相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求于2010年11月5日提交的美國臨時專利申請序列No.61/410,609的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及純化的多糖組合物領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及用于降低食物的碳水化合物血糖指數(shù)并減緩血糖升高的組合物的提取和純化。

背景技術(shù)：

豆類纖維作為可溶性膳食纖維的天然來源，已經(jīng)引起了相當大的關(guān)注。豆類包含由角質(zhì)和相對較大的白色、半透明胚乳層包圍的中間硬的黃色胚芽。該胚乳包含具有主要含有半乳糖側(cè)鏈的甘露聚糖骨架的多糖。胚乳由韌性的、深棕色外皮包圍。膠漿部分的顏色取決于外皮(棕色)和子葉(黃色)的含量。

不利的是，市售的各種豆類面粉可能具有不期望的天然化學品、氣味和臭味。另外，它們具有高粘度并且不能以所需的臨床有效量作為膳食補充劑。它們也可包含一定量的可能具有毒性(包括類似于有效地作為口服避孕藥的甾類激素那樣影響生育)的甾族結(jié)構(gòu)的皂素。已知皂素和生物堿在過量攝入時能引起一系列毒性反應。為了制備具有高的有效負載量的可溶性甘露聚糖纖維的膳食補充劑，需要除去這些皂素、其它生物堿和不期望的蛋白脂質(zhì)、以及其它不合意的組分，從而使產(chǎn)品適合用作功能性膳食補充劑。

1970年的營養(yǎng)學研究表明，不同的碳水化合物在食用后對血液葡萄糖(糖)水平的影響不同。該發(fā)現(xiàn)挑戰(zhàn)了一般性假設(shè)：所有復合碳水化合物(淀粉)產(chǎn)生的血糖反應均低于單糖，并且也質(zhì)疑了過去30年以來調(diào)節(jié)糖尿病患者的飲食的碳水化合物交換表的臨床意義。該交換表基于這樣的假設(shè)：包含相等量碳水化合物的不同食物部分將產(chǎn)生相同的血糖反應。因此，為了根據(jù)在食用后升高血液葡萄糖的水平的程度來對不同食物的相等量碳水化合物分級，開發(fā)了血糖指數(shù)(GI)法。具有高GI值(≥70)的食物含有快速消化的碳水化合物，其使血液葡萄糖水平有較大的快速升高和降低。對比而言，具有低GI值(≤55)的食物含有緩慢消化的碳水化合物，其使血液葡萄糖水平產(chǎn)生逐步、相對較低地升高。

在過去20年的研究證明不能根據(jù)食物所包含的碳水化合物的類型和含量來精確地預測食物對血液葡萄糖水平的影響。這是由于碳水化合物消化和釋放入血液的速率受到許多食物因素的影響，例如食物的物理形式、其脂肪、蛋白質(zhì)和纖維含量、以及其碳水化合物的化學結(jié)構(gòu)。由于這些原因，在相同食品類型中表面類似的食品可以產(chǎn)生明顯不同的血糖反應。因此，需要根據(jù)個體來測量食品的GI值。

GI研究對食品工業(yè)和人類健康具有重要的意義。目前，科學家們認為食品標簽上常見的術(shù)語“復合碳水化合物”和“糖”幾乎沒有營養(yǎng)或生理學意義。近年來，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)以及世界衛(wèi)生組織(WHO)集結(jié)了專家委員會來研究關(guān)于碳水化合物在人類營養(yǎng)和健康方面的重要性的可用研究證據(jù)。該委員會認可使用GI法來對富含碳水化合物的食物進行分類，并且推薦使用食物的GI值結(jié)合食物組成的信息來指導對食物的選擇。目前，GI值用于為糖尿病人設(shè)計膳食計劃，并且用于調(diào)查飲食的升糖作用(glycemic impact)與特定疾病的風險之間關(guān)系的科學研究中。

在過去十年以來，越來越多的研究實體表明人類飲食的整體升糖作用可以影響胰島素耐受性的發(fā)展和相關(guān)疾病(心臟病、糖尿病)的風險，而與飲食中碳水化合物總量無關(guān)。目前，現(xiàn)有證據(jù)表明基于低GI的富含碳水化合物食物的飲食提高了糖尿病人群的胰島素敏感度和血糖控制；降低了高血脂水平；并且在耐力項目中可幫助延長體能峰值。另外，低GI食物一般較少提純并且相對飽腹，因此可用于控制體重的飲食?？紤]到在所有工業(yè)化國家中非胰島素依賴型糖尿病(NIDDM)和冠心病仍然是疾病和死亡的主要原因，人群飲食的升糖作用以何種程度影響這些疾病的開始和進程成為重大問題。因此需要進一步的研究來確定更大范圍的富含碳水化合物的食物的GI值，并且確定不同處理方法的影響。可在投放市場之前確定新的食物和成分的GI值，并且可在食物營養(yǎng)欄中標示它們的GI值來幫助消費者嘗試降低他們飲食的升糖作用。

目前，很少有同時測量餐后血糖和胰島素反應的研究。這是由于測量血液樣品中胰島素水平的成本昂貴，并且也反映了通常認為血糖過多是糖尿病人群的飲食療法中考慮的唯一相關(guān)餐后因素。然而，目前研究表明對某些食物的餐后胰島素反應不成比例地高于它們的血糖反應。越來越多的飲食測試研究結(jié)果以及大量的流行病學研究表明，長期攝入高血糖負荷的飲食可以誘發(fā)再發(fā)性和高血糖，并且胰島素水平與發(fā)生胰島素耐受性、非胰島素依賴性糖尿病、血脂異常和心血管疾病的風險增加有關(guān)。如果能獲得常用食物的胰島素指數(shù)值的大量數(shù)據(jù)庫，則可能給出在飲食和某些慢性疾病風險之間的更直接的聯(lián)系。

盡管飲食中的碳水化合物是胰島素分泌的主要刺激，其他食物因素(如某些氨基酸和脂肪酸)也增強胰島素的分泌。富含蛋白質(zhì)但是碳水化合物含量低的食物(如肉或魚)，與它們的低血糖反應相比，能誘導相對較高水平的胰島素分泌。另外，富含精細碳水化合物和脂肪的食物(如巧克力和某些烘焙產(chǎn)品)能夠產(chǎn)生比它們的餐后血糖反應大得多的胰島素反應。近來，美國的暢銷飲食書籍已經(jīng)普及了這樣的概念：富含碳水化合物的食物引發(fā)高胰島素反應，是特別容易增肥的。不幸的是，作者沒有正確地確認低或高的胰島素食物。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及來自各種豆類的純化甘露聚糖或甘露聚糖纖維的組合物，以及它們的使用方法。所述純化的大小均勻的低變應原性纖維由大于50％的甘露糖單糖單元組成，并且用于提供單一的高劑量膳食補充劑。該膳食補充劑可以通過控制循環(huán)系統(tǒng)對糖的消耗和吸收，從而用于降低食物的碳水化合物血糖指數(shù)并且緩和血糖升高。

在一個示意性實施方案中，本文公開了化學純化的可溶性甘露聚糖纖維組合物以及它們在可口的膳食補充劑組合中的用途，所述可溶性甘露聚糖纖維來源于豆類種子，包括但不限于長角豆(Ceratonia siliqua)、刺云實( spinosa)、葫蘆巴(Trigonelle foenum-graecum)和瓜兒豆(Cyamopsis tetragonolobus)。一種分離工藝提供了高品質(zhì)的生理可溶的、化學改性且純化的大小均勻的甘露聚糖纖維，其不含諸如蛋白質(zhì)、生物堿(類似肥皂的發(fā)泡化學品)、糖苷生物堿(例如皂角苷配基)等天然雜質(zhì)，諸如重金屬、農(nóng)藥殘余物和微生物毒素等環(huán)境雜質(zhì)。

在一個示意性實施方案中，該純化工藝包括至少三個純化階段。根據(jù)本發(fā)明，該工藝的第一階段以混合粉狀豆類種子到半液體混合物開始，該混合在溶解的條件下進行，并且從半液體混合物中提取蛋白質(zhì)和顏料。第一階段可使堿性pH溶液、小蘇打、三磷酸鹽、洗滌劑和/或它們的混合物與粉狀豆類種子混合。堿性處理可以使用任意食品級或醫(yī)藥級的堿性溶液，其包括但不限于濃度為約0.01摩爾至約1摩爾的氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)、碳酸氫鈉(NaHCO)、碳酸鈉(Na₂CO₃)和/或三銨堿(Triammonium base)。以摩爾比計，堿與豆類種子粉末的比例可為約1:2至約1:100。

