本發(fā)明涉及飼料添加劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種海參飼料添加劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
：海參屬于棘皮動(dòng)物門，海參綱。海參綱是刺皮動(dòng)物門中最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的一個(gè)綱，種類很多，全球有1100余種。我國海域有100多種，其中可食用的有20余種。海參具有極高的滋補(bǔ)和藥用價(jià)值，其體內(nèi)含有52種對(duì)人體有益的營養(yǎng)成份，且合理均衡，是一種高蛋白、低糖、低脂肪、無膽固醇的營養(yǎng)保健食品，其主要成份刺參粘多糖和刺參素，有抗輻射、抗腫瘤、抗凝血、抗衰老的作用。隨著人民生活水平的提高和海參在醫(yī)療保健中的進(jìn)一步開發(fā)利用，海參的需求量大幅上升，帶動(dòng)了海參養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。80年代突破海參人工苗種繁育技術(shù)，苗種培育達(dá)到規(guī)模化水平，海參養(yǎng)殖規(guī)模迅猛發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大。但是，目前在海參養(yǎng)殖過程中存在著諸多不足和難題，如稚參的病害死亡問題、生長緩慢問題、高營養(yǎng)飼料的缺乏等。隨著刺參養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大，刺參病害也日益顯著，預(yù)防不當(dāng)會(huì)給刺參養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的損失，解決刺參病害已經(jīng)成為一個(gè)迫在眉睫的課題。一些海參養(yǎng)殖戶為防治病蟲害，在養(yǎng)殖海參的水池內(nèi)加入抗生素；為促進(jìn)海參快速生長，在飼料中添加生長激素等；這勢(shì)必會(huì)帶來細(xì)菌耐藥性、藥物殘留和環(huán)境污染等問題。海參養(yǎng)殖業(yè)做為我國海水養(yǎng)殖業(yè)的第四次浪潮，來勢(shì)迅猛，發(fā)展前景良好。在突破育苗技術(shù)后，海參配合飼料及專用添加劑的開發(fā)應(yīng)用成為海參養(yǎng)殖業(yè)大發(fā)展的技術(shù)瓶頸。尤其是海參天然物飼料添加劑的開發(fā)和實(shí)際應(yīng)用成功實(shí)例還很少見。近年來，人類呼喚健康，渴望回歸自然，迫切需要綠色食品的呼聲越來越高，這當(dāng)中自然也包括綠色畜產(chǎn)品和水產(chǎn)品，而這些綠色水產(chǎn)品是需要綠色飼料及添加劑來實(shí)現(xiàn)的，因此，無污染、無殘留、無抗藥性、無毒副作用的營養(yǎng)保健綠色飼料添加劑成為當(dāng)今及未來研究含非藥物綠色飼料添加劑取代抗生素促生長劑的主要潮流。許多天然物兼有營養(yǎng)性和藥物性的雙重作用，既能夠促進(jìn)糖代謝、促進(jìn)蛋白質(zhì)和酶的合成，又能增強(qiáng)機(jī)體抗體效價(jià)、刺激性腺發(fā)育，具有抑菌殺菌、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能以及非特異性抗菌作用。天然物飼料添加劑較之抗生素、化學(xué)合成類飼料添加劑有幾個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)它不但能直接殺菌、抗菌，而且能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫機(jī)能；幾乎無有害殘留且其中一些物質(zhì)具有促攝食助消化的作用。因此開發(fā)應(yīng)用海參天然物調(diào)節(jié)型飼料添加劑成為促進(jìn)海參育苗、池塘養(yǎng)、殖工廠化養(yǎng)殖大發(fā)展的必然趨勢(shì)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種海參飼料添加劑及其制備方法，可顯著促進(jìn)海參的生長，提高免疫力及抗病毒能力。