本發(fā)明涉及飼料添加劑領(lǐng)域，尤其涉及一種飼料霉菌毒素吸附劑的制備方法。

背景技術(shù)：

霉菌毒素中毒能引起動物生長發(fā)育遲緩，免疫力下降，器官機(jī)能障礙；導(dǎo)致人畜急慢性中毒死亡；此外，霉菌毒素對動物有致畸、致癌、致突變的影響，對養(yǎng)殖業(yè)和人類健康造成了巨大威脅，因此霉菌毒素的脫毒勢在必行。目前，酯化葡甘露聚糖作為霉菌毒素吸附劑的應(yīng)用越來越廣泛，市場上使用的酯化葡甘露聚糖是從酵母培養(yǎng)物細(xì)胞壁中提取的甘露聚糖基礎(chǔ)上，經(jīng)酯化改性合成的霉菌毒素吸附劑-霉可吸，因其安全無毒，吸附霉菌毒素能力強(qiáng)，吸附范圍廣，因此是一種廣泛應(yīng)用的霉菌毒素解毒劑；

魔芋葡甘聚糖主要來源于草本植物魔芋的提取物，屬于水溶性離子型天然聚多糖，對高血壓、糖尿病、肥胖癥、便秘等有很好的預(yù)防和治療作用，并有一定的抗癌效果，因而被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工、紡織、環(huán)保、高分子材料等領(lǐng)域，但是將來源于魔芋的葡甘露聚糖進(jìn)行酯化并作為飼料霉菌毒素吸附劑方面應(yīng)用的還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種飼料霉菌毒素吸附劑-酯化魔芋葡甘露聚糖的制備方法，利用植物源葡甘露聚糖制備酯化魔芋葡甘露聚糖，并研究該酯化魔芋葡甘露聚糖對多種飼料霉菌毒素的吸附能力；

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供一種飼料霉菌毒素吸附劑的制備方法，應(yīng)用六偏磷酸鈉對魔芋精粉中的魔芋葡甘露聚糖進(jìn)行酯化改性合成酯化魔芋葡甘露聚糖，具體步驟如下：

a）不同六偏磷酸鈉與魔芋葡甘露聚糖的質(zhì)量比對酯化魔芋葡甘露聚糖合成的影響

將1g六偏磷酸鈉溶于等質(zhì)量的蒸餾水中，分別按照六偏磷酸鈉與魔芋精粉中的魔芋葡甘露聚糖的質(zhì)量比為1:6、1:6.5、1:7、1:7.5、1:8稱取魔芋葡甘露聚糖加入六偏磷酸鈉溶液中，充分?jǐn)嚢杌靹?，每組設(shè)置三個重復(fù)。在不同溫度、不同ph和不同反應(yīng)時(shí)間條件下反應(yīng)。反應(yīng)完成后，產(chǎn)物用60%乙醇洗滌3遍，后用無水乙醇洗滌脫水一遍。60℃干燥24h后用星式球磨儀磨碎，用鉬黃比色法檢測產(chǎn)物中磷的含量；

b）不同ph值對酯化魔芋葡甘露聚糖合成的影響

方法同a），六偏磷酸鈉與魔芋葡甘露聚糖的質(zhì)量比為1:7，用鹽酸調(diào)整各組ph值至2.0、2.5、3.0、3.5、4.0；

c）不同反應(yīng)溫度對酯化魔芋葡甘露聚糖合成的影響

方法同a），六偏磷酸鈉與魔芋葡甘露聚糖的質(zhì)量比為1:7，用鹽酸調(diào)ph值為3.0，反應(yīng)溫度為50、55、60、65、70、80℃；

d）不同反應(yīng)時(shí)間對酯化魔芋葡甘露聚糖合成的影響

方法同a），六偏磷酸鈉與魔芋葡甘露聚糖的質(zhì)量比為1:7。用鹽酸調(diào)ph值為3.0，于60℃分別反應(yīng)60、80、100、120、140min；

e）正交試驗(yàn)

