20Mpa壓力下經(jīng)0.4μm膜除菌過濾，即得紅棗酵素原液。

2、紅棗酵素原液評(píng)價(jià)結(jié)果

(1)功效成分分析

功效成分分析結(jié)果如表9。

表9

(2)感官評(píng)價(jià)

紅棗酵素原液呈深紅色，無懸浮物；具有紅棗的香氣；口感濃郁，酸甜爽口，具有紅棗發(fā)酵液特有的滋味。

3、應(yīng)用紅棗酵素原液制備保健食品

應(yīng)用紅棗酵素制備保健食品的工藝流程如圖21所示。包括如下：

(1)調(diào)配

將紅棗酵素原液適當(dāng)濃縮后，添加適當(dāng)比例的益生元(低聚異麥芽糖或低聚木糖)及維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)強(qiáng)化劑制備紅棗酵素保健食品，配方如表10所示。

表10、紅棗酵素保健食品配方

(2)均質(zhì)

將調(diào)配后的紅棗酵素產(chǎn)品在55℃，25Mpa條件下進(jìn)行均質(zhì)。

(3)除菌、灌裝

均質(zhì)后在0.20Mpa壓力下經(jīng)0.4μm膜除菌過濾，無菌灌裝即得紅棗酵素保健食品。

獲得的紅棗酵素保健食品：呈深紅色液體，無懸浮物；具有紅棗特有香氣，無異味；酸甜爽口，口感濃郁，具有紅棗酵素特有的滋味。其多糖含量≥100mg/100mL；益生元(低聚異麥芽糖)≥2.8g/100mL；超氧化物歧化酶≥500U/100mL；總可溶性固形物含量：≥10％；pH值：3.6～4.2；微生物菌落總數(shù)cfu/mL＜100；大腸菌群MPN/100mL＜3；無致病菌檢出。

實(shí)施例8、木瓜酵素及相應(yīng)保健食品的制備

1、木瓜酵素制備工藝

實(shí)驗(yàn)原料：木瓜、純凈水。

實(shí)驗(yàn)菌種：同桂圓酵素中所用。

主要培養(yǎng)基：同桂圓酵素中所用。

主要試劑：同桂圓酵素中所用。

主要儀器設(shè)備：膜過濾采用0.4μm濾膜，Masterflex L/S Easy-Load螺動(dòng)泵(美國Millipore公司)；其它同桂圓酵素中所用。

鑒定分析方法：同桂圓酵素中所用。

木瓜酵素原液制備工藝流程如圖22。主要流程如下：

(1)木瓜汁的制備

將木瓜洗凈，去皮去瓤后切塊、稱重，榨汁后100目篩網(wǎng)過濾即得木瓜汁。

(2)殺菌

木瓜汁經(jīng)85℃殺菌15min，作為發(fā)酵底物。

(3)益生菌發(fā)酵木瓜汁

采用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌對(duì)木瓜汁進(jìn)行接種發(fā)酵，發(fā)酵底物濃度10％(Brix)，保加利亞乳桿菌:嗜熱鏈球菌:嗜酸乳桿菌:青春雙歧桿菌為1∶1∶1∶2(v/v)，接種量9％(v/v)，發(fā)酵時(shí)間8天。分析木瓜酵素胞外多糖、甘露醇、超氧化物歧化酶SOD等功效成分含量。

(4)發(fā)酵液過濾、純化

發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液經(jīng)4800rpm/min離心20min，取上清液在0.20Mpa壓力下經(jīng)0.4μm膜除菌過濾，即得木瓜酵素原液。

2、木瓜酵素原液功效成分

(1)功效成分分析

功效成分分析結(jié)果如表11。

表11

(2)感官評(píng)價(jià)

木瓜酵素原液呈橘紅色，具有木瓜特有的香氣，口感酸甜爽口，具有木瓜酵素發(fā)酵液特有的滋味。

3、應(yīng)用木瓜酵素制備保健食品

應(yīng)用木瓜酵素制備保健食品的工藝流程如圖23所示。包括如下：

(1)調(diào)配

將木瓜酵素原液適當(dāng)濃縮后，添加適當(dāng)比例的益生元(低聚異麥芽糖或低聚 木糖)及維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)強(qiáng)化劑制備木瓜酵素保健食品，配方如表12所示。

表12、木瓜酵素保健食品配方

(2)均質(zhì)