根據(jù)本發(fā)明，在該工藝的第二階段中，半液體混合物在酸中稀釋并在選定溫度下加熱一段選定時間，從而溶解礦物質(zhì)并實現(xiàn)蛋白質(zhì)和淀粉(如多糖)的部分水解。酸性稀釋劑可以為任意食品級或醫(yī)藥級的酸，其包括但不限于HCl、檸檬酸鹽、乙酸鹽、硫酸鹽或是它們的混合物，它們的濃度至多為約2摩爾并且pH值低于約pH 4.0。溫度和接觸時間可以是在大約室溫至沸點的溫度下加熱約30分鐘至約48小時的一段時間。以摩爾比計，酸與堿性混合物的比值可以為約1:2至約1:20。

根據(jù)本發(fā)明，在該工藝的第三階段中，將經(jīng)稀釋的半液體混合物與溶劑在選定溫度下混合一段接觸時間，從而使選定親脂性化合物溶解并被溶劑吸收，所述親脂性化合物包括生物堿；微生物內(nèi)毒素，例如脂多糖；真菌毒素，例如黃曲霉毒素；以及多肽、低聚糖和單糖。

在一個示意性實施方案中，調(diào)節(jié)溶劑濃度至選定濃度，此時從溶劑相中回收沉淀物形式的豆類種子甘露聚糖纖維。后續(xù)處理在產(chǎn)生純化甘露聚糖纖維的沉淀物的同時，產(chǎn)生含有污染殘余物的廢溶劑，所述污染殘余物包括片段化的蛋白質(zhì)、溶解的淀粉(如碳水化合物)、顏料、生物堿和其他種子親脂性雜質(zhì)組分，

該工藝的第三階段可包括以約1:2至約1:20的重量:重量比(wt/wt)混合所述酸化的豆類種子混合物與溶劑。該溶劑可以為任意食品級或醫(yī)藥級的極性醇或酮。在一個示意性實施方案中，該溶劑為約95％的乙醇(wt/wt)并且混合時間在約30分鐘至約600分鐘的范圍內(nèi)。在接觸時間期間，混合物的溫度在約5℃至約80℃的范圍內(nèi)。為了改善高純度纖維的回收，可通過在緩沖溶劑中重懸來重復該步驟。

根據(jù)本發(fā)明，該工藝的第四階段包括從溶劑中分離提取的甘露聚糖或纖維。在一個示意性實施方案中，這是通過離心或過濾，之后真空干燥實現(xiàn)的。然而，應當理解該分離也可通過其它工業(yè)工藝實現(xiàn)，例如旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。在一個示意性實施方案中，該階段可包括用濃度為約20％至約95％(wt/wt)的范圍內(nèi)的極性醇(乙醇)洗滌。最終干燥工藝可包括攪動、真空、團聚和篩分。在該干燥步驟中，通過真空、造粒和篩分來處理甘露聚糖纖維，從而獲得準備用于制備藥物輸送包裝或藥劑形式的膳食補充劑的粉末，所述藥物輸送包裝或藥劑例如為咀嚼片、囊片、膠囊、多漿劑(succulent)和/或濃縮液狀凝膠形式。

整個工業(yè)工藝可以按照順序或連續(xù)進料模式進行。所述的工藝可包括改進雜質(zhì)提取的添加劑，例如，向溶劑中添加食品級或醫(yī)藥級的亞硫酸鹽處理劑(例如二氧化硫氣體以及亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽和偏硫酸氫鹽的一種或多種)，或濃度為約0.01％至約0.4％(wt/wt)的過氧化氫。

在一個示意性實施方案中，公開了一種組合物，例如片劑形式的組合物。該組合物可包含、由下列物質(zhì)組成或基本上由下列物質(zhì)組成：至少一種高分子量的純化可溶性甘露聚糖。該組合物可包含、由下列物質(zhì)組成或基本上由下列物質(zhì)組成：至少一種高分子量的純化可溶性甘露聚糖以及至少一種低聚糖或/和單糖。該組合物可包含、由下列物質(zhì)組成或基本上由下列物質(zhì)組成：至少一種低分子量的純化可溶性甘露聚糖。該組合物可包含、由下列物質(zhì)組成或基本上由下列物質(zhì)組成：至少一種低分子量的純化可溶性甘露聚糖以及至少一種低聚糖或/和單糖。

該組合物可包含、由下列物質(zhì)組成或基本上由下列物質(zhì)組成：至少一種高分子量的純化可溶性甘露聚糖和至少一種低分子量的純化甘露聚糖。該組合物可包含、由下列物質(zhì)組成或基本上由下列物質(zhì)組成：至少一種高分子量的純化可溶性甘露聚糖、至少一種低分子量的純化甘露聚糖和至少一種低聚糖或/和單糖。該組合物可包含、由下列物質(zhì)組成或基本上由下列物質(zhì)組成：1-25％(wt/wt)的至少一種高分子量的第一純化可溶性甘露聚糖、20％至80％(wt/wt)的至少一種低分子量的第二純化甘露聚糖、以及40％至60％(wt/wt)的至少一種低聚糖和/或單糖。

該組合物可包含、由下列物質(zhì)組成或基本上由下列物質(zhì)組成：至少一種高分子量的純化可溶性甘露聚糖和至少一種糖醇。該組合物可包含、由下列物質(zhì)組成或基本上由下列物質(zhì)組成：至少一種低分子量的純化可溶性甘露聚糖和至少一種糖醇。該組合物可包含、由下列物質(zhì)組成或基本上由下列物質(zhì)組成：至少一種高分子量的純化可溶性甘露聚糖、至少一種低分子量的純化甘露聚糖和至少一種糖醇。該組合物可包含、由下列物質(zhì)組成或基本上由下列物質(zhì)組成：至少一種高分子量的純化可溶性甘露聚糖、至少一種低分子量的純化甘露聚糖、至少一種糖醇和至少一種低聚糖或/和單糖。所述糖醇可包括山梨醇。

附圖簡要說明

本發(fā)明公開的組合物、體系、工藝和方法在附圖中示出，所述附圖僅旨在是示意性的而不是限制性的，其中類似的符號旨在表示類似或?qū)牟糠?，其中?/p>

圖1示出了用于回收純化甘露聚糖的方法的一個實施方案的方塊流程圖；

圖2示出了甘露聚糖的化學結(jié)構(gòu)；

圖3示出了用于回收高分子量(HMW)的純化甘露聚糖的方法的一個實施方案的方塊流程圖；

圖4示出了用于回收低分子量(LMW)的純化甘露聚糖的方法的一個實施方案的方塊流程圖；

圖5示出了受試者血糖水平的圖解比較；

圖6為示出了受試者詳情的表格；

圖7為示出了3種米飯試驗餐的試驗部分的重量和常量營養(yǎng)素含量的表格；

圖8示出了試驗餐的進行次序的表格；

圖9和10示出了米飯試驗餐的受試者個體血糖濃度的表格；

圖11和12示出了米飯+3片甘露聚糖片試驗餐的受試者個體的血糖濃度的表格；

圖13和14示出了米飯+6片甘露聚糖片試驗餐的受試者個體的血糖濃度的表格；

圖15示出了在3種試驗餐的試驗階段期間收集的血液樣品中血糖濃度(mmol/L)的表格；

圖16和17示出了米飯試驗餐的受試者個體的血漿胰島素結(jié)果的表格；

圖18和19示出了米飯+3片甘露聚糖片試驗餐的受試者個體的血漿胰島素結(jié)果的表格；

圖20和21為示出了米飯+6片甘露聚糖片試驗餐的受試者個體的血漿胰島素結(jié)果的表格；

圖22示出了在3種試驗餐的試驗階段期間收集的血液樣品中血漿胰島素結(jié)果(ρmol/L)的表格；

圖23示出了含有約2g純化甘露聚糖的藥片的重金屬測試結(jié)果的表格；

圖24為示出了純化甘露聚糖的細胞毒性測試結(jié)果的圖；以及

圖25為示出了純化甘露聚糖的微生物毒素測試結(jié)果的表格。

發(fā)明詳述

本發(fā)明公開了組合物、體系、工藝和方法的詳細的實施方案，然而，應當理解所公開的實施方案僅用于示意所述的組合物、體系、工藝和方法，它們可以以各種形式實現(xiàn)。因此，本發(fā)明公開的具體功能細節(jié)不應被解釋為限制本發(fā)明，而僅用作權(quán)利要求的基礎(chǔ)，并且用于教導本領(lǐng)域技術(shù)人員以各種方式采用本發(fā)明的組合物、體系、工藝和方法的代表性基礎(chǔ)。