選擇a）-d）法每個單因素水平試驗(yàn)適宜參數(shù)附近的三個水平，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)l9(3⁴)，按此條件制備的酯化魔芋葡甘露聚糖經(jīng)60%乙醇洗滌3遍，用無水乙醇洗滌脫水一遍后，60℃干燥24h，用星式球磨儀磨碎，用鉬黃比色法檢測產(chǎn)物中磷的含量；

f）酯化魔芋葡甘露聚糖最佳洗滌次數(shù)的確定

將按照e）正交試驗(yàn)得到的最佳合成條件制備酯化魔芋葡甘露聚糖，與60%的乙醇的質(zhì)量比為1:5加入60%的乙醇洗滌產(chǎn)物，用鉬黃比色法檢測洗滌液中磷的含量；

根據(jù)本方法的優(yōu)選實(shí)施方式，六偏磷酸鈉酯化合成酯化魔芋葡甘露聚糖的條件是六偏磷酸鈉與魔芋葡甘露聚糖質(zhì)量比1:6.5、ph值3.0、反應(yīng)溫度75℃、反應(yīng)時(shí)間130min，洗滌7次；

本發(fā)明的另一目的是對利用六偏磷酸鈉法制備的酯化魔芋葡甘露聚糖進(jìn)行表征，推斷其化學(xué)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如下：

采用凝膠色譜法對酯化魔芋葡甘露聚糖分子量做了相關(guān)研究，結(jié)果表明：酯化魔芋葡甘露聚糖分子量為1.78×10⁶；

采用pmp柱前衍生化hplc法分析酯化魔芋葡甘露聚糖單糖組分，結(jié)果表明：d-甘露糖:d-葡萄糖為1.91:1；

采用紅外光譜法和固體nmr法研究酯化魔芋葡甘露聚糖，結(jié)果表明：在酯化魔芋葡甘露聚糖的c6、c3、c2位都發(fā)生了酯化反應(yīng)，結(jié)合上了po3-和（po3-）6，結(jié)合程度c6>c3>c2；

本發(fā)明的有益效果是：將來源于魔芋的葡甘露聚糖制備成酯化魔芋葡甘露聚糖，其制作方法簡單，便于操作，可以應(yīng)用于規(guī)模化生產(chǎn)，具有良好的社會經(jīng)濟(jì)效益；酯化魔芋葡甘露聚糖吸附霉菌毒素的效果，優(yōu)于目前常用的吸附劑霉可吸，這對植物源酯化魔芋葡甘露聚糖在飼料添加劑中的應(yīng)用具有非常重要的意義；

本發(fā)明提供一種酯化魔芋葡甘露聚糖的用途，將六偏磷酸鈉法制備合成的酯化魔芋葡甘露聚糖用于飼料霉菌毒素添加劑，吸附黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏馬菌素b1，技術(shù)方案如下：

1）酯化魔芋葡甘露聚糖對黃曲霉毒素體外吸附能力的測定

稱取由六偏磷酸鈉法制備合成的酯化魔芋葡甘露聚糖、霉可吸、魔芋葡甘露聚糖0.1g，溶于50ml濃度為1mg/l的黃曲霉毒素溶液中，并設(shè)50ml濃度為1mg/l的黃曲霉毒素溶液為對照組，充分混勻后，在溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為300r/m的搖床中反應(yīng)8h。反應(yīng)結(jié)束后，各組3000r/m離心10min，取上清液稀釋后，按照霉菌毒素酶聯(lián)免疫試劑盒的說明檢測黃曲霉毒素的含量；

