本發(fā)明涉及飼料添加劑領域，尤其涉及一種由啤酒廢棄酵母泥制備核糖核苷酸的方法及含核糖核苷酸的飼料添加劑。
背景技術：
我國每年從啤酒生產(chǎn)中淘汰下來的廢酵母折干有5萬噸之多，啤酒酵母細胞中核糖核酸(RNA)含量高達酵母細胞的4％至6％。核苷酸已應用于飼料和養(yǎng)殖業(yè)，作為飼料添加劑。許多哺乳動物、家禽和魚蝦，在其快速生長階段，或遭遇到環(huán)境和生活條件急劇改變時，機體許多重要免疫器官如淋巴、骨髓、腸道、血紅細胞和白細胞中內(nèi)源核苷酸不能滿足需要，造成機體免疫力急驟下降，誘發(fā)許多疾病。在相應階段適當補充外源核苷酸，可以維持養(yǎng)殖動物機體整體免疫功能，促進腸道細胞分化、生長和修復；增強抗應激能力，減少疾病和死亡；產(chǎn)生體內(nèi)抗氧化，消除自由基；可誘食、增食，促進生長發(fā)育；提高生殖能力和繁殖系數(shù)等。
為了利用廢酵母中的核苷酸，需將核糖核酸從廢酵母中分離出來，并將其酶解為核苷酸?，F(xiàn)有從啤酒廢棄酵母泥分離核糖核酸的方法，得到的核糖核酸含量很有限，在5-6％左右(地衣酚核糖核酸測定法)，核糖核酸酶解方法水解效率很低，需要耗費很長的酶解時間，約22-30小時。
技術實現(xiàn)要素：
有鑒于此，有必要針對上述的問題，提供一種由啤酒廢棄酵母泥制備核糖核苷酸的制備方法及含核糖核苷酸的飼料添加劑。
一種由啤酒廢棄酵母泥制備核糖核苷酸的制備方法，包括以下步驟：
S1、預處理：對啤酒廢棄酵母泥進行過篩除雜，離心獲得干物質(zhì)濃度10-22wt％的酵母泥濃縮液；
S2、第一次酶解：將步驟S1制得的酵母泥濃縮液加熱升溫至40-60℃，調(diào)整pH值至4.0-11.0，然后加入第一復合酶，在40-60℃酶解15-18小時得到第一酶解液，終止酶解并離心得到上清液A；第一復合酶的用量為酵母泥干物質(zhì)重量的1-3wt‰，所述第一復合酶由蛋白酶和纖維素酶按照1:1的重量比組成；
S3、超濾純化核酸：使用超濾設備將上清液A在室溫及壓強不超過3MPa條件下進行超濾純化，得到核糖核酸濃縮液，濃度為80-90wt％；
S4、第二次酶解：向核糖核酸濃縮液中加入第二復合酶，在40-60℃酶解1.0-2.0小時得到第二酶解液；終止酶解并離心得到上清液B；噴霧干燥上清液B得到酵母核苷酸粉，核苷酸單體含量為40-60wt％；第二復合酶的用量為核糖核酸濃縮液中干物質(zhì)重量的1-3wt‰，所述第二復合酶由核酸酶和磷酸二酯酶按照1:1的重量比組成。
優(yōu)選地，所述步驟S2中第一復合酶的酶活力與底物濃度之比為5000-10000U/g，反應溫度為50-60℃。
更優(yōu)選地，所述步驟S2中第一復合酶的酶活力與底物濃度之比為6000-8000U/g。
優(yōu)選地，所述步驟S4中第二復合酶的酶活力與底物濃度之比為1000-5000U/g，反應溫度為50-60℃。
優(yōu)選地，所述步驟S2中終止酶解的方法為：調(diào)整第一酶解液pH值至3.0-5.0，加熱至80-100℃滅活20-30min。
更優(yōu)選地，所述步驟S2中在終止酶解后，向第一酶解液中加入SDS緩沖液，SDS緩沖液的重量為第一酶解液重量的1-2倍，離心得上清液A。