在一個示意性實施方案中，本發(fā)明公開了由豆類提取、純化的方法以及甘露聚糖膳食纖維(本文中也稱為“甘露聚糖”或“甘露聚糖纖維”)的組合物，所述豆類例如但不限于市售或商業(yè)化種植的豆類。純化的大小均勻的低變應原性纖維可用于提供單獨的高劑量膳食補充劑，這對實現(xiàn)整體健康優(yōu)點是重要的。例如，高劑量甘露聚糖能有效的支持血糖健康，并維持正常的血糖水平以及降低血液中的膽固醇。高劑量甘露聚糖是益生菌營養(yǎng)素，其支持有益細菌的生長并維持結(jié)腸和腸道健康的有利腸道菌群。高劑量甘露聚糖也能有效地促進健康的消化系統(tǒng)和必需營養(yǎng)素的吸收。

在一個示意性實施方案中，對豆類種子進行分離，并對分離的甘露聚糖或纖維進行純化以生成不同分子量的多糖。公開了各種可行的處理方法和工藝以使產(chǎn)率和能夠整合入可溶性補充組合物中的可溶性纖維最大化，所述組合物能夠遞送口服治療有效劑量的甘露聚糖纖維?？梢园凑枕樞蚺位蜻B續(xù)供料模式進行分離工藝。

在一個示意性實施方案中，對具有預定分子量的純的可溶性甘露聚糖纖維的提取通過以下方式完成：用酸在恒定pH和溫度下處理所述提取的豆類種子材料一段選定的接觸時間；以及在各種濃度的溶劑(例如但不限于乙醇)中分離纖維。所述溶劑(例如乙醇)可使用約25％至約65％(以重量:重量計)的濃度。然而，應當理解在本發(fā)明的范圍內(nèi)也可使用其它溶劑。

調(diào)節(jié)溶劑的濃度至選定濃度，此時豆類種子甘露聚糖纖維以沉淀物的形式從溶劑相回收。在沉淀后，將纖維放置在溶劑中、洗滌并干燥。在一個示意性實施方案中，所述沉淀的收集是通過離心或過濾、以及用乙醇酸的混合物洗滌所述纖維完成的。另外，洗滌步驟可進行第二次或額外的數(shù)次從而提高最終產(chǎn)品的純度。

參考圖1描述了根據(jù)一個示例性實施方案回收一種或多種純化甘露聚糖纖維的工藝或方法100。在該示例性實施方案中，純化甘露聚糖纖維200(圖2所示)是從豆類種子粉末回收或提取的，所述豆類種子例如但不限于阿勃勒、長角豆、刺云實、葫蘆巴和/或瓜兒豆。所述豆類種子粉末可以是市售可得的食品級或醫(yī)藥級的粉末。然而，應當理解豆類種子的任何藥學和/或營養(yǎng)學可接受的形式均適用于本發(fā)明的工藝和方法。也可使用原種，通過由原種制備粉末或薄片來實現(xiàn)甘露聚糖纖維的提取，例如使用常用工業(yè)方法和設(shè)備進行。

在一個示意性實施方案中，該工藝可分為幾個階段。第一階段可包括在能夠溶解的條件下，第一溶劑中混合或溶解豆類種子粉末以形成半液體混合物，并從半液體混合物中提取蛋白質(zhì)和顏料。第一階段可包括使堿性pH溶液、小蘇打、三磷酸鹽、洗滌劑和/或它們的混合物與豆類種子粉末合并。堿性處理可以使用堿性溶液的任意藥學和/或營養(yǎng)學可接受的形式，其包括但不限于濃度為約0.01摩爾至1摩爾的氫氧化鈉(NaOH)、氫氧化鉀(KOH)、碳酸氫鈉(NaHCO₃)、碳酸鈉(Na₂CO₃)、Na₂CO₂和/或三銨堿。堿與豆類種子粉末的比值可為約1:2至約1:100(wt/wt)，包括其中的所有范圍和子范圍。在一個示意性實施方案中，由于半液體混合物的粘度高，該提取工藝可能需要攪拌器或大功率攪拌器。

如圖1所示，如102所示，第一階段包括將豆類種子粉末溶于溶劑(如水、純凈水和/或蒸餾水)中。豆類種子粉末與溶劑的重量-體積比值可為約1:10至約1:100(wt/v)，包括其中的所有范圍和子范圍。在該示例性實施方案中，豆類種子粉末與溶劑的比值可為約1:15(wt/v)。提取工藝的溫度在約25℃至約95℃的范圍內(nèi)，包括其中的所有范圍和子范圍。在該示例性實施方案中，提取的初始溫度為約80℃至約95℃。然而，通過溶解，溫度可降低至室溫。接觸時間可以在約2小時至24小時的范圍內(nèi)，包括其中的所有范圍和子范圍。在該示例性實施方案中，所述接觸時間為約4小時。

如104所示，在溶解期間結(jié)束時，將溶劑的pH值升高至約9.0，例如通過向半液體混合物中加入氫氧化鈉和/或氫氧化鉀來實現(xiàn)。如106所示，也可向半液體混合物中加入溫和的天然洗滌劑(包括但不限于十二烷基硫酸鈉)，從而提高蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的溶解度。該提取步驟可以持續(xù)約30分鐘至約60分鐘的時間，并且可以在約37℃或更低的溫度下進行。應當理解在不脫離本發(fā)明的范圍和主旨下，可使用各種水性堿和洗滌劑混合物、溫度、接觸時間、以及豆類種子粉末與溶劑的比值，并且這樣的替換包含在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)。

在該工藝的第二階段中，半液體混合物可在酸中稀釋并在選定溫度下加熱一段選定時間，從而溶解礦物質(zhì)并實現(xiàn)蛋白質(zhì)和淀粉(如多糖)的至少部分水解。酸性稀釋劑可以為酸的任意藥學和/或營養(yǎng)學可接受的形式，其包括但不限于鹽酸(HCl)、檸檬酸鹽、乙酸鹽、和/或硫酸鹽，它們的濃度至多約2摩爾并且pH值低于約4.0。酸與堿性半液體混合物的摩爾比可以為約1:2至約1:20，包括其中的所有范圍和子范圍。溫度和暴露時間可以是在約室溫至沸點的溫度之間下加熱約30分鐘至約48小時的一段時間，包括其中的所有范圍和子范圍。如圖1所示，第二階段包括將所得半液體混合物酸化至約3的pH值(如108所示)，并在約100℃的溫度下煮沸所述半液體混合物約2小時至約5小時(如110所示)。

如112所示，在稀釋和加熱半液體混合物后，經(jīng)稀釋的混合物的pH值可任選地被調(diào)節(jié)回pH值為約9。

在該工藝的第三階段中，該經(jīng)稀釋的混合物與溶劑在選定溫度下混合一段接觸時間，從而使特定親脂性化合物溶解并被溶劑吸收，所述親脂性化合物例如但不限于：生物堿；微生物內(nèi)毒素，例如脂多糖；真菌毒素，例如黃曲霉毒素；以及肽、低聚糖和單糖。在一個示意性實施方案中，該工藝的第三階段包括將酸化的豆類種子混合物與溶劑以約1:2至約1:20(wt/wt)的比例混合，包括其中的所有范圍和子范圍。所示溶劑可以為溶劑的任意藥學或營養(yǎng)學可接受的形式，其包括但不限于極性醇和/或酮。在一個示例性實施方案中，所述溶劑為約95％的乙醇(wt/wt)，并且混合時間在約30分鐘至約600分鐘的范圍內(nèi)，包括其中的所有范圍和子范圍。在接觸時間期間，混合物的溫度在約5℃至約80℃的范圍內(nèi)，包括其中的所有范圍和子范圍。

如圖1所示，如114所示，第三階段包括向混合物中加入約50％溶劑濃度(wt/wt)的有機溶劑(例如但不限于乙醇)。在一個示意性實施方案中，將溶劑濃度調(diào)節(jié)至選定濃度，此時豆類種子甘露聚糖纖維以沉淀物的形式從溶劑相回收。這在產(chǎn)生純化甘露聚糖纖維的沉淀物的同時，生成了含有污染殘余物的廢溶劑，包含片段化的蛋白質(zhì)、溶解的淀粉(如碳水化合物)、顏料、生物堿和其它種子脂質(zhì)雜質(zhì)組分。在一個示意性實施方案中，為了改善高純度纖維的回收，可通過將回收的纖維在緩沖溶劑中重懸，重復一次或多次第三階段，例如至多五次。