2）酯化魔芋葡甘露聚糖對嘔吐毒素體外吸附能力的測定

方法同1），對照組溶液是50ml濃度為1mg/l的嘔吐毒素溶液；

3）酯化魔芋葡甘露聚糖對玉米赤霉烯酮體外吸附能力的測定

方法同1），對照組溶液是50ml濃度為1mg/l的玉米赤霉烯酮溶液；

4）酯化魔芋葡甘露聚糖對伏馬菌素b1體外吸附能力的測定

方法同1），對照組溶液是50ml濃度為1mg/l的伏馬菌素b1溶液；

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，六偏磷酸鈉法制備合成的酯化魔芋葡甘露聚糖吸附霉菌毒素的效果優(yōu)于霉可吸和魔芋葡甘露聚糖，是一種優(yōu)良的霉菌毒素吸附劑；

附圖說明；

圖1酯化魔芋葡甘露聚糖的紅外光譜圖

圖2魔芋葡甘露聚糖的紅外光譜圖

圖3魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖凝膠色譜圖

圖4魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖水解液hplc圖譜

圖5魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖的cp/mas¹³cnmr波譜

圖6魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖的cp/mas³¹pnmr波譜

具體實(shí)施方式；

通過下列實(shí)施例將能更好的理解本發(fā)明；

實(shí)施例1：將六偏磷酸鈉溶于等質(zhì)量的蒸餾水中，按照六偏磷酸鈉與魔芋精粉中的魔芋葡甘露聚糖的質(zhì)量比為1:6.5稱取魔芋葡甘露聚糖加入六偏磷酸鈉溶液中，充分?jǐn)嚢杌靹颍趐h值3.0，反應(yīng)溫度75℃的情況下反應(yīng)130min后，產(chǎn)物用60%乙醇洗滌3遍，再用無水乙醇洗滌脫水一遍，60℃干燥24h后用星式球磨儀磨碎，然后與60%的乙醇的質(zhì)量比為1:5加入60%的乙醇洗滌產(chǎn)物洗滌7次，制得酯化魔芋葡甘露聚糖；

實(shí)施例2：對利用六偏磷酸鈉法制備的酯化魔芋葡甘露聚糖進(jìn)行表征，推斷其化學(xué)結(jié)構(gòu)。步驟如下：

步驟一、ir圖譜測試

樣品烘干，采用樣品與溴化鉀壓片的方法，應(yīng)用ft-tr光譜儀，在400~4000cm^-1區(qū)間掃描，測得魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖的紅外光譜；

步驟二、凝膠色譜條件

watersultrahydrogellinear水溶性凝膠色譜柱（300mm×7.8mm），流動相為水，流量為1ml/min，增益為1db，漂移管溫度為80℃，噴霧器溫度為30℃，氮?dú)鈮毫?0psi，進(jìn)樣量20μl。將葡聚糖加流動相配制成1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后經(jīng)0.22μm水相濾膜過濾后20μl進(jìn)樣。將魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖用流動相配成0.3%的溶液，后經(jīng)0.22μm水相濾膜過濾后進(jìn)行凝膠色譜分析；

步驟三、pmp柱前衍生化法分析單糖組成

hplc色譜條件

c18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為磷酸鹽緩沖溶液（25mmol/l，ph6.7）-乙腈（85:15）；梯度模式：時(shí)間梯度0min、15min、40min；相應(yīng)的濃度梯度為15%、20%、30%；流速1ml/min；柱溫25℃；檢測波長245nm；進(jìn)樣量20μl；

魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖的水解

分別稱取魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖各180.0mg于具賽試管中，加石油醚脫脂，用850ml/l的乙醇去游離還原糖，自然揮發(fā)干燥后加雙蒸水60ml，在kq600b型超聲波清洗器上超聲60min，溫度為35~45℃，再用雙蒸水定容至100ml，3500r/min，離心10min，吸取上清液即為多糖提取液。取1:450稀釋的多糖提取液100μl于安瓶中，再加入50μl濃度為2.5mol/l的h2s04，封管后在110℃烘箱中水解2.5h，取出冷卻后加50μl濃度為5mol/l的naoh中和即得多糖水解液；