食用本發(fā)明添加劑后的海參抗病力強(qiáng)，生長速度快，極大增加了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益，具有配方簡單、科學(xué)、合理，綠色無殘留，實(shí)用性強(qiáng)，無毒副作用，效果顯著的優(yōu)點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種海參飼料添加劑，所述添加劑包括以下組分：大鯢油、蟬蛻、桑椹、蠶沙、佛手瓜、蘆筍、百合、茭白、鐵釘菜、石莼、松花粉、甘草、跳八丈、蕓薹子、鈕子七、黑芝麻、油菜花粉和醋蛋液。所述添加劑包括以下重量份的組分：大鯢油0.4-0.6份、蟬蛻14-20份、桑椹20-30份、蠶沙10-14份、佛手瓜14-22份、蘆筍20-25份、百合10-15份、茭白16-21份、鐵釘菜40-55份、石莼45-50份、松花粉8-12份、甘草8-12份、跳八丈0.3-0.6份、蕓薹子0.4-0.7份、鈕子七0.2-0.5份、黑芝麻20-25份、油菜花粉10-15份和醋蛋液15-20份。所述添加劑包括以下重量份的組分：大鯢油0.4份、蟬蛻20份、桑椹25份、蠶沙14份、佛手瓜18份、蘆筍25份、百合13份、茭白21份、鐵釘菜40份、石莼50份、松花粉9份、甘草11份、跳八丈0.6份、蕓薹子0.7份、鈕子七0.2份、黑芝麻20份、油菜花粉10份和醋蛋液18份。所述添加劑包括以下重量份的組分：大鯢油0.6份、蟬蛻14份、桑椹30份、蠶沙10份、佛手瓜22份、蘆筍20份、百合15份、茭白16份、鐵釘菜48份、石莼45份、松花粉8份、甘草8份、跳八丈0.3份、蕓薹子0.5份、鈕子七0.4份、黑芝麻22份、油菜花粉15份和醋蛋液20份。所述添加劑包括以下重量份的組分：大鯢油0.5份、蟬蛻16份、桑椹20份、蠶沙12份、佛手瓜14份、蘆筍23份、百合10份、茭白17份、鐵釘菜55份、石莼47份、松花粉12份、甘草12份、跳八丈0.4份、蕓薹子0.4份、鈕子七0.5份、黑芝麻25份、油菜花粉13份和醋蛋液15份。為了更好地實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的本發(fā)明還提供一種海參飼料添加劑的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：(1)取大鯢體內(nèi)的脂肪組織，切碎，清洗干凈，加入脂肪組織質(zhì)量5-7倍的去離子水，武火煮沸后，改文火煮5-6h，把所得到的油液過濾、去渣、離心，取上清油液，得到大鯢油；(2)取雞蛋若干個(gè)，加入雞蛋質(zhì)量3倍的6°米醋，密封浸泡1周后，啟封將雞蛋清與雞蛋黃與醋攪勻，繼續(xù)密封2天后，過濾取濾液得到醋蛋液；(3)將蟬蛻粉碎，將蠶沙粉碎，按所述質(zhì)量份數(shù)取大鯢油、黑芝麻、醋蛋液、粉碎后的蟬蛻和蠶沙,混合均勻后放置15-18h得混合物一；(4)按所述質(zhì)量份數(shù)比例取桑椹、佛手瓜、蘆筍、百合、茭白、鐵釘菜、石莼、甘草、跳八丈、蕓薹子、鈕子七混合，加入相對(duì)于混合物10～12倍的醇體積濃度為90％～95％的乙醇，加熱至沸騰回流3～5小時(shí)，過濾，收集濾液，隨后在真空度0.05～0.08Mpa下減壓濃縮至40～50℃時(shí)相對(duì)密度為1.00～1.04的膏體，噴霧干燥，噴霧干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度150～165℃、出風(fēng)溫度80～85℃，隨后粉碎成粉末，制成干膏粉；(5)取按比例取所述質(zhì)量份松花粉、油菜花粉與步驟(3)得到的混合物一，步驟(4)得到的干膏粉混合均勻得到海參飼料添加劑。本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是：本發(fā)明的添加劑可以顯著提高海參的免疫力，促進(jìn)海參的生長速度。