在第四階段中，通過離心或過濾、然后真空干燥，從溶劑中提取沉淀的甘露聚糖纖維。然而，應當理解在本發(fā)明的范圍內(nèi)，從溶劑中提取甘露聚糖纖維可通過其他工業(yè)處理(包括旋轉(zhuǎn)蒸發(fā))來實現(xiàn)。

如圖1所示，甘露聚糖纖維沉淀，通過離心或過濾收獲或回收(如116所示)。在該示例性實施方案中，濾液包含蛋白質(zhì)、氨基酸、寡糖和單糖、脂質(zhì)、生物堿、皂素、顏料、礦物質(zhì)和其他雜質(zhì)(包括分解的有機衍生物)。固體部分為約90％(wt/wt)或更高的純的甘露聚糖纖維，此時該甘露聚糖纖維可用新鮮量的溶劑再提取一次或多次，從而使純度和回收率最大化。

在一個示意性實施方案中，如118所示，隨后可洗滌一次或多次所述回收的甘露聚糖纖維并干燥?；厥盏母事毒厶抢w維可用濃度為約20％至約95％(wt/wt)乙醇的極性醇洗滌?？赏ㄟ^真空、造粒、篩分等處理回收的甘露聚糖纖維將其進行干燥，從而獲得粉末。然而，應當理解可通過許多不同的干燥工藝對回收的甘露聚糖纖維進行干燥，所述干燥工藝包括但不限于團聚、篩分、烘干、攪動干燥、流化床干燥、冷凍干燥和真空干燥。

在該示例性實施方案中，使用真空干燥。經(jīng)干燥的甘露聚糖纖維含有約90％(wt/wt)或更高的純甘露聚糖纖維，其外觀為白色至灰白色、無臭、無味并且可溶于水。該純化甘露聚糖纖維粉末然后可用于制備藥物劑型形式或藥劑形式的膳食補充劑，所述藥物劑型形式或藥劑形式例如為(但不限于)咀嚼片、囊片、膠囊、多漿劑和/或濃縮液狀凝膠形式。

在一個示意性實施方案中，純化甘露聚糖纖維或多糖粉末被研磨為約50目至約200目的粉末，并且測試其含水量。為了利于長期穩(wěn)定性和在室溫下安全儲存，基于含水量進一步進行干燥是需要的。

當上述的提取工藝按照順序分批工藝進行時，應當理解可使用工業(yè)中的常規(guī)實踐的連續(xù)模式(如兩個或多個階段的逆流提取模式)。整個工業(yè)工藝可以按照順序或連續(xù)進料模式進行。所述工藝還可包括用于提高雜質(zhì)提取的另外的添加劑，例如但不限于，向溶劑中添加藥學和/或營養(yǎng)學可接受的亞硫酸鹽處理劑(例如但不限于二氧化硫氣體、以及亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽和焦亞硫酸鹽的一種或多種)、和/或濃度為約0.01％至約0.4％(wt/wt)的過氧化氫。

在一個示意性實施方案中，可以控制甘露聚糖的最終分子量。通過兩個步驟控制甘露聚糖的最終分子量，在pH值約3時沸騰的時間、以及在約25％、約45％和/或約65％(wt/wt)的乙醇水溶液中分離最終的純纖維。較低濃度的乙醇沉淀高分子量(HMW)纖維，例如約60kD至約300kD。較高濃度的乙醇沉淀低分子量(LMW)纖維，例如約5kD至約40kD。另外，為了制備LMW纖維，在高溫下沸騰時間或加熱時間更長。相反，為了制備HMW纖維，在高溫下沸騰時間或加熱時間更短。

參考圖3公開了根據(jù)一個示例性實施方案回收一種或多種高分子量(HMW)的純化甘露聚糖纖維的工藝或方法300。在該示例性實施方案中，從豆類種子粉末(例如阿勃勒)中回收或提取純化甘露聚糖纖維。如圖3所示，該工藝的第一階段302包括在室溫下，在約150升的水中溶解約2千克(kg)豆類種子粉末304(如步驟306所示)。將豆類種子粉末304溶解在水中后，通過加入足量的碳酸鈉(Na₂CO₃)使混合物的pH值升高至約8.2(如步驟308所示)。可通過加入足量的1摩爾氫氧化鈉(NaOH)使混合物的pH值進一步升高至約9.1，并混合所述混合物約2小時(如步驟308所示)。

如步驟312所示，溫和的天然洗滌劑也可加入到所述混合物中，從而提高蛋白質(zhì)和脂質(zhì)物質(zhì)的溶解度，所述溫和的天然洗滌劑包括但不限于十二烷基硫酸鈉(SDS)。然后可在約30℃的溫度下混合所述混合物約1小時至約2小時(如步驟314所示)。在混合所述混合物后，可通過加入足量的鹽酸(HCl)來降低pH值至約6.0(如步驟316所示)。然后可通過離心來處理所述混合物，并且可收集濾液或流過的液體(如步驟318所示)。如步驟320所示，可以丟棄收集到的沉淀物。

在該工藝的第二階段322中，將收集的濾液在酸中稀釋至pH值約3.0并在約30℃下混合(如步驟324所示)。然后可加熱該酸化的混合物并在約1atm的壓力下沸騰約30分鐘(如步驟326所示)，從而溶解礦物質(zhì)并使蛋白質(zhì)和淀粉(如多糖)至少發(fā)生部分水解。該酸稀釋劑可以為酸的任意藥學和/或營養(yǎng)學可接受的形式，包括但不限于至多約2摩爾并且pH值小于約4.0的鹽酸(HCl)、檸檬酸鹽、乙酸鹽和/或硫酸鹽。加熱后，可冷卻并過濾酸化的混合物(如步驟328所示)。如步驟330所示，可收集濾液或流過的液體。如步驟332所示，可以丟棄收集到的沉淀物。

在該工藝的第三階段334中，可向收集的濾液中加入約35％(以體積-體積比(v/v)計)的乙醇(如步驟336所示)。如步驟338所示，可混合所得混合物約15分鐘?；旌虾?，可過濾或通過離心處理混合物，并且可保留收集到的沉淀物(如步驟340所示)。如步驟342所示，可以丟棄濾液或流過的液體。

在該工藝的第四階段344中，可向收集到的沉淀物中加入在80％乙醇(wt/wt)中的約4％鹽酸(HCl)(如步驟346所示)。如步驟348所示，然后可以在室溫下攪拌所得混合物至少約30分鐘。攪拌后，可過濾或通過離心處理混合物，并且可保留收集到的沉淀物(如步驟350所示)。如步驟352所示，可以丟棄濾液或流過的液體。

在該工藝的第五階段354中，可向收集到的沉淀物中加入在80％乙醇(wt/wt)中的約4％氫氧化鈉(NaOH)(如步驟356所示)。如步驟358所示，然后可以攪拌所得混合物約30分鐘。攪拌后，可過濾或通過離心處理混合物，并且可保留收集到的沉淀物(如步驟360所示)。如步驟362所示，可以丟棄濾液或流過的液體。

在該工藝的第六階段364中，可用在80％乙醇(wt/wt)中的約4％乙酸鈉洗滌收集到的沉淀物(如步驟366所示)。如步驟368所示，然后可以攪拌所得混合物約30分鐘。攪拌后，可過濾或通過離心處理混合物，并且可保留收集到的沉淀物(如步驟370所示)。如步驟372所示，可以丟棄濾液或流過的液體。

在該工藝的第七階段374中，收集到的沉淀物可用約80％的乙醇(wt/wt)再洗滌約2次(如步驟376所示)。如步驟378所示，然后可攪拌所得混合物約30分鐘。攪拌后，可過濾或通過離心處理混合物，并且可保留收集到的沉淀物(如步驟380所示)。如步驟382所示，可以丟棄濾液或流過的液體。

在該工藝的第八階段384中，可通過真空、造粒和篩分處理收集到的沉淀物以對收集到的沉淀物進行干燥，從而獲得超過約95％固體(wt/wt)的粉末(如步驟386所示)。所述干燥的粉末含有約90％(wt/wt)或更高的純HMW甘露聚糖纖維，其外觀為白色至灰白色、無臭、無味并且可溶于水。如步驟388所示，然后對經(jīng)純化的HMW甘露聚糖纖維粉末進行包裝，并用于制備藥物劑型形式或藥物形式的膳食補充劑，所述藥物劑型形式或藥物形式例如但不限于咀嚼片、囊片、膠囊、多漿劑和/或濃縮液狀凝膠形式。

