本發(fā)明涉及一種以啤酒糟為原料二次混菌發(fā)酵生產高蛋白飼料的方法，屬于飼料加工領域。

背景技術：

近年來，國內外普遍采用烘干的方法來保存啤酒糟，雖然有效解決了啤酒糟容易腐敗的問題，減少環(huán)境污染，同時便于儲運。但由于啤酒糟中的粗纖維含量過高，動物適口性差，使用面不大、市場價格不高，加上設備投入、人工及能耗等因素，出現了賣鮮糟比賣干糟還賺錢的情況，有些啤酒公司出現烘干設備閑置。

啤酒糟直接作為飼料，一直是研究的熱點問題。鄧啟華^[1]對啤酒糟生產豬飼料關鍵技術進行了研究，采用預處理技術、酶解和益生菌發(fā)酵技術降解啤酒糟的纖維含量，改善蛋白品質，提高啤酒糟的飼喂價值。以糖糟和啤酒糟為原料，接入酵母菌^[2]，多菌株優(yōu)化組合如枯草芽孢桿菌，熱帶假絲酵母固態(tài)法發(fā)酵生產高蛋白飼料^[3-6]，且含有多種消化酶。利用響應面分析方法，對優(yōu)化啤酒糟固態(tài)發(fā)酵制備蛋白飼料的條件進行了進一步的研究^[7]。孫丹鳳^[8]等對發(fā)酵啤酒糟飼料進行豬、雞等飼喂試驗，結果表明效果良好。

目前，未見有啤酒糟二次混菌發(fā)酵技術生產高蛋白啤酒糟飼料的相關報道。

參考文獻：

[1]鄧啟華.啤酒糟生產豬飼料關鍵技術研究[D].烏魯木齊:新疆農業(yè)大學,2010

[2]郭建華,竇少華,邱然,等.利用糖糟和啤酒糟生產蛋白飼料的研究[J].飼料工業(yè),2005,26(1):4-5

[3]蔡俊.啤酒糟發(fā)酵生產蛋白飼料的研究[J].糧食與飼料工業(yè),2001,(3):30-31

[4]陶敏,王維嘉,蔡俊. 啤酒糟發(fā)酵產高蛋白飼料菌種的配伍[J].飼料工業(yè).2011,32(11):58-61

[5]王穎,馬海樂.混菌固態(tài)發(fā)酵啤酒糟生產蛋白飼料的研究[J].飼料工業(yè),2010,31(17):26-28

[6]王成濤,朱桂華,馬玉君,等.糟渣發(fā)酵生產飼料蛋白的發(fā)酵條件的優(yōu)化及效果[J].黑龍江八一農墾大學學報,2002,14(3):72-75

[7]安曉萍,齊景偉,烏蘭,等.響應面優(yōu)化啤酒糟固態(tài)發(fā)酵制備蛋白飼料的條件研究[J].糧食與飼料工業(yè).2013.(2):40-43

[8]孫丹鳳,王友煒,王聰,等.發(fā)酵啤酒糟營養(yǎng)價值評定及對肉雞生長性能的影響[J].飼料工業(yè),2009,30(17):26-28。

技術實現要素：

目前啤酒糟發(fā)酵使作固態(tài)混菌發(fā)酵中，菌種一次添加，對產品發(fā)酵勢必造成微生物間的相互影響，為提高啤酒糟的使用效率，本發(fā)明通過選使用纖維素分解能力強的霉菌分解纖維素，為后續(xù)發(fā)酵提供糖源，再添加酵母菌和枯草芽孢桿菌，以霉菌分解纖維素產生的糖源進行進一步發(fā)酵，達到充分利用纖維素，提高蛋白質產量的目的的一種以啤酒糟為原料二次混菌發(fā)酵生產高蛋白飼料的方法。