優(yōu)選地，所述步驟S4中終止酶解并離心的方法為：將第二酶解液的pH值調(diào)至5.0以下，加熱至80-100℃保持20-30min，離心得上清液B。
優(yōu)選地，步驟S2和步驟S4中的離心條件為7000r/min、10-20min。
一種含核糖核苷酸的飼料添加劑，包含下述重量百分數(shù)的下述組分：
上述核苷酸粉15-25wt％，協(xié)同增效劑5-15wt％，載體60-80wt％。
優(yōu)選地，所述含核糖核苷酸的飼料添加劑包含下述重量百分數(shù)的下述組分：
上述核苷酸粉20wt％，協(xié)同增效劑10wt％，載體70wt％。
優(yōu)選地，所述協(xié)同增效劑為核苷酸堿基，所述載體為葡萄糖和風味物質(zhì)，所述風味物質(zhì)用于改善飼料適口性，如香味劑、鮮味劑或味精等。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
本發(fā)明通過兩次酶解自啤酒廢棄酵母泥中制得核糖核苷酸，通過設定特定的組合酶和條件，可以加快啤酒酵母的酶解和核糖核酸的水解，提高核糖核苷酸的酶解效率。在對啤酒廢棄酵母泥進行蛋白酶解階段，復合使用蛋白酶與纖維素酶，比使用單一酶酶解效果更好，酶解速度更快，顯著縮短酶解時間，從原來的22-24小時縮短為15-18小時，酶解速度提高了約25-30％。在核酸酶解階段，復合使用核酸酶和磷酸二酯酶，比單一使用核酸酶或磷酸二酯酶酶解速度更快，縮短酶解時間。
本發(fā)明經(jīng)過第一次酶解、濃縮后得到的核糖核酸純度高達80-90％，第二次酶解、干燥后得到的核糖核苷酸單體含量為40-60％，制備的飼料添加劑中核苷酸的含量為20-25％。本發(fā)明飼料添加劑適用于所有養(yǎng)殖動物，能提高母畜繁殖性能，提高幼小動物生長速度，促進幼小動物腸道發(fā)育，提高機體免疫力水平。
具體實施方式
為了更好的說明本發(fā)明，下面結合具體實施例做進一步說明。本發(fā)明中所用試劑或儀器均可由市場購得。本實施例中核糖核酸的測定使用地衣酚核糖核酸測定法，核苷酸的測定使用高效液相色譜法。
實施例1
一種由啤酒廢棄酵母泥制備核糖核苷酸的制備方法，包括以下步驟：
S1、預處理
對啤酒廢棄酵母泥進行除雜，然后1000r/min離心，去上清液，得到干物質(zhì)約為15％的啤酒酵母泥濃縮液，以提高干物質(zhì)濃度，進而提高生產(chǎn)效率。本實施例中使用新鮮的啤酒廢棄酵母泥，不必進行除臭處理。
S2、第一次酶解
使用NaOH溶液調(diào)整啤酒酵母泥濃縮液pH值至6.0；再向其中加入第一復合酶，第一復合酶由中性蛋白酶和纖維素酶組成，兩種酶的重量比例為1:1，酶的總重量是底物干物質(zhì)總量的1‰，酶活力與底物濃度之比為5000U/g；然后在溫度為55℃、pH為6.0的條件下進行酶解18h，得到第一酶解液。
使用鹽酸將第一酶解液的pH值調(diào)節(jié)至3.0，加熱至80℃，使中性蛋白酶、纖維素酶以及未被水解的酵母蛋白進行變性沉淀30min，然后用離心機分離，轉(zhuǎn)速為7000r/min，時間為10-20min，去沉淀，得到上清液A；
S3、超濾純化核酸