參考圖4公開了根據(jù)一個示例性實施方案回收一種或多種低分子量(LMW)的純化甘露聚糖纖維的工藝或方法400。在該示例性實施方案中，工藝400類似于上述的如圖3所示的工藝300。工藝400和工藝300的區(qū)別如下所述。根據(jù)工藝400，豆類種子粉末404為葫蘆巴。工藝400包括第二階段422，其中加熱該酸化的混合物并在約1atm的壓力下使之沸騰大于約30分鐘(如步驟426所示)，從而溶解礦物質(zhì)并使蛋白質(zhì)和淀粉(如多糖)至少發(fā)生部分水解。根據(jù)工藝400，從豆類種子粉末中回收或提取的純化甘露聚糖纖維為低分子量的。

在該示例性實施方案中，收集到的粉末含有約90％(wt/wt)或更高的純LMW甘露聚糖纖維，其外觀為白色至灰白色、無臭、無味并且可溶于水。工藝400也包括第八階段484，其中經(jīng)純化的LMW甘露聚糖纖維粉末可被包裝(如步驟488所示)，并用于制備藥物劑型形式或藥物形式的膳食補充劑，所述藥物劑型形式或藥物形式例如但不限于咀嚼片、囊片、膠囊、多漿劑和/或濃縮液狀凝膠形式。

雖然上述提取工藝可以按照順序分批工藝進行，但是應當理解可使用工業(yè)中常規(guī)實踐的連續(xù)模式(如兩個或多個階段的逆流提取模式)。還應當理解在各種來源的豆類種子或粉用作待提取的原料時，可能需要調(diào)節(jié)溫度和/或接觸時間以獲得期望的分子量。另外，為了實現(xiàn)不含過敏原且不含毒素的甘露聚糖纖維，需要進一步用溶劑洗滌。

組合物

在一個示意性實施方案中，可將純化甘露聚糖或纖維并入可溶性補充劑組合物中，所述組合物可以遞送治療有效劑量的甘露聚糖纖維。在一個示意性實施方案中，所述組合物包含至少一種高分子量的純化可溶性甘露聚糖。在一個示意性實施方案中，所述高分子量的甘露聚糖為約50kD至約300kD。在一個示意性實施方案中，所述組合物包含至少一種低分子量的純化甘露聚糖。在一個示意性實施方案中，所述低分子量的甘露聚糖為約5kD至約50kD。

在一個示意性實施方案中，所述組合物包含至少一種高分子量的純化可溶性甘露聚糖以及至少一種低分子量的純化甘露聚糖。在一個示意性實施方案中，所述組合物包含至少一種高分子量的純化可溶性甘露聚糖、至少一種低分子量的純化甘露聚糖、以及至少一種低聚糖、單糖和/或糖醇。

所述一種或多種低聚糖、單糖和/或糖醇可包括但不限于：甘露醇(Mannitol)、赤蘚糖醇(Erythritol)、山梨醇(Sorbitol)、肌醇(Inositol)、棉子糖(非還原性三糖)、半乳糖肌醇(半乳糖醇)、水蘇糖(Stachyose)、毛蕊花糖(Verbascose)、甘露三糖(Manninotriose)以及更高級的同系物。在一個示意性實施方案中，所述組合物包含約1g的至少一種高分子量的純化可溶性甘露聚糖、約2g的至少一種低分子量的純化甘露聚糖、以及約1g的糖醇。

在一個示意性實施方案中，所述組合物包含約1％至約50％(wt/wt)或約1％至約25％(wt/wt)的高分子量的純化可溶性甘露聚糖。在一個示意性實施方案中，所述組合物包含約20％至約80％(wt/wt)的低分子量的純化可溶性甘露聚糖。在一個示意性實施方案中，所述組合物包含約40％至約60％(wt/wt)的低聚糖和/或單糖。在一個示意性實施方案中，高分子量的純化可溶性甘露聚糖的粘度高。在一個示意性實施方案中，低分子量的純化可溶性甘露聚糖的溶解度高。

在一個示意性實施方案中，低分子量的甘露聚糖和高分子量的甘露聚糖的比值可為約2比1(wt/wt)、20比1(wt/wt)、并且至多為約100比1(wt/wt)，包括其中的所有范圍和子范圍。在一個示意性實施方案中，上述的組合物可任選地包括一種或多種額外的添加劑。在一個示意性實施方案中，額外的添加劑可包括一種或多種糖醇，其包括但不限于山梨醇(Sorbitol)、赤蘚醇(Erithritol)、肌醇(Inositol)以及其他類型的糖醇。其他潛在的添加劑的非限定性列表包括推薦每日所需百分比值的維生素和礦物質(zhì)(例如可參見www.USDA.gov)。

在一個示意性實施方案中，上述組合物可任選地包括或與一種或多種糖尿病藥物或藥品組合，該藥物或藥品包括但不限于吡格列酮(例如愛妥糖)、格列美脲(例如亞莫利)、羅格列酮(例如文迪雅)、艾塞那肽(例如百泌達)、格列本脲(例如達安療)、二甲雙胍(例如Glucophage)、格列本脲和二甲雙胍(例如Glucovance)、格列本脲(例如Glynase)、米格列醇(例如德賽天)、賴脯胰島素(例如優(yōu)泌樂)、低精蛋白胰島素、西他列汀(例如捷諾維)、甘精胰島素(例如來得時)、門冬胰島素(例如諾和銳)、沙格列汀(例如安立澤)、瑞格列奈(例如Prandin)、阿卡波糖(例如Precose)、那格列奈(例如使糖立釋)、利拉魯肽(例如諾和力)、以及其他類型的糖尿病藥物。

在一個示意性實施方案中，制備含有純化甘露聚糖纖維的咀嚼片形式的組合物。使用多向運動混合器來制備咀嚼片。多向運動混合器以約5轉(zhuǎn)/分鐘至約20轉(zhuǎn)/分鐘(RPM)的速率運行。在一個示意性實施方案中，該混合器具有由兩個橫軸支持的混合桶，由Y型萬向接頭連接，使得該混合桶合并旋轉(zhuǎn)、振動和滾動的動作，以在避免物質(zhì)的重力分層的同時徹底并快速的混合所述內(nèi)容物。所述混合桶為無死角的拋光不銹鋼桶類型。獨特的驅(qū)動軸伺服機制保證了低振動和低噪音的平滑和可靠的操作?；旌系木鶆蚨瘸^99.5％，并且填充系數(shù)達到約85％，優(yōu)于傳統(tǒng)旋轉(zhuǎn)混合器。最重要組件是動力驅(qū)動系統(tǒng)、數(shù)字控制系統(tǒng)和良好生產(chǎn)規(guī)范(GMP)順應性混合桶。

在一個示意性實施方案中，混合溫度在約15℃至約35℃的范圍內(nèi)，該溫度可以是恒定的。在該示例性實施方案中，用于混合的溫度為約23℃的室溫?；旌掀陂g可以在約30分鐘至約240分鐘的范圍內(nèi)。接觸時期可以為約30分鐘。

在一個示意性實施方案中，公開了依次混合方案，其中通過使用高性能V型多向運動混合器或類似的能有效混合粉末至均勻度超過99.5％的攪拌器，HMW甘露聚糖纖維被LMW甘露聚糖纖維包被或包埋在LMW甘露聚糖纖維中。通過與LMW甘露聚糖纖維的分子相互作用，HMW甘露聚糖纖維被包被，并且然后混合物或合并的甘露聚糖纖維包埋在也能提供甜味的一種或多種低聚糖和/或單糖中。在被壓制為咀嚼片時，所述組合物硬度足以用于自動包裝和常規(guī)處理，然而，在攝入和與水、唾液或其他液體接觸時，該片劑容易分解并在小于約1分鐘內(nèi)溶解，從而提供可口的膳食補充劑并且降低了食物(例如高碳水化合物食物)中的血糖指數(shù)。所述片劑也可容易地分解并在約1分鐘至約30分鐘內(nèi)溶解。

在一個示意性實施方案中，本發(fā)明的組合物可被包被從而提供功能性高和/或低分子量的甘露聚糖纖維的時間控制溶解，從而提高溶解度和可口程度，并且相對于速釋制劑的峰值模式，能在口和胃腸系統(tǒng)改善飲食性能。在一個示意性實施方案中，所述組合物可由一種或多種物質(zhì)包被，所述物質(zhì)包括但不限于：羥丙基甲基纖維素(HPMC)、甲基羥乙基纖維素(MHEC)、乙基纖維素(EC)、羥丙基纖維素(HPC)、聚維酮、羧甲基纖維素鈉、聚乙二醇(PEG)、丙烯酸酯聚合物、(不含醇的水性玉米蛋白劑型)、直鏈淀粉和淀粉衍生物，并且腸溶衣可以為：乙酸纖維素鄰苯二甲酸酯(CAP)、丙烯酸酯聚合物、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯以及本領(lǐng)域已知的其他包衣。