將調(diào)配后的木瓜酵素產(chǎn)品在55℃，25Mpa條件下進(jìn)行均質(zhì)。

(3)除菌、灌裝

0.20Mpa壓力下經(jīng)0.4μm膜除菌過濾，無菌灌裝即得木瓜酵素保健食品。

獲得的木瓜酵素保健食品：呈橘紅色液體，無懸浮物；具有木瓜特有香氣，無異味；酸甜爽口，口感濃郁，具有木瓜酵素特有的滋味。其多糖含量≥100mg/100mL；益生元(低聚異麥芽糖)≥2.8g/100mL；超氧化物歧化酶≥2000U/100mL；總固形物含量：≥10％；pH值：3.6～4.2。微生物菌落總數(shù)cfu/mL＜100，大腸菌群MPN/100mL＜3；無致病菌檢出。

實(shí)施例9、混合果蔬酵素

1、混合果蔬酵素制備工藝

實(shí)驗(yàn)原料：蘋果、梨、甜橙、葡萄、柚子、西瓜、鮮桂圓、荔枝、火龍果、櫻桃、獼猴桃、草莓、木瓜、檸檬、胡蘿卜、黃瓜、番茄。

實(shí)驗(yàn)菌種：同桂圓酵素中所用。

主要培養(yǎng)基：同桂圓酵素中所用。

主要試劑：同桂圓酵素中所用。

主要儀器設(shè)備：膜過濾采用0.4μm濾膜，Masterflex L/S Easy-Load螺動(dòng)泵 (美國Millipore公司)，10ND FREEZE DRYER，2XZ-2型懸片式真空泵，S22-2恒溫磁力攪拌器；其它同桂圓酵素中所用。

鑒定分析方法：同桂圓酵素中所用。

混合果蔬酵素原液制備工藝流程如圖24。主要流程如下：

(1)混合果蔬汁的制備

將蘋果、梨、甜橙、葡萄、柚子、西瓜、鮮桂圓、荔枝、火龍果、櫻桃、獼猴桃、草莓、木瓜、檸檬、胡蘿卜、黃瓜、番茄等果蔬原料，洗凈、去核或去皮、切塊，等重量稱取，榨汁后100目篩網(wǎng)過濾后取得混合果蔬汁。

(2)殺菌

混合果蔬汁經(jīng)85℃殺菌15min，作為發(fā)酵底物。

(3)益生菌接種發(fā)酵

采用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌對(duì)混合果蔬汁進(jìn)行接種發(fā)酵，發(fā)酵底物濃度9％(Brix)，保加利亞乳桿菌:嗜熱鏈球菌:嗜酸乳桿菌:青春雙歧桿菌為1∶1∶1∶2(v/v)，接種量9％(v/v)，發(fā)酵8天即得混合果蔬酵素原液。

2、混合果蔬酵素原液功效成分

(1)功效成分分析

功效成分分析結(jié)果如表13。

表13

(2)感官評(píng)價(jià)

混合果蔬酵素原液呈淡紅色，具有混合果蔬特有的香氣，口感酸甜爽口，具有果蔬酵素發(fā)酵液特有的滋味。

3、混合果蔬酵素應(yīng)用實(shí)例

應(yīng)用混合果蔬酵素制備保健食品的工藝流程如圖25所示。包括如下：

(1)調(diào)配

將益生元(低聚異麥芽糖或低聚木糖)、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)強(qiáng)化劑及麥芽糊精、β-環(huán)狀糊精、蔗糖酯等輔料經(jīng)輻照殺菌后，在無菌條件下添加到混合果蔬酵素原液中，配方如表14所示。所有原料混合后密封，經(jīng)磁力攪拌裝置攪拌30min至料液均勻。

表14、混合果蔬酵素保健食品配方

(2)冷凍干燥

將調(diào)配后的混合果蔬酵素在-40℃條件下冷凍干燥48hrs，得混合果蔬酵素粉。

(3)包裝

在溫度20-26℃，濕度＜70％的無菌環(huán)境下，將混合果蔬酵素粉進(jìn)行無菌分裝，即得果蔬酵素粉保健食品。

獲得的果蔬酵素粉保健食品(含益生菌)：呈淡紅色粉末；具有混合果蔬特有香氣，無異味；溫水沖飲酸甜爽口，具有果蔬酵素特有的滋味。其多糖含量≥50mg/100mg；益生元(低聚異麥芽糖)≥2.8g/100mg；超氧化物歧化酶≥500U/100mg；益生菌總數(shù)cfu/g＞10⁶；大腸菌群MPN/100mg＜3；無致病菌檢 出。