使用超濾設備將上清液A在室溫、壓強不超過3MPa的條件下進行超濾純化，得到核糖核酸濃縮液(濃度為80-90wt％)，本實施例中使用的超濾設備是以切向流過濾方式運行、使用管式膜組件的超濾設備，其超濾膜截留分子量為5000Da，控制進入超濾設備的濾液中的酵母和氯化鈉總濃度不超過15％，進樣速度為10ml/cm2·min。
S4、第二次酶解
將核糖核酸濃縮液中的核糖核酸濃度以重量計控制在10-20％(超濾結束后調(diào)整)，然后加入第二復合酶，所述第二復合酶由核酸酶和5’-磷酸二酯酶組成，酶活力與底物濃度之比為1000U/g，再加入硫酸鋅，使溶液中硫酸鋅的濃度為0.5×10-3mol/L，然后在溫度為60℃、pH值為4.0的條件下進行酶解1h，得到第二酶解液，然后使用鹽酸將第二酶解液的pH值調(diào)節(jié)至5.0以下，再加熱至100℃保持30min，使酶蛋白變性沉淀，最后用離心機分離，轉(zhuǎn)速7000r/min，時間10-20min，去除沉淀，得到上清液B。上清液B經(jīng)噴霧干燥得到酵母核苷酸粉，噴霧干燥條件為：進風溫度為140℃，出風溫度為80℃，所得酵母核苷酸粉的性能指標如下：灰分含量≤5％，水分含量≤5％，核苷酸含量40-60％。
一種含核糖核苷酸的飼料添加劑，包含下述含量的下述組分：
上述核苷酸粉20wt％，協(xié)同增效劑10wt％，載體70wt％；
其中，所述協(xié)同增效劑為核苷酸堿基，所述載體為無水葡萄糖和風味物質(zhì)。所得飼料添加劑的性能指標如下：灰分≤8.5％，水分含量≤10％，核苷酸含量≥20％。
實施例2
一種由啤酒廢棄酵母泥制備核糖核苷酸的制備方法，包括以下步驟：
S1、預處理
對啤酒廢棄酵母泥進行除雜，然后1000r/min離心，去上清液，得到干物質(zhì)約為20％的啤酒酵母泥濃縮液。本實施例中使用新鮮的啤酒廢棄酵母泥，可不進行除臭處理。
S2、第一次酶解
使用NaOH溶液調(diào)整啤酒酵母泥濃縮液pH值至6.0；再向其中加入第一復合酶，第一復合酶由中性蛋白酶和纖維素酶組成，兩種酶的重量比例為1:1，酶的總重量是底物干物質(zhì)總量的2‰，酶活力與底物濃度之比為6000U/g；然后在溫度為60℃、pH為6.0的條件下進行酶解15h，得到第一酶解液。
使用鹽酸將第一酶解液的pH值調(diào)節(jié)至3.0，加熱至100℃，使中性蛋白酶、纖維素酶以及未被水解的酵母蛋白進行變性沉淀30min，然后用離心機分離，轉(zhuǎn)速7000r/min，時間10-20min，去沉淀，得到上清液A；
S3、超濾純化核酸
使用超濾設備將上清液A在室溫、壓強不超過3MPa的條件下進行超濾純化，得到核糖核酸濃縮液(濃度80-90wt％)，本實施例中使用的超濾設備是以切向流過濾方式運行、使用管式膜組件的超濾設備，其超濾膜截留分子量為5000Da，控制進入超濾設備的濾液中的酵母和氯化鈉總濃度不超過15％，進樣速度為10ml/cm2·min。
S4、第二次酶解
將核糖核酸濃縮液中的核糖核酸濃度以重量計控制在10-20％(超濾后調(diào)整)，然后加入第二復合酶，所述第二復合酶由核酸酶和5’-磷酸二酯酶組成，酶活力與底物濃度之比為1000U/g，再加入硫酸鋅，使溶液中硫酸鋅的濃度為0.5×10-3mol/L，然后在溫度為60℃、pH值為4.0的條件下進行酶解1h，得到第二酶解液，然后使用鹽酸將第二酶解液的pH值調(diào)節(jié)至5.0以下，再加熱至100℃保持30min，使酶蛋白變性沉淀，最后用離心機分離，轉(zhuǎn)速7000r/min，時間10-20min，去除沉淀，得到上清液B。上清液B經(jīng)噴霧干燥得到酵母核苷酸粉，噴霧干燥條件為：進風溫度為140℃，出風溫度為80℃，所得酵母核苷酸粉的性能指標如下：灰分含量≤5％，水分含量≤5％，核苷酸含量40-60％。