在一個示意性實施方案中，本發(fā)明公開的組合物用于提供或制備單獨的高劑量膳食補充劑和/或藥物，這對實現(xiàn)整體健康優(yōu)點是重要的。例如，高劑量甘露聚糖能有效地支持血糖健康，并維持正常的血糖水平以及降低血液中的膽固醇。高劑量甘露聚糖是益生菌營養(yǎng)素，能夠支持有益細菌的生長并維持結(jié)腸和腸道健康的有利腸道菌群。高劑量甘露聚糖也能有效地促進健康的消化系統(tǒng)和必需營養(yǎng)素的吸收。本發(fā)明公開的組合物可用于獸醫(yī)學或人類醫(yī)學?？赏ㄟ^口服將該組合物施用于患者或受試者?；颊呋蚴茉囌呖梢允遣溉閯游?，包括非人類的哺乳動物。本發(fā)明公開的組合物可通過口服給藥，例如以咀嚼片、囊片、膠囊、藥丸、膳食液狀凝膠單元、多漿劑的形式和/或其它類型的施用方式。

應當理解以下例子用于示例性的目的，并且不應被認為是限制性的，并且各種變形和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，并且可在不脫離本發(fā)明公開的精神和范圍下對本發(fā)明進行各種變形和修改。

實施例1

在一個示范性例子中，對疑似存在前期糖尿病情況的受試者給予含有約400kcal的淀粉和糖的組合的膳食。在餐后2小時內(nèi)監(jiān)測受試者的血糖水平。圖5記載了根據(jù)一個示例性實施方案的受試者血糖水平的圖。如圖5所示，第一數(shù)據(jù)點500為未處理的情況，而第二數(shù)據(jù)點502為處理的情況。在該示例性實施方案中，受試者在餐前攝入了約6g的純化甘露聚糖纖維混合物。第一數(shù)據(jù)點500和第二數(shù)據(jù)點502之間的比較結(jié)果清楚地表明在測試2小時內(nèi)較低的葡萄糖水平，從而指示血糖指數(shù)的降低。因此，攝入約6g的純化甘露聚糖纖維混合物導致較低的葡萄糖水平。

實施例2

在另一示例性例子中，進行了這樣的研究：相比于由等量碳水化合物份額的對照餐(普通白米飯)產(chǎn)生的反應，比較了由兩種含有純化甘露聚糖纖維的試驗餐產(chǎn)生的短期餐后血糖和胰島素反應。該研究使用了重復測量設(shè)計，使得每個受試者在兩種單獨的情況下攝入每次餐食，總共完成6次單獨的試驗階段。每個受試者在每天盡可能接近他們通常吃早餐的類似時間，完成他們在單獨工作日上午的試驗階段。

受試者

在圖6中列出了受試者的相關(guān)詳細情況，包括性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、以及種族。如圖6所示。受試者包括10個健康的、不吸煙的、超重或肥胖受試者(4個女性，6個男性)。受試者的平均年齡±SD為29.2±3.3歲(范圍：25.6-36.8歲)，并且他們的平均體重指數(shù)值±SD為27.3±1.1kg/m²(范圍：25.5-28.7kg/m²)。

所有受試者滿足以下條件：在25-65歲之間；不吸煙；在他們的身高對應的超重范圍內(nèi)具有穩(wěn)定的體重(BMI值大于25kg/m²)；具有正常的飲食習慣并且在過去3個月內(nèi)沒有或是以前沒有節(jié)食或是過分嚴格的進食；具有低至適度的體力活動的規(guī)律模式；在每個試驗階段之前能夠在當晚節(jié)食大于或等于10小時；在每個試驗階段前一天能夠避免食用豆類晚餐或避免飲用酒精；找到適合在12分鐘內(nèi)攝入的試驗食物；有社會保險或類似體系覆蓋；沒有進行厭食、體重減少的治療或是其他可能干擾新陳代謝和飲食習慣的任何形式的治療或服藥；簽署了本研究的知情同意書；沒有重大的臨床疾病或精神疾??；沒有食物過敏或嚴重的食物不耐受性；除了標準避孕藥物以外沒有規(guī)律地服用處方藥；不是正在懷孕、哺乳、試圖懷孕或使用可接受的避孕劑的女性；沒有參與另一臨床試驗或在上周內(nèi)沒有已經(jīng)參與另一臨床試驗；在納入研究前的那個月沒有經(jīng)歷全身麻醉；不處于這樣的情況：其中研究者的觀念會影響本研究的最佳參與情況或是會構(gòu)成受試者的特殊風險。

試驗食物

為受試者提供含有50g可吸收碳水化合物的固定份額的各米飯類試驗餐。所有三種試驗餐由相同份額的熟香米(Jasmine米飯，例如SunJasmine Fragrant米飯,米飯growers有限公司，澳大利亞新南威爾士州)和250mL的淡水組成。兩種試驗餐也包括在攝入米飯類餐食10分鐘前攝入三片(3)或六片(6)純化甘露聚糖纖維片劑以及250mL淡水水。在攝入用于對照餐(“米飯”)的米飯餐食10分鐘前服用一杯250mL的水。

根據(jù)本發(fā)明的純化甘露聚糖片劑的組成分別包括約2.0g的純化甘露聚糖以及約1.5g的山梨醇。因此，攝入3片純化甘露聚糖片劑的試驗餐(“米飯+3”)包括約6.0g的純化甘露聚糖以及約4.5g的山梨醇。攝入6片純化甘露聚糖片劑的試驗餐(“米飯+6”)包括約12.0g的純化甘露聚糖以及約9g的山梨醇。

圖7中示出了三種試驗餐(米飯、米飯+3和米飯+6)中等量碳水化合物份額中的常量營養(yǎng)素含量，使用制造商的數(shù)據(jù)計算。如圖7所示，所有三種餐食包括食物分量約63g的干米飯，其包含約4.6g的蛋白質(zhì)、約0.3g的脂肪、約50g的可利用的碳水化合物、約0.4g的纖維以及約932kJ的能量。

試驗食物的食用

由10個受試者在兩種獨立的情況下分別食用3種米飯試驗餐(米飯、米飯+3和米飯+6)。因此，每個受試者完成6個單獨的試驗階段。根據(jù)圖8所示的列表以隨機的順序為受試者各自提供6次試驗餐。在攝入米飯試驗餐10分鐘前，受試者需要攝入250mL的水(對照米飯餐)、或根據(jù)本發(fā)明的3片純化甘露聚糖片劑和250mL的水(米飯+3餐)、或根據(jù)本發(fā)明的6片純化甘露聚糖片劑和250mL的水(米飯+6餐)。在沒有任何商品包裝的標準白瓷盤(white china plate)上提供給受試者所有的試驗餐。因此，可以認為受試者無法準確識別試驗餐中包括的米飯或純化甘露聚糖片劑。

根據(jù)制造商的說明在即將食用前準備每餐的米飯部分。在過量水中使用溫和煮沸法在灶臺上獨立烹飪試驗部分的干米飯。在烹調(diào)過程中偶爾攪拌米飯部分，然后撈出并盛在白色瓷碗中提供給受試者。同時食用各米飯部分與250mL的淡水。一旦受試者開始進食，用秒表來對該2小時試驗階段的過程進行計時。指示受試者在12分鐘內(nèi)以舒服的速度食用所有提供給他們的食物和液體。

試驗方案

在每個試驗階段的前一天，受試者需要整天避免飲酒并且避免不平常水平的食物攝取和體力活動。當晚，他們需要進食低脂肪、富含碳水化合物的非豆類的食物的晚餐，之后受試者需要整晚禁食至少10小時直到第二天上午的試驗階段開始。在禁食期間，他們只被允許飲用水。

第二天上午，受試者在禁食條件下向研究中心報告。研究者首先檢查自上次試驗階段以來每個受試者感覺良好并且沒有服用任何藥物，并且能夠完成全部的前述試驗要求。然后記錄每個受試者的體重(受試者穿著衣服但是未穿外套和鞋)，之后他們在一桶熱水中暖手1至2分鐘。然后使用無菌自動柳葉刀裝置(例如德國Boehringer Mannheim公司)從指尖獲得兩個空腹指尖血樣中的第一個(-10分鐘)(≥0.7mL的毛細血管血，取決于血流和血細胞比容水平)。然后為受試者分別提供米飯和250mL的水(對照米飯餐)、或米飯以及3片純化甘露聚糖片劑和250mL的水(米飯+3餐)、或米飯以及6片純化甘露聚糖片劑和250mL的水。他們需要在5分鐘內(nèi)攝入該試驗部分。10分鐘后，受試者再次在熱水中暖手另外的1分鐘，之后獲得另一個空腹血樣(0分鐘)。