單糖標(biāo)準(zhǔn)液的衍生化

分別精密稱取9mg鼠李糖、9mg葡萄糖、9mg半乳糖、9mg甘露糖、7.5mg阿拉伯糖、7.5mg木糖于25ml容量瓶中，用去離子水溶解并定容。分別精確吸取50μl標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液，依次加入0.5mol/l的pmp甲醇溶液50μl及0.3mol/l的naoh50μl渦旋混合30s，70℃水浴下反應(yīng)30min。冷卻至室溫，加入0.3mol/l的hcl50μl進(jìn)行中和，再加入1ml氯仿，渦旋混合30s，震蕩離心，用細(xì)針頭吸棄下層有機(jī)相，如此重復(fù)3次，上層液加100μl水稀釋混勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，20μl進(jìn)樣；

樣品的衍生化

分別吸取100μl魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖的多糖水解液，按單糖標(biāo)準(zhǔn)液的衍生化的方法進(jìn)行衍生化，20μl進(jìn)樣；

步驟四、固體nmr條件

cp/mas13cnmr的波譜分析條件參數(shù)

測試條件：魔角自旋速度3.8mhz；觀測頻率¹³c10040mhz；采集數(shù)據(jù)點(diǎn)8192，掃描累積696次；內(nèi)參考物：六甲基苯；分辨率4.88hz；采用四脈沖序列：ps15.00μs，ps22000.00μs，ps35.00μs，ps4500.00μs；脈沖間隔：pi110.0000ms，pi210.0000ms，pi41.0000ms；脈沖推遲時(shí)間（pd）：12.00s。用去離子水使試樣含水率為25％；

cp/mas³¹pnmr的波譜分析條件參數(shù)

測試條件：³¹p的共振頻率162.0mhz，魔角自旋速度為5.0khz，化學(xué)位移參比樣品為ω=0.85的h3po4；

所得結(jié)果如下：

ir圖譜結(jié)果

魔芋葡甘露聚糖的紅外光譜圖見附圖2，酯化魔芋葡甘露聚糖的紅外光譜圖見附圖1，兩者的紅外光譜圖之間顯示了明顯的差異。對比兩圖可知，由于在酯化魔芋葡甘露聚糖上發(fā)生了磷酸酯化反應(yīng)，酯化魔芋葡甘露聚糖在1020.16cm^-1、1089.58cm^-1和1270.86cm^-1等處出現(xiàn)了新的吸收峰，即1000~1160cm^-1指紋區(qū)p-o-c振動光譜峰形發(fā)生了改變，說明酯化魔芋葡甘露聚糖上結(jié)合上了偏磷酸根。1075cm^-1和1032cm^-1處的c6-oh和c3-oh吸收峰消失，證實(shí)c6和c3位羥基都結(jié)合上了偏磷酸根基團(tuán)。其中，1075cm^-1處的c6-oh吸收峰的減小幅度大于1032cm^-1處的c3-oh吸收峰，證明c6位羥基的反應(yīng)活性要大于c3位羥基的反應(yīng)活性。而3433cm^-1處的c2-oh吸收峰沒有變化，說明c2-oh沒有結(jié)合上偏磷酸根。1668cm^-1處的c=o吸收峰沒有變化，說明魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖中都含有乙?；４送?，沒有其他官能團(tuán)的吸收峰表明，在合成酯化魔芋葡甘露聚糖過程中沒有氧化魔芋葡甘露聚糖單元上的其他官能團(tuán)或破壞糖環(huán)結(jié)構(gòu)。并且魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖在891^-1cm處有明顯吸收峰，表明兩者都是以β糖苷鍵相連接；

