本發(fā)明屬于飼料添加劑領(lǐng)域，具體涉及2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸的應用。
背景技術(shù)：
瘤胃甲烷生成不僅導致5～7％的反芻動物飼料能量損失，還是溫室氣體的重要來源，羊每年平均產(chǎn)10～16kg甲烷，牛平均為60～160kg。因此，對反芻動物甲烷抑制劑的研究應用，不僅能提高動物的能量利用效率和生產(chǎn)性能，還具有良好的生態(tài)效益。雖然已有各種各樣的飼料添加劑(如天然植物提取物、離子載體、多鹵素化合物、電子受體、油脂等)被研究開發(fā)，但均存在不同的問題，如長效性、安全性和微生物耐受性等問題。這些缺陷限制了已有添加劑的廣泛應用。硝酸鹽是近年來研究較多的，也是較有應用前景的瘤胃甲烷抑制劑，但其在瘤胃中代謝的中間產(chǎn)物亞硝酸鹽，能夠經(jīng)瘤胃壁進入血液引起高鐵血紅蛋白血癥，危害動物健康。雖然安全應用硝酸鹽的研究已經(jīng)開展，但仍有較長一段路要走。因此，一種新的，高效的反芻動物甲烷抑制劑是社會所亟需的。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸在制備甲烷菌抑制劑中的應用，已解決現(xiàn)有技術(shù)存在的長效性、安全性和微生物耐受性不足等問題。
本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸作為動物飼料添加劑的應用。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸在制備甲烷菌抑制劑中的應用。
2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸的結(jié)構(gòu)式如下：
其中，所述的甲烷菌為瘤胃甲烷菌。
其中，所述的甲烷菌抑制劑為反芻動物甲烷菌抑制劑。
2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸作為動物飼料添加劑的應用也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
其中，所述的動物為反芻動物。
其中，所述的應用是指2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸作為動物飼料添加劑在抑制動物瘤胃甲烷中的應用。
有益效果：
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢：
2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸能夠通過自身的硝酸酯官能團(-O-NO2)氧化甲烷菌甲基輔酶M還原酶的鎳(+1)活性中心。甲基輔酶M還原酶是甲烷菌甲烷生成途徑中的關(guān)鍵酶，它的失活將阻斷甲烷生成。試驗證明這類化合物具有長期抑制瘤胃甲烷生成的能力。與目前研究較廣的瘤胃甲烷抑制劑硝酸鹽相比，其安全性更高。因為2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸在瘤胃代謝過程中，不易導致亞硝酸鹽過量積累。在實施的體外實驗和動物體內(nèi)實驗中均未檢出亞硝酸鹽離子過量累積。
具體實施方式
根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應當也不會限制權(quán)利要求書中所詳細描述的本發(fā)明。
實施例1
1材料方法
1.1實驗材料
1.1.1試驗動物及瘤胃液采集
試驗動物為4頭裝有永久性瘤胃瘺管的湖羊。飼喂苜蓿干草，自由飲水。每天08:00和16:00分兩次飼喂。試驗當天，在晨飼前半小時取瘤胃液，從4頭瘺管羊取得新鮮瘤胃液迅速裝入預先通入二氧化碳的保溫瓶帶回實驗室。
1.1.2人工瘤胃發(fā)酵液制備
發(fā)酵液的配制參照Menke和Steingass(1988)的方法。將采集的新鮮瘤胃液用4層紗布過濾，量取1250mL的瘤胃液迅速倒入已準備好的3750mL的人工緩沖液中，瘤胃液與緩沖液按1:3(v/v)的比例混合，制成混合人工瘤胃培養(yǎng)液。將混合后的發(fā)酵液分裝到180mL發(fā)酵瓶中，整個過程的溫度保持在39℃，持續(xù)通入純二氧化碳以保持厭氧環(huán)境(以刃天青變成無色來判斷)，用磁力攪拌器攪拌以保持瘤胃液與緩沖液混合均勻。發(fā)酵瓶中預先添加0.5g粉碎苜蓿干草和0.5g玉米粉以及不同劑量的甲烷菌抑制劑置于39℃的恒溫培養(yǎng)箱中預熱30min。然后向發(fā)酵瓶中通入二氧化碳以保證發(fā)酵瓶中為厭氧環(huán)境。分裝完畢后，在恒溫振蕩器39℃，100r/min條件下培養(yǎng)24小時。