獲得該空腹血樣后，受試者在安靜的房間中坐在桌子旁，并且為他們提供固定份額的白米飯，所述白米飯是以舒服的速率在12分鐘內(nèi)與250mL的水一起食用的。一旦每個受試者開始進食就啟動秒表(0分鐘)。受試者被指示需要攝入提供給他們的所有水和食物，之后要求他們留坐在研究中心，并且在接下來的2小時內(nèi)不能另外進食或飲用。在進食開始后15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘和120分鐘時收集另外的指尖血樣。在每次取血樣前受試者需要在熱水中暖手1至2分鐘。因此，在試驗階段中從每個受試者共收集了8個血樣。完成120分鐘試驗階段后，受試者在離開研究中心前能自由進食一些茶點。

確定血糖濃度和胰島素濃度

將每個血樣收集在1.5-mL塑料微量離心管中，所述微量離心管含有10個國際單位(IU)的抗凝劑、肝素鈉鹽(例如，第II級，SigmaChemical化學公司，澳大利亞新南威爾士州卡斯爾山市)。收集血樣后立即通過小心倒轉(zhuǎn)該管使血樣與抗凝劑混合，并在室溫下以12,500x g的速率離心0.5分鐘至1.0分鐘。然后立即將血漿轉(zhuǎn)移入帶有標記的無涂層的塑料微量離心管中，然后在分析前在-20℃下儲存。

測量血糖濃度

使用Roche/Hitachi自動分光光度離心分析儀(例如Boehringer Mannheim公司，德國Mannheim市)采用葡萄糖己糖激酶/葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶分析儀(例如澳大利亞Boehringer Mannheim公司，澳大利亞新南威爾士州卡斯爾山市)測量血糖濃度，2次重復。在相同的檢驗程序中分析單個受試者試驗階段中所有8個血樣。使用標準振蕩器和內(nèi)標(如CFAS、Precinorm S和Precinorm U，澳大利亞Boehringer Mannheim公司)進行每次程序。如果單個血樣的兩次重復值的差大于0.3mmol/L，則對該樣品另外再次分析2次，并且采用2至3個最接近的濃度來計算該樣品的平均血糖濃度。

測量血漿胰島素濃度

使用固相的抗體包被的放射免疫分析試劑盒(例如Diagnostic Products公司，美國加利福尼亞州洛杉磯市)測量血漿胰島素濃度。在整個研究中收集到的每個受試者的所有血樣在相同的檢驗程序中使用內(nèi)標進行分析。通過轉(zhuǎn)化觀測到的放射性計數(shù)，使用由已知的胰島素濃度標準生成的校正曲線來計算每個血漿樣品的最終胰島素濃度。在每個檢驗程序使用兩套標準。

數(shù)據(jù)分析

在每個2小時試驗階段的8個時間點記錄每個血樣的兩次重復的血糖濃度，使用它們的平均值作為受試者血糖濃度。對于每個受試者，使用梯形算法結(jié)合基線來計算每次試驗餐的2小時血糖應答曲線下的面積增值(iAUC)，空腹值在零處截短?；€值為兩次空腹血樣(-10和0分鐘)的平均濃度。忽略空腹水平下的任何負值區(qū)域。iAUC值可以允許比較固定時期內(nèi)試驗餐的整合效果。使用與上述對血糖iAUC列出的相同方法計算每個受試者的試驗餐的血漿胰島素應答曲線下的面積增值。

當在本研究過程中獲得時，在電子數(shù)據(jù)表(例如 Excel 2004軟件，微軟公司)中輸入原始的血糖和血漿胰島素結(jié)果。一旦完成數(shù)據(jù)輸入后，計算血糖和胰島素應答曲線下的面積增值。然后將電子數(shù)據(jù)表中的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)入另一計算機程序文件(例如 software，第4.02版，1993年，Abacus concepts公司，美國加利福尼亞州伯克利市)，從而計算血糖和胰島素iAUC反應的描述性統(tǒng)計學(包括平均數(shù)、中位數(shù)、標準偏差(SD)和平均標準誤(SEM))。

使用重復測量方差分析(ANOVA)來確定三種米飯試驗餐的平均血糖和胰島素iAUC反應之間是否存在任何顯著差異。如果發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學顯著的乘積效應(product-effect)，進行事后多重比較檢驗來確定具體的顯著差異。對于正態(tài)分布數(shù)據(jù)，使用Fisher PLSD檢驗作為事后檢驗。

結(jié)果

在研究中未報導或觀測到嚴重的副作用，并且沒有受試者報告服用了除純化甘露聚糖片劑之外的任何藥物。每個2小時的試驗階段持續(xù)進行而不發(fā)生其他事件。類似地，沒有任何受試者過早地脫離該研究。2個受試者報告在含有最高劑量(6片)的純化甘露聚糖片劑的2小時試驗階段之后有輕微的腸胃不適。這些受試者報告了在含有6片純化甘露聚糖片劑劑量的試驗階段的下午有輕度胃痛和/或腹瀉。所有10個受試者報告由于片劑的味道和片劑大小，很難攝入更大劑量的純化甘露聚糖片劑。

血糖反應

圖9至14中示出了10個受試者的每次試驗餐的單獨血糖濃度以及他們對應的血糖iAUC值。圖9和10為示出了對于米飯餐的受試者個體的血糖濃度。圖11和12為示出了對于米飯+3餐的受試者個體的血糖濃度。圖13和14示出了對于米飯+6餐的受試者個體的血糖濃度。

參照如圖15所示的葡萄糖iAUC值，對照餐(米飯)在30分鐘時產(chǎn)生最大峰值血糖濃度以及最大的整體血糖反應。圖15示出了在3種試驗餐的2小時試驗階段期間收集的8個血液樣品中絕對血糖濃度的平均值±SEM值(mmol/L，重復2次)以及食物的2小時血糖應答曲線下的平均面積增值(iAUC)。0分鐘時列出的結(jié)果為兩個空腹血樣(-10和0分鐘)的平均值。

由含有米飯和純化甘露聚糖片劑的兩種試驗餐產(chǎn)生的整體血糖反應在整個120分鐘試驗階段類似。米飯+3和米飯+6試驗餐都能在30分鐘時使血糖穩(wěn)定升高至中度峰值反應，之后是在30分鐘至120分鐘之間血糖反應的逐漸下降。相比于米飯+3餐，米飯+6餐在整個120分鐘試驗期間的每個時間點產(chǎn)生更小的血糖濃度，從而產(chǎn)生更低的整體血糖反應。

血漿胰島素反應

圖16至21示出了10個受試者的試驗餐的單個血漿胰島素反應以及胰島素iAUC值。圖16和17示出了對于米飯餐的受試者個體的血漿胰島素濃度。圖18和19示出了對于米飯+3餐的受試者個體的血漿胰島素濃度。圖20和21示出了對于米飯+6餐的受試者個體的血漿胰島素濃度。

圖22示出了對于3種米飯餐的平均血漿胰島素濃度。圖22示出了在試驗餐的2小時試驗階段期間收集的8個血液樣品中絕對血漿胰島素濃度的平均值±SEM值(pmol/L)以及2小時血漿胰島素應答曲線下的平均面積增值(iAUC)。0分鐘時列出的結(jié)果為兩個空腹血樣(-10和0分鐘)的平均值。

參照如圖22所示的胰島素iAUC值，如預期的那樣，由于高血糖反應，對照食物(米飯)產(chǎn)生血漿胰島素濃度的較大升高以及最大的整體血漿胰島素反應。由米飯+3和米飯+6這兩種試驗餐產(chǎn)生的胰島素反應在整個試驗階段類似。這兩種餐都能使血漿胰島素濃度在30分鐘時穩(wěn)定升高至峰值反應，之后是在30分鐘至120分鐘之間胰島素濃度逐漸下降。與對應的血糖反應類似，相比于米飯+3餐，米飯+6餐產(chǎn)生更小的峰值以及整體胰島素反應。完成120分鐘試驗期間時，三種米飯餐的平均血漿胰島素水平仍然高于空腹基線水平。

平均iAUC反應

參與研究的受試者之間的餐后血糖和胰島素iAUC反應各不相同。不同人群對相同食物的反應不同是正常的，并且是由各種因素引起的，所述因素包括受試者以不同的速率攝入食物、單獨測試食物部分的營養(yǎng)素含量不同、受試者碳水化合物代謝的不同、以及生活方式和基因因素。