一種含核糖核苷酸的飼料添加劑，包含下述含量的下述組分：
上述核苷酸粉25wt％，協(xié)同增效劑10wt％，載體65wt％其中，所述協(xié)同增效劑為核苷酸堿基，所述載體為葡萄糖和風味物質(zhì)兩種。所得飼料添加劑的性能指標如下：灰分≤8.5％，水分含量≤10％，核苷酸含量≥23％。
實施例3
一種由啤酒廢棄酵母泥制備核糖核苷酸的制備方法，包括以下步驟：
S1、預處理
對啤酒廢棄酵母泥進行除雜，然后1000r/min離心，去上清液，得到干物質(zhì)約為25％的啤酒酵母泥濃縮液，以提高干物質(zhì)濃度。本實施例中使用新鮮的啤酒廢棄酵母泥，可進行除臭處理。
S2、第一次酶解
使用NaOH溶液調(diào)整啤酒酵母泥濃縮液pH值至6.0；再向其中加入第一復合酶，第一復合酶由中性蛋白酶和纖維素酶組成，兩種酶的重量比例為1:1，酶的總重量是底物干物質(zhì)總量的3‰，酶活力與底物濃度之比為8000U/g；然后在溫度為60℃與pH為6.0的條件下進行酶解15h，得到第一酶解液。
使用鹽酸將第一酶解液的pH值調(diào)節(jié)至3.0，加熱至100℃，使中性蛋白酶、纖維素酶變性沉淀30min，加入SDS緩沖液，SDS緩沖液的重量為酶解液重量的1-2倍，使第一酶解液中未被水解的酵母蛋白變性沉淀，然后用離心機分離，轉(zhuǎn)速7000r/min，時間10-20min，去沉淀，得到上清液A；
S3、超濾純化核酸
使用超濾設備將上清液A在室溫、壓強不超過3MPa的條件下進行超濾純化，得到核糖核酸濃縮液，其中核糖核酸的濃度為80-90wt％，本實施例中使用的超濾設備是以切向流過濾方式運行、使用管式膜組件的超濾設備，其超濾膜截留分子量為5000Da，控制進入超濾設備的濾液中的酵母和氯化鈉總濃度不超過15％，進樣速度為10ml/cm2·min。
S4、第二次酶解
將核糖核酸濃縮液中的核糖核酸濃度以重量計控制在10-20％，然后加入第二復合酶，所述第二復合酶由核酸酶和5’-磷酸二酯酶組成，酶活力與底物濃度之比為3000U/g，再加入硫酸鋅，使溶液中硫酸鋅的濃度為0.5×10-3mol/L，然后在溫度為60℃、pH值為4.0的條件下進行酶解1h，得到第二酶解液，然后使用鹽酸將第二酶解液的pH值調(diào)節(jié)至5.0以下，再加熱至100℃保持30min，使酶蛋白變性沉淀，最后用離心機分離，轉(zhuǎn)速7000r/min，時間10-20min，去除沉淀，得到上清液B。上清液B經(jīng)噴霧干燥得到酵母核苷酸粉，噴霧干燥條件為：進風溫度為140℃，出風溫度為80℃。所得酵母核苷酸粉的性能指標如下：灰分含量≤5％，水分含量≤5％，核苷酸含量40-60％。
一種含核糖核苷酸的飼料添加劑，包含下述含量的下述組分：
上述核苷酸粉20wt％，協(xié)同增效劑10wt％，載體70wt％；