本發(fā)明提供的技術方案是：一種以啤酒糟為原料二次混菌發(fā)酵生產高蛋白飼料的方法，包括以下制備步驟：

（1）以重量計，把啤酒糟與麩皮以6-10:2的比例配置，再加入1-3倍的水，混勻后進行滅菌；

（2）滅菌后，進行混菌接種進行第一次發(fā)酵，混菌接種量為18-22%，所述混菌為黑曲霉和木霉，在28-32℃下培養(yǎng)2-4天；

（3）第一次發(fā)酵結束后，再添加硫酸銨3%-7%，尿素1-3%，混菌接種后進行第二次發(fā)酵，所述混菌為啤酒酵母和枯草芽孢桿菌，或飼料酵母和枯草芽孢桿菌，接種量為15%-18%，在溫度30-35℃下培養(yǎng)3-5天，即可得到高蛋白飼料。

所述的方法，優(yōu)選地，步驟（2）中，黑曲霉和木霉的比例為6:4；啤酒酵母與枯草芽孢桿菌的比例或飼料酵母與枯草芽孢桿菌的比例為5:1；步驟（1）中，滅菌條件為115℃，15min。

所述的方法，優(yōu)選地，步驟（1）中，啤酒糟與麩皮以8:2的比例配置，再加入2倍的水；步驟（2）中，混菌接種量為18-22%，在30℃下培養(yǎng)3天；步驟（3）中，添加硫酸銨3.46%，尿素2%，啤酒酵母和枯草芽孢桿菌的接種量為16.26%，或飼料酵母和枯草芽孢桿菌接種量為16.51%，在溫度35℃下培養(yǎng)4天。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明以啤酒糟為原料，利用黑曲霉和康氏木霉進行第一次發(fā)酵，在30℃下培養(yǎng)3天時，纖維素酶活為731.603nkat。以第一次發(fā)酵的啤酒糟為原料，添啤酒酵母與枯草芽孢桿菌組合進行第二次混菌發(fā)酵，添加硫酸銨3.46%，理論粗蛋白質含量38.11%；添加飼料酵母與枯草芽孢桿菌組合進行第二次混菌發(fā)酵時，理論粗蛋白質含量43.38%。本發(fā)明方法在進行發(fā)酵的過程中，分兩步進行添加菌種，來分步達到所需目的，首先降低培養(yǎng)基中粗纖維的含量，再提高培養(yǎng)基中蛋白質的含量，可以更好的生產出所需的高蛋白飼料。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的技術路線圖。

具體實施方式

下面通過具體實施方式的詳細描述來進一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。

實施例一：

請參見圖1，菌體的初篩：確定菌種是否能利用啤酒糟的營養(yǎng)成分生長。

250mL三角瓶中裝入經處理的啤酒糟和麩皮共30g（采取啤酒槽與麩皮的比例為8:2），作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

在250mL的燒杯中加入發(fā)酵培養(yǎng)基30g，加入0.5倍蒸餾水，在115℃滅菌15min后，接入20%的種子液（混菌為等比例分配），在32℃培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)3天。

當所使用的發(fā)酵培養(yǎng)條件一致時，所接入的菌種分別為黑曲霉、康氏木霉、曲霉、青霉、康氏木霉、黑曲霉和康氏木霉、黑曲霉和青霉、康氏木霉和曲霉、康氏木霉和青霉、曲霉和青霉、黑曲霉和康氏木霉和曲霉、黑曲霉和康氏木霉和青霉、康氏木霉和曲霉和青霉、黑曲霉和曲霉和青霉，分別計算接入不同菌種，培養(yǎng)基產生的纖維素酶活的量。

選擇的合適的菌種，進行進一步配伍實驗。

優(yōu)良啤酒糟發(fā)酵菌株配伍與優(yōu)化：以啤酒糟為主要培養(yǎng)基，以纖維素酶總活力為指標，選擇具有良好纖維素酶高產霉菌菌株，并通過配伍成優(yōu)良菌群；以蛋白質含量為指標，優(yōu)選優(yōu)良啤酒糟酵母菌株，并與芽孢桿菌優(yōu)化配伍成優(yōu)良菌群。

對兩種不同酵母菌分別進行響應面實驗，得出最佳發(fā)酵菌種。

一次混菌發(fā)酵條件選擇與優(yōu)化：以還原糖糖化率為考察指標，通過纖維菌接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、加水量進行L9(34)正交實驗設計，確定最佳工藝條件。