實(shí)施例10、燕麥酵素

1、燕麥酵素原液制備工藝

實(shí)驗(yàn)原料：燕麥、純凈水。

實(shí)驗(yàn)菌種：同桂圓酵素中所用。

主要培養(yǎng)基：同桂圓酵素中所用。

主要試劑：同桂圓酵素中所用。

主要儀器設(shè)備：同桂圓酵素中所用。

鑒定分析方法：同桂圓酵素中所用。

燕麥酵素原液制備工藝流程如圖26。主要流程如下：

(1)燕麥漿的制備

取燕麥500g，加入5L純凈水溶解得燕麥漿。

(2)蒸煮

燕麥漿經(jīng)121℃蒸煮15min后冷卻，作為發(fā)酵底物。

(3)益生菌發(fā)酵

采用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌對(duì)燕麥漿進(jìn)行接種發(fā)酵，發(fā)酵底物濃度10％，保加利亞乳桿菌:嗜熱鏈球菌:嗜酸乳桿菌:青春雙歧桿菌比例為1∶1∶1∶2(v/v)，接種量9％(v/v)，發(fā)酵時(shí)間8天。分析燕麥酵素胞外多糖、甘露醇、超氧化物歧化酶SOD等功效成分含量。

(4)發(fā)酵液過濾、純化

發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液經(jīng)85℃殺菌10min，4800rpm/min離心20min后經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾即得燕麥酵素發(fā)酵原液。

2、燕麥酵素原液功效成分分析

(1)功效成分分析

功效成分分析結(jié)果如表15。

表15

(2)感官評(píng)價(jià)

燕麥酵素原液呈乳白色，具有谷物特有的香氣，口感酸甜爽口，具有谷物發(fā)酵液特有的滋味。

3、燕麥酵素應(yīng)用實(shí)例

應(yīng)用燕麥酵素制備保健食品的工藝流程如圖27所示。

(1)調(diào)配

將燕麥酵素原液適當(dāng)濃縮后，添加適當(dāng)比例的益生元(低聚異麥芽糖或低聚木糖)及維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)強(qiáng)化劑制備燕麥酵素保健食品，配方如表16所示。

表16、燕麥酵素保健食品配方

2、均質(zhì)

將調(diào)配后的燕麥酵素產(chǎn)品在65℃，25Mpa條件下進(jìn)行均質(zhì)。

3、灌裝、殺菌

經(jīng)65℃殺菌30min后，熱灌裝即得

燕麥酵素保健食品。

獲得的燕麥酵素保健食品：呈乳白色液體；具有谷物發(fā)酵特有香氣，無異 味；酸甜爽口，口感濃郁，具有谷物酵素特有滋味。其多糖含量≥30mg/100mL；益生元(低聚異麥芽糖)≥2.8g/100mL；總固形物含量≥10％；pH值：3.6～4.2；微生物菌落總數(shù)cfu/mL＜100；大腸菌群MPN/100mL＜3；致病菌無檢出。

實(shí)施例11、青稞酵素

1、青稞酵素原液制備工藝

實(shí)驗(yàn)原料：青稞、蜂蜜、純凈水。

實(shí)驗(yàn)菌種：同桂圓酵素中所用。

主要培養(yǎng)基：同桂圓酵素中所用。

主要試劑：同桂圓酵素中所用。

主要儀器設(shè)備：同桂圓酵素中所用。

鑒定分析方法：同桂圓酵素中所用。

青稞酵素原液制備工藝流程如圖28。主要流程如下：

(1)青稞發(fā)酵底物的制備

取1kg青稞原料，加入2L純凈水浸泡，使淀粉吸水膨脹，易于糊化。浸泡12hrs后，倒出剩余的水。再加入1L純凈水、攪勻后放入滅菌鍋中蒸煮(溫度為121℃，時(shí)間40min)，蒸煮后再補(bǔ)充2L水分。按照0.32kg/tonnes的添加量加入液化酶Clearflow AA，于95℃的恒溫水浴鍋中放置2hrs。液化結(jié)束，調(diào)節(jié)PH值4.4-4.8，結(jié)束酶解。液化后，待溫度降到60℃以下時(shí)按照0.80kg/tonnes添加量加入糖化酶OPTIMAX4060DHP，于60℃恒溫水浴中放置24hrs；糖化24hrs后，90℃水浴中滅酶10min，即得青稞酶解液。