其中，所述協(xié)同增效劑為核苷酸堿基，所述載體為葡萄糖和風味物質(zhì)兩種。所得飼料添加劑的性能指標如下：灰分≤8.5％，水分含量≤10％，核苷酸含量≥20％。
效果實施例1、提高母豬繁殖性能及生產(chǎn)性能，提高初生仔豬生產(chǎn)性能
將同一品種、相同懷孕期的母豬8頭隨機分成兩組：對照組和試驗組，每組4頭母豬，每頭母豬作為一個重復組。對照組日糧為基礎日糧，試驗組日糧為基礎日糧+1kg/噸本發(fā)明含核糖核苷酸的飼料添加劑。試驗從懷孕第90天開始進行，直到哺乳期結束。期間各重復組母豬均采用相同的飼養(yǎng)管理。試驗期間記錄各母豬的采食量、產(chǎn)仔情況以及仔豬采食量等指標，試驗結束后分析對比兩組間母豬的日均采食量(ADFI)、各項產(chǎn)仔性能指標以及仔豬包括日增重(ADG)在內(nèi)的各項生長性能指標，結果如表1-3所示。
表1、母豬采食量統(tǒng)計表
由表1可知，試驗組母豬在妊娠后期采食量比對照組增加了2.8％，哺乳期采食量增加7.4％。說明本發(fā)明有利于胚胎的發(fā)育，對維持母豬體況以及提高產(chǎn)仔性能有促進作用。
表2、母豬產(chǎn)仔情況統(tǒng)計表
注：上述數(shù)據(jù)均為平均數(shù)，N＝4，數(shù)字肩標有不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。
由表2可知，試驗組母豬產(chǎn)仔性能各項指標均比對照組有良好的改善，其中成活率得到顯著提高，幅度達6.06％。因此，本發(fā)明有利于提高母豬生產(chǎn)效益。
表3、仔豬生長情況統(tǒng)計表
由表3可知，與對照組相比，試驗組仔豬各項生長性能指標均有良好的改善。因此，本發(fā)明有利于提高母乳營養(yǎng)品質(zhì)，從而促進乳仔豬健康生長，提高生產(chǎn)效益。
效果實施例2、提高幼小動物生產(chǎn)性能
選擇同一批21日齡斷奶仔豬50頭，分2組：對照組和試驗組，每組設置25頭仔豬。對照組日糧為基礎日糧，試驗組日糧為基礎日糧+1kg/噸本發(fā)明含核糖核苷酸的飼料添加劑。試驗期為15天(22-36日齡)。試驗期間記錄各組仔豬的采食量、腹瀉情況及健康狀況，試驗結束后通過分析兩組仔豬各項生長性能指標，評估產(chǎn)品效果，結果如表4所示。
表4、幼小動物生產(chǎn)性能表
由表4可知，與對照組相比，試驗組仔豬各項生長性能指標均有良好的改善，說明本發(fā)明確實可以提高幼小動物生長性能，提高生產(chǎn)效益。
效果實施例3、提高商品肉雞生產(chǎn)性能
選擇一批1日齡麻黃雞100羽，分為2組：對照組和試驗組，每組50羽小雞，對照組日糧為基礎日糧，試驗組日糧為基礎日糧+500克/噸本發(fā)明含核糖核苷酸的飼料添加劑，試驗時間為21天(1-21日齡)，試驗期間記錄各組小雞耗料量及健康狀況，試驗結束后通過分析各項生長性能指標評估產(chǎn)品實際效果，結果如表5所示。
表5、肉雞生產(chǎn)性能表
由表5可知，與對照組相比，試驗組雞的生長性能得到良好的改善，有利于提高肉雞早期的生長速度，節(jié)約飼養(yǎng)成本，提高養(yǎng)殖效益。
以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。