凝膠色譜圖譜結(jié)果

本發(fā)明利用模塊式凝膠色譜儀對魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖通過激光光散射檢測器和視差折光檢測器進(jìn)行分子量測定，結(jié)果如附圖3。紅色曲線為激光光散射檢測結(jié)果，藍(lán)色為視差折光檢測器檢測結(jié)果。從兩圖中可以看出，魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖為非單一對稱峰，可能由至少2種相似的電荷密度和相近分子量的多糖組成。其中魔芋葡甘露聚糖的絕對重均分子量（mw）為6.08×10⁵，酯化魔芋葡甘露聚糖的絕對重均分子量（mw）為1.78×10⁶；

hplc圖譜結(jié)果

由表1及附圖4可知，魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖主要由d-甘露糖和d-葡萄糖組成，其中魔芋葡甘露聚糖中d-甘露糖的面積為62.73%，d-葡萄糖的面積為35.57%，由此可知，魔芋葡甘露聚糖中d-甘露糖與d-葡萄糖的比例為1.76:1。酯化魔芋葡甘露聚糖中d-甘露糖的面積為64.98%，d-葡萄糖的面積為34.10%，因此，酯化魔芋葡甘露聚糖中d-甘露糖與d-葡萄糖的比例為1.91:1；

表1魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖組分保留時(shí)間和峰面積

固體nmr圖譜結(jié)果

本試驗(yàn)利用400mhz固體核磁共振譜儀對魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖進(jìn)行了¹³c和³¹p譜進(jìn)行分析。從附圖5中可以看出，共出現(xiàn)了4個波峰，代表具有4種化學(xué)位移的碳存在，其中c72~78是c2，c3，c5的化學(xué)位移，c102是c1的化學(xué)位移，c67是c6的化學(xué)位移，c21是c4的化學(xué)位移，c63屬于多糖的無定形結(jié)構(gòu)。由于魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖的c2，c3，c5的譜峰重疊，難于分析c2和c3在反應(yīng)中的變化，而c1、c4和c6的化學(xué)位移相對重疊較少。雖然魔芋葡甘露聚糖和酯化魔芋葡甘露聚糖中c1和c4不存在游離羥基，但是c1和c4與c2和c3相鄰，當(dāng)c2和c3的游離羥基發(fā)生酯化反應(yīng)時(shí)，c1和c4受周圍化學(xué)環(huán)境效應(yīng)，化學(xué)位移將發(fā)生變化。從圖中，魔芋葡甘露聚糖的c1102.48高場裂分為102.55，c4的21.74低場裂分為21.52，c6的67.01低場裂分產(chǎn)生62.03，這是因?yàn)樵赾2、c3和c6上發(fā)生酯化反應(yīng)引起的。其受影響的程度為c6最強(qiáng)，c3其次，c2最弱；

從附圖6可以看出，魔芋葡甘露聚糖在化學(xué)位移為0.37ppm處出現(xiàn)了一個特征峰，表明酯化魔芋葡甘露聚糖中含有少量磷酸根。在酯化魔芋葡甘露聚糖中出現(xiàn)-7.46ppm，說明酯化魔芋葡甘露聚糖上結(jié)合上了含端氧的單聚態(tài)磷，即po3-。而-20.62ppm處出現(xiàn)特征峰較大，顯示酯化魔芋葡甘露聚糖上結(jié)合上了多聚態(tài)磷，即（po3-）6；

實(shí)施例3：將六偏磷酸鈉法合成酯化魔芋葡甘露聚糖，按照與黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏馬菌素b1質(zhì)量比為2000：1溶于水中，在溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為300r/m的搖床中反應(yīng)8h。反應(yīng)結(jié)束后，各組3000r/m離心10min，取上清液稀釋后，按照霉菌毒素酶聯(lián)免疫試劑盒的說明檢測黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏馬菌素b1的含量。測得六偏磷酸鈉法合成的酯化魔芋葡甘露聚糖對黃曲霉毒素、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和伏馬菌素b1的吸附力分別達(dá)到400.30μg/g、182.64μg/g、398.19μg/g和356.45μg/g；