使用參數(shù)統(tǒng)計檢驗(例如重復測量ANOVA和Fisher PLSD檢驗)來確定米飯試驗餐的血糖和胰島素iAUC反應之間是否有任何顯著差異。

米飯餐的平均血糖iAUC反應的單因素重復測量ANOVA表明，平均iAUC值之間存在顯著差異(p＝0.0001)。事后檢驗(例如FisherPLSD檢驗)結(jié)果表明對照餐(米飯)的平均iAUC反應顯著高于米飯+3片劑(p<0.01)和米飯+6片劑(p<0.001)的平均血糖反應。還發(fā)現(xiàn)米飯+3片劑餐的平均血糖iAUC反應顯著高于米飯+6片劑的平均血糖反應(p<0.05)。

米飯餐的平均血漿胰島素反應的單因素重復測量ANOVA表明，平均iAUC反應之間存在顯著差異(p＝0.0009)。米飯餐的平均血漿胰島素iAUC反應顯著高于米飯+3片劑(p<0.05)和米飯+6片劑(p<0.001)的平均胰島素反應。含有純化甘露聚糖片劑的兩種試驗餐的平均血漿胰島素反應之間未檢測到顯著差異。

試驗食物的血糖和胰島素iAUC反應之間的關(guān)系

使用線性回歸分析來確定試驗餐的單個受試者的血糖和胰島素反應之間的相關(guān)程度。一般而言，米飯試驗餐的血糖反應與它們對應的胰島素反應顯著相關(guān)(r＝0.78，n＝60，p＝0.0001)。

結(jié)論

本研究表明，在攝入高碳水化合物食物前攝入含有本發(fā)明的純化甘露聚糖纖維的組合物的片劑能顯著降低對該餐食的餐后血糖和胰島素反應。相比于僅食用白米飯，較低劑量的純化甘露聚糖(即含有6g甘露聚糖和4.5g的山梨醇的3個片劑)導致餐后血糖降低19％且餐后胰島素反應降低16％。相比于白米飯對照餐，較高劑量的純化甘露聚糖(即含有12g甘露聚糖和9g山梨醇的6片片劑)導致2小時血糖反應降低32％且餐后胰島素反應降低24％。

實施例3

毒性測試

在一個示意性實施方案中，上述的純化步驟降低二噁英的含量至低于0.01mg/kg，人類食用該水平被認為是安全的。在來源于印度或在印度交付的瓜爾膠的某些批次中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高水平的五氯苯酚和二噁英，是通常認為的正常背景污染水平的約1000倍。如果不采取措施來避免瓜爾膠中五氯苯酚(PCP)和二噁英的存在，這種污染將構(gòu)成對公眾健康的威脅。在一個示意性實施方案中，測試表明本發(fā)明的產(chǎn)品或純化甘露聚糖纖維不含有高于0.01mg/kg的五氯苯酚(PCP)。類似地，該工藝對微生物毒素和重金屬也是有效的，從而使產(chǎn)品對人類和非人類的食用都是安全的。

在一個示意性實施方案中，檢驗本發(fā)明的純化甘露聚糖纖維的重金屬。如圖23所示，使用GB/T 5009.137-2003測試法，檢驗含有根據(jù)本發(fā)明的約2g純化甘露聚糖的咀嚼片中的銻。結(jié)果表明該咀嚼片中含有低于約1mg/kg的銻。使用GB/T 5009.11-2003測試法，檢驗咀嚼片中的砷。結(jié)果表明該咀嚼片中含有低于約1.4mg/kg的砷。使用GB/T5009.15-2003測試法，檢驗咀嚼片中的鎘。結(jié)果表明該咀嚼片中含有低于約1mg/kg的鎘。使用GB/T 5009.123-2010測試法，檢驗咀嚼片中的鉻。結(jié)果表明該咀嚼片中含有低于約1mg/kg的鉻。使用GB/T5009.12-2010測試法，檢驗咀嚼片中的鉛。結(jié)果表明該咀嚼片中含有低于約6mg/kg的鉛。使用GB/T 5009.17-2003測試法，檢驗咀嚼片中的汞。結(jié)果表明該咀嚼片中含有低于約0.5mg/kg的汞。還使用GB/T5009.16-2003測試法，檢驗咀嚼片中的錫。結(jié)果表明該咀嚼片中含有低于約6mg/kg的錫。

在一個示意性實施方案中，使用(例如)乳房組織細胞培養(yǎng)測試根據(jù)本發(fā)明的純化甘露聚糖纖維的細胞毒性。細胞毒性生物檢驗工藝包括：在含有約0.25％的熱滅活胎牛血清(HI-FBS，如Gibco lot#1297785)以及4x青霉素鏈霉素(Pen/Strep)的檢驗培養(yǎng)基中將細胞重懸。細胞重懸后，向檢驗板的每個孔中移入約100μL的生長中的培養(yǎng)細胞(5,000細胞/孔)。在檢驗管中將測試樣品用不含Pen/Strep的檢驗培養(yǎng)基進行依次稀釋，重復2次。向細胞中加入約100μL的依次稀釋的樣品。每孔的最終體積為約200μL，含有約2x Pen/Strep。然后孵育細胞約137小時。孵育后，向每孔中加入約20μL的Promega Substrate Cell Titer 96單水溶液試劑。然后在約37℃下孵育樣品，并在490nm下測量光密度(OD)。對結(jié)果作圖并計算ID50(導致降低50％生長的抑制濃度)。結(jié)果以圖示的形式在圖24中示出。如圖24所示，純化甘露聚糖沒有細胞毒性。喜樹堿(CPT)與乳房組織細胞一起用作對照。

在一個示意性實施方案中，測試根據(jù)本發(fā)明的純化甘露聚糖纖維的神經(jīng)毒性。使用膠質(zhì)細胞(例如 CCL-107^TM)和神經(jīng)母細胞瘤細胞(例如 HTB-11^TM)進行神經(jīng)毒性檢驗。將之前儲存在約-200℃下的細胞復蘇，并在檢驗培養(yǎng)基(例如5％HI-FBS-Gibco lot#1393129)中培養(yǎng)。在含有5％HI-FBS的不含細胞因子的檢驗培養(yǎng)基(例如Gibco lot#1393129)中以20,000細胞/100μL重懸所述細胞。向檢驗板的每個孔(例如96孔形式)中移入約100μL的細胞。向每個孔中加入約20μL的神經(jīng)生長因子溶液，并在約37℃下孵育約20小時。在生長培養(yǎng)基中的神經(jīng)生長因子(例如，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF))溶液含有用于優(yōu)化生長的5％HI-FBS。

在另一板中，在檢驗培養(yǎng)基中以1:3的稀釋比例依次稀釋樣品，重復2次。向檢驗板的每個孔中的細胞轉(zhuǎn)入約100μL樣品，并在約37℃下孵育約24小時。向每個孔中加入約20μL的Promega'CellTiter 單水溶液，并在約37℃下孵育。測量在OD 490nm下的結(jié)果。相對于陰性對照和陽性對照(加入10μg/mL甲氨蝶呤)分析增殖數(shù)據(jù)。然后通過Probit回歸分析確定IC50值。結(jié)果表明純化甘露聚糖纖維不具有神經(jīng)毒性。純化甘露聚糖纖維在超過5mg/mL的濃度時沒有建立IC50值，其中已知神經(jīng)毒素和細胞毒素的IC50水平為微克/mL和納克/mL。

在一個示意性實施方案中，測試本發(fā)明的純化甘露聚糖纖維的微生物毒素。使用(Charles River實驗室)進行總微生物毒素的檢驗。臨界內(nèi)毒素檢測結(jié)果對確定安全生產(chǎn)是至關(guān)重要的，并且對安全的治療產(chǎn)品的投放是必要的。使用能夠利用FDA許可的一次性藥盒的手持式分光光度計，以精確、方便地進行內(nèi)毒素測試?；?5分鐘內(nèi)的測試結(jié)果，制備和投放能夠迅速進行而沒有延遲。圖25示出了對純化甘露聚糖纖維的檢驗，表明總微生物毒素低于檢測限，例如低于0.5EU/mL，以及低于0.0083EU/mg。

雖然已經(jīng)結(jié)合某些實施方案記載并且示意了本發(fā)明公開的組合物、體系、工藝和方法，但是各種改變和修改對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，并且可在不脫離本發(fā)明公開的精神和范圍下對本發(fā)明進行各種改變和修改。由于這些改變和修改旨在包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)，因此本發(fā)明公開的組合物、體系、工藝和方法不受限于上述方法學或構(gòu)造的具體細節(jié)。