在單一菌發(fā)酵中，以發(fā)酵時間、含水量、接種量和溫度為試驗因子，進行四因素三水平的正交優(yōu)化實驗。以酒糟發(fā)酵過程中產品粗纖維含量為考察指標。

為考察混菌發(fā)酵效果，以發(fā)酵時間、含水量、菌種比、接種量和溫度為試驗因子，進行五因素四水平的正交優(yōu)化試驗。以酒糟發(fā)酵過程中產品粗纖維含量為考察指標。

通過SPSS軟件（IBM SPSS Statistics 22）對正交試驗結果進行分析，得出最佳工藝條件。

二次混菌發(fā)酵條件選擇與優(yōu)化：根據啤酒糟的營養(yǎng)成分的確定影響因子，進行Plackett-Burman 試驗設計。利用響應面法中的Box-Behnken設計對重要因子進行進一步的優(yōu)化，并進行培養(yǎng)條件的驗證。

Plackett-Burman設計：通過前期試驗，選取影響發(fā)酵產物粗蛋白質含量的可能因素，包括硫酸銨、尿素、接種量、菌種比、溫度、時間。為了對這6個因素進行全面考察，選用了Plackett-Burman設計，每個因素取2個水平，粗蛋白質含量作為響應值Y?？疾旄饕蛩氐闹餍徒换プ饔茫_定重要影響因素。

從實驗結果中得到，影響粗蛋白質含量的主要因子，再以這3個因素進入下一步的響應面分析試驗。響應面分析：根據Box-Behnken的中心組合設計原理，對Plackett-Burman試驗設計篩選的3個主要影響因素，進行Box-Behnken試驗設計。根據Box-Behnken中心組合設計原理，以粗蛋白質含量為響應值，設計3因素3水平共15個試驗點的響應面分析試驗。最后通過 Minitab軟件處理，得到最佳工藝。

以啤酒糟（燕京啤酒（衡陽）有限公司提供）和麩皮按重量比8:2混合后為原料（培養(yǎng)基），利用黑曲霉（Aspergillus niger）（湖南農業(yè)大學生科院實驗室提供）和康氏木霉（T.koningi AS3.2774）（湖南農業(yè)大學生科院實驗室提供）進行一次發(fā)酵，按重量計，發(fā)酵時加水量為啤酒糟和麩皮的總重量的2倍，黑曲霉：木霉為6:4的混菌接種量為20%（接種量為培養(yǎng)基體積的20%），在30℃下培養(yǎng)3天時，纖維素酶活為731.603nkat。以第一次發(fā)酵的啤酒糟為原料，并添加硫酸銨3.46%（添加量為培養(yǎng)基體積的3.46%），尿素2%（添加量為培養(yǎng)基體積的2%），啤酒酵母（Sac-charomyces cerevisiae）（湖南農業(yè)大學生科院實驗室提供）與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（湖南農業(yè)大學生科院實驗室提供）組合進行第二次混菌發(fā)酵，最佳條件為溫度35℃，培養(yǎng)4天，接種量16.26%（接種量為培養(yǎng)基體積的16.26%），啤酒酵母比枯草芽孢桿菌的比例為5:1，理論粗蛋白質含量38.11%（凱氏定氮法）。

實施例二：

以啤酒糟（燕京啤酒（衡陽）有限公司提供）和麩皮按重量比8:2混合后為原料（培養(yǎng)基），利用黑曲霉（Aspergillus niger）和康氏木霉（T.koningi）進行一次發(fā)酵，按重量計，發(fā)酵時加水量為啤酒糟的2倍，黑曲霉：木霉為6:4的混菌接種20%（接種量為培養(yǎng)基體積的20%），在30℃下培養(yǎng)3天時，纖維素酶活為731.603nkat。以第一次發(fā)酵的啤酒糟為原料，添加硫酸銨5.00%，尿素2%，飼料酵母（AS2.1180）（湖南湖南輕工研究院提供）與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）組合進行第二次混菌發(fā)酵時，最佳條件為溫度33.73℃，培養(yǎng)4天，接種量16.51%，飼料酵母比枯草芽孢桿菌的比例為5:1，理論粗蛋白質含量43.38%（凱氏定氮法）。