(2)殺菌

在青稞酶解液中添加5％(v/v)的蜂蜜，經(jīng)85℃殺菌15min，作為發(fā)酵底物。

(3)接種益生菌發(fā)酵

采用保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌對(duì)青稞發(fā)酵底物進(jìn)行接種發(fā)酵，發(fā)酵底物濃度6％，保加利亞乳桿菌:嗜熱鏈球菌:嗜酸乳桿菌:青春雙歧桿菌比例為1∶1∶1∶2(v/v)，接種量9％(v/v)，發(fā)酵時(shí)間8天。分析青稞酵素胞外多糖、甘露醇、超氧化物歧化酶SOD等功效成分含量。

(4)發(fā)酵液過濾、純化

發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液經(jīng)85℃殺菌10min，4800rpm/min離心20min后經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾即得青稞酵素原液。

2、青稞酵素原液功效成分分析

(1)功效成分分析

功效成分分析結(jié)果如表17。

表17

(2)感官評(píng)價(jià)

青稞酵素原液呈淡黃色，具有谷物特有的香氣，口感酸甜，具有谷物發(fā)酵液特有的滋味。

3、應(yīng)用青稞酵素制備保健食品

應(yīng)用青稞酵素原液制備保健食品的工藝流程如圖29所示。

(1)調(diào)配

將青稞酵素原液適當(dāng)濃縮后，添加適當(dāng)比例的益生元(低聚異麥芽糖或低聚木糖)及維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)強(qiáng)化劑制備青稞酵素保健食品，配方如表18所示。

表18、青稞酵素保健食品配方

2、均質(zhì)

將調(diào)配后的青稞酵素產(chǎn)品在65℃，25Mpa條件下進(jìn)行均質(zhì)。

3、灌裝、殺菌

經(jīng)65℃殺菌30min后，熱灌裝即得青稞酵素保健食品。

獲得的青稞酵素保健食品：呈淡黃色液體；具有谷物發(fā)酵特有香氣，無異味；酸甜爽口，口感濃郁，具有谷物酵素特有滋味。其多糖含量≥100mg/100mL；益生元(低聚異麥芽糖)≥3.0g/100mL；總固形物含量≥10％；pH值：3.6～4.2；微生物菌落總數(shù)cfu/mL＜100；大腸菌群MPN/100mL＜3；致病菌未檢出。

實(shí)施例12、酵素保質(zhì)期實(shí)驗(yàn)(以桂圓酵素為例)

保健食品穩(wěn)定性試驗(yàn)是指保健食品通過一定程序和方法的試驗(yàn)，考察產(chǎn)品的感官、化學(xué)、物理及生物學(xué)的變化情況。根據(jù)產(chǎn)品特性不同，穩(wěn)定性試驗(yàn)可分為加速試驗(yàn)、長期試驗(yàn)和短期試驗(yàn)。加速試驗(yàn)一般考察時(shí)間為三個(gè)月，即對(duì)放置0月、1月、2月、3月樣品進(jìn)行考察。0月數(shù)據(jù)可以用同批次產(chǎn)品衛(wèi)生學(xué)試驗(yàn)結(jié)果代替。加速試驗(yàn)應(yīng)置于溫度37±2℃、相對(duì)濕度RH75±5％、避免光線直射的條件下貯存三個(gè)月，近似相當(dāng)于產(chǎn)品常溫下保質(zhì)期2年。為此，將桂圓酵素成品放置于37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行保質(zhì)期實(shí)驗(yàn)三個(gè)月，每個(gè)月對(duì)微生物指標(biāo)、功效成分進(jìn)行分析，同時(shí)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表19所示。

表19、桂圓酵素保健飲料保質(zhì)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果

桂圓酵素保質(zhì)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在加速試驗(yàn)期內(nèi)，產(chǎn)品衛(wèi)生微生物指標(biāo)符合食品衛(wèi)生要求，功效成分幾乎沒有損失，產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)結(jié)果良好，根據(jù)加速試驗(yàn)結(jié)果，保質(zhì)期為2年。

實(shí)施例13、酵素安全性毒理學(xué)檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)《保健食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序與檢驗(yàn)方法規(guī)范》(衛(wèi)生部2003年版)開展酵素產(chǎn)品的第一階段及第二階段的安全性毒理學(xué)檢測，桂圓酵素的安全性毒理學(xué)檢測結(jié)果。如表20所示，急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果無毒；骨髓細(xì)胞微核實(shí)驗(yàn)、小鼠精子畸形試驗(yàn)和30天喂養(yǎng)試驗(yàn)均為陰性。毒理學(xué)檢測結(jié)果為酵素產(chǎn)品食用安全性提供依據(jù)。

表20、桂圓酵素安全性毒理學(xué)檢測結(jié)果

應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。