1.1.3甲烷菌抑制劑
2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸
1.2試驗方法
1.2.1試驗設(shè)計
實施例1：試驗設(shè)3個組，對照組(不添加任何藥物)，2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸組1(330μm/L)和2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸組2(660μm/L)。
1.2.2化學分析
發(fā)酵結(jié)束時，立即測定總產(chǎn)氣量，H2和CH4和pH。取2mL發(fā)酵液，13 000r/min和4℃條件下離心10min取1.5mL上清液，加入0.2mL 25％偏磷酸固定，靜置15min后，-20℃保存，后續(xù)用于揮發(fā)性脂肪酸的測定。
總產(chǎn)氣量的測定參照Theodorou等(1994)的方法,用氣壓轉(zhuǎn)換儀測定發(fā)酵瓶內(nèi)產(chǎn)氣量。
H2和CH4使用安捷倫7890B氣相色譜儀測定。汽化室溫度：200℃；色譜柱(Porapak Q packing&MolSieve 5A packing，Agilent)，柱溫80℃；TCD檢測器：200℃；載氣為N2。
揮發(fā)性脂肪酸參照Pontes等[13]方法檢測。采用安捷倫7890B氣相色譜儀。汽化室220℃；色譜柱為FUSED SILICA毛細管柱(Supelco)，柱溫40℃，4min；40-110(40℃/min)；110℃，2min；110-150(40℃/min)；150℃,5min梯度升溫。氫離子火焰檢測器FID：250℃。載氣為氮氣。樣品經(jīng)偏磷酸酸化，內(nèi)標為巴豆酸。
乳酸參照Barker&Summerson(1941)方法測定。
干物質(zhì)消失率參照朱偉云等(2001)方法測定。
1.2.3微生物濃度測定
微生物濃度定量分析采用Premix Ex TagTM(TaKaRa)試劑，Applied Biosystems 7300Real-Time PCR System。利用含有目的基因片段的質(zhì)粒制備標準曲線，計算目的基因在樣品中的濃度。本文中使用的PCR引物如下所列。
1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理
數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件中的One-way ANOVA(Tukey)進行分析，置信區(qū)間為95％。實施例1 2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸抑制瘤胃體外發(fā)酵甲烷菌生成試驗
由表1可見，與對照組(未添加組)相比，添加330μmol/L的2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸能夠減少92％的甲烷生成量。對短鏈脂肪酸的檢測顯示(表2)，添加抑制劑盡管降低了乙酸的生成量，但沒有顯著影響總短鏈脂肪酸的生成量。乙酸和丙酸比值顯著降低。
表1瘤胃體外發(fā)酵24小時氣體產(chǎn)生量
表2瘤胃體外發(fā)酵24小時短鏈脂肪酸的生成量
由表3所示，添加330μmol/L的2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸顯著降低了甲烷菌數(shù)量，但沒有顯著影響瘤胃厭氧真菌、原蟲和細菌的數(shù)量。在瘤胃中，細菌和原蟲是降解飼料的主要菌群，而厭氧真菌是首先定殖到植物片段的菌群之一，他們在瘤胃植物細胞壁降解過程中起著重要作用。試驗結(jié)果表明2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸對甲烷菌的抑制具有專一性。
添加660μmol/L的2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸，完全抑制甲烷生成。沒有影響細菌和原蟲的數(shù)量，但顯著降低瘤胃厭氧真菌的數(shù)量。乙酸產(chǎn)量和乙酸與丙酸比顯著下降，丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸沒有顯著變化。
表3添加2,2雙甲基-3-(硝基氧基)丙酸對瘤胃甲烷菌、細菌、真菌和原蟲的影響