實(shí)施例4：選取144只1日齡的aa肉仔雞，隨機(jī)分為8組，每組18個重復(fù)。第1組飼喂常規(guī)飼料；第2組飼喂霉變飼料；第3～7組，在霉變飼料中分別添加0.05%、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%由六偏磷酸鈉法制備合成的酯化魔芋葡甘露聚糖；第8組在霉變飼料中添加0.10%霉可吸，研究霉變飼料中添加酯化魔芋葡甘露聚糖對肉仔雞產(chǎn)性能和抗氧化指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：添加吸附劑的試驗(yàn)組肉雞的日增重大于飼喂霉變飼料組的，添加0.10%、0.20%、0.30%、0.40%酯化魔芋葡甘露聚糖組的日增重效果和料重比與正常組最為接近；0.10%、0.20%、0.30%酯化魔芋葡甘露聚糖組和霉可吸組的料重比與正常組最為接近；霉變飼料中添加0.10%、0.20%、0.30%酯化魔芋葡甘露聚糖和飼喂常規(guī)飼料時(shí)，肉雞血清mda含量差異不顯著（p＞0.05），并且顯著低于剩余各組（p＜0.05）；霉變飼料中添加0.20%酯化魔芋葡甘露聚糖和飼喂常規(guī)飼料時(shí)，能顯著降低肉雞血清^.oh含量（p＜0.05）；霉變飼料中添加0.20%酯化魔芋葡甘露聚糖組與其余組相比，顯著提高了肉雞血清中的總抗氧化能力（p＜0.05）；由此表明，酯化魔芋葡甘露聚糖能有效地吸附霉變飼料中的霉菌毒素，提高肉雞生產(chǎn)性能，扭轉(zhuǎn)霉菌毒素對肉雞造成的過氧化損傷。在雞飼料中添加0.1%~0.30酯化魔芋葡甘露聚糖是適宜的，尤其以0.20%添加量效果更佳；

實(shí)施例5：選取32頭體重相近，日齡相同的健康仔豬，隨機(jī)分為8組，每組4個重復(fù)。第1組飼喂常規(guī)飼料；第2組飼喂霉變飼料；第3～7組，在霉變飼料中分別添加0.05%、0.10%、0.20%、0.30%和0.40%的酯化魔芋葡甘露聚糖；第8組在霉變飼料中添加0.1%霉可吸，研究霉變飼料中添加酯化魔芋葡甘露聚糖對仔豬生產(chǎn)性能和抗氧化指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：霉變飼料中添加0.10%、0.20%、0.30%和0.40%酯化魔芋葡甘露聚糖、0.10%霉可吸或飼喂常規(guī)飼料，與霉變飼料中添加0.05%酯化魔芋葡甘露聚糖或飼喂霉變飼料相比，顯著提高仔豬平均日增重（p＜0.01或p＜0.05）。霉變飼料中添加0.2%酯化魔芋葡甘露聚糖和飼喂常規(guī)飼料時(shí)，仔豬血清mda含量差異不顯著，顯著低于其余各組（p＜0.05）。在霉變飼料中添加0.10%、0.20%、0.30%酯化魔芋葡甘露聚糖，顯著降低仔豬血清^.oh含量（p＜0.01）。霉變飼料中添加0.20%酯化魔芋葡甘露聚糖，與添加0.05%、0.10%、0.30%、0.40%酯化魔芋葡甘露聚糖和0.10%霉可吸和飼喂霉變飼料相比，顯著提高仔豬血清總抗氧化能力（p＜0.05）。由此表明，酯化魔芋葡甘露聚糖能有效地吸附霉變飼料中的霉菌毒素，提高仔豬生產(chǎn)性能，扭轉(zhuǎn)霉菌毒素對仔豬造成的過氧化損傷，在豬飼料中添加0.1%~0.30酯化魔芋葡甘露聚糖是適宜的，尤其以0.20%添加量效果更佳。