而且通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)添加了本發(fā)明的添加劑后喂養(yǎng)的海參肉質(zhì)更加鮮美。本發(fā)明具有配方簡單、科學(xué)、合理，綠色無殘留，實(shí)用性強(qiáng)，無毒副作用，效果顯著的優(yōu)點(diǎn)。具體實(shí)施方式本發(fā)明提供一種海參飼料添加劑及其制備方法，所述添加劑包括以下組分：大鯢油、蟬蛻、桑椹、蠶沙、佛手瓜、蘆筍、百合、茭白、鐵釘菜、石莼、松花粉、甘草、跳八丈、蕓薹子、鈕子七、黑芝麻、油菜花粉和醋蛋液。松花粉：松花粉，中藥名。為松科植物馬尾松、油松或同屬數(shù)種植物的干燥花粉。春季花剛開時(shí)，采摘花穗，曬干，收集花粉，除去雜質(zhì)。蟬蛻：別名蟬退、蟬衣、蟲蛻、蟬殼、蚱蟟皮、知了皮，金牛兒。本品為蟬科昆蟲黑蚱的幼蟲羽化時(shí)脫落的皮殼。甘，寒。歸肺、肝經(jīng)。散風(fēng)除熱，利咽，透疹，退翳，解痙。用于風(fēng)熱感冒，咽痛，音啞，麻疹不透，風(fēng)疹瘙癢，目赤翳障，驚風(fēng)抽搐，破傷風(fēng)。桑椹：本品為?？浦参锷５母稍锕搿８?、酸，寒。歸心、肝、腎經(jīng)。補(bǔ)血滋陰，生津潤燥。用于眩暈耳鳴，心悸失眠，須發(fā)早白，津傷口渴，內(nèi)熱消渴，血虛便秘。蠶沙：別名原蠶屎、晚蠶沙、蠶砂、原蠶沙、馬鳴肝、晚蠶矢、二蠶沙、蠶屎。味甘；辛；性溫。歸肝；脾；胃經(jīng)。祛風(fēng)除濕；和胃化濁；活血通經(jīng)。主風(fēng)濕痹痛；肢體不遂；風(fēng)疹瘙癢；吐瀉轉(zhuǎn)筋；閉經(jīng)；崩漏。佛手瓜：佛手瓜(學(xué)名：Sechiumedule)，又名隼人瓜、安南瓜、壽瓜、豐收瓜、洋瓜、合手瓜、捧瓜等，是一種葫蘆科佛手瓜屬植物。原產(chǎn)于墨西哥、中美洲和西印度群島，1915年傳入中國，在中國江南一帶都有種植，以云南、浙江、福建、廣東、臺(tái)灣最多。佛手瓜清脆，含有豐富營養(yǎng)。每千克鮮瓜中含蛋白質(zhì)5克、脂肪1克、纖維素30克、碳水化合物77克，還含有維生素C220毫克，核黃素0.1毫克，含鈣500毫克、磷320毫克、鐵40毫克。佛手瓜既可做菜，又能當(dāng)水果生吃。蘆筍：蘆筍(學(xué)名：Asparagusofficinalis)又名石刁柏，為天門冬科天門冬屬(蘆筍屬)多年生草本植物石刁柏.的可食用部分。別名石刁柏、龍須菜，青蘆筍。涼，甘、苦。潤肺鎮(zhèn)咳，祛痰殺蟲。百合：別名白百合(《日華子本草》)，蒜腦薯(《綱目》)。為百合科植物百合、細(xì)葉百合、麝香百合及其同屬多種植物鱗莖的鱗葉。甘微苦，平。入心、肺經(jīng)。潤肺止咳，清心安神。治肺費(fèi)久嗽，咳唾痰血；熱病后余熱來清，虛煩驚悸，神志恍惚；腳氣浮腫。茭白：又名高瓜、菰筍、菰手、茭筍，高筍。是禾本科菰屬多年生宿根草本植物。茭白：甘，涼。茭白：清熱除煩。石莼：石莼UlvalactucaL.屬于綠藻門，石莼目，石莼科，石莼屬。亦稱海白菜、海青菜、海萵苣、綠菜、青苔菜、綸布，屬常見海藻。片狀，近似卵形的葉片體由兩層細(xì)胞構(gòu)成，高10—40厘米，鮮綠色，基部以固著器固著于巖石上，生活于海岸潮間帶，生長在海灣內(nèi)中、低潮帶的巖石上，東海、南海分布多、黃海、渤海稀少。主治下水，利小便；治風(fēng)秘不通，五膈氣，小腹結(jié)氣，可煮湯飲用。鐵釘菜:別名鐵線草、剪刀菜、鐵菜、搖鼓鈴。為鐵釘菜及葉狀鐵釘菜的藻體。咸；寒。歸肝經(jīng)。軟堅(jiān)散結(jié)；解毒；驅(qū)蛔。主頸淋巴結(jié)腫；甲狀腺腫；喉炎；蛔蟲病。甘草：甘，平。歸心、肺、脾、胃經(jīng)。補(bǔ)脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調(diào)和諸藥。用于脾胃虛弱，倦怠乏力，心悸氣短，咳嗽痰多，脘腹、四肢攣急疼痛，癰腫瘡毒，緩解藥物毒性、烈性。跳八丈：別名藤子杜仲、銀絲杜仲、軟皮樹、橡膠藤、臭匙羹藤。蘿藦科匙羹藤屬植物華寧藤，以根入藥。味辛、澀，性微溫。舒筋活血，安胎止痛。用于跌打損傷，風(fēng)濕骨痛，腰痛，胎動(dòng)不安，腎炎，閉經(jīng)，痛經(jīng)。蕓薹子：別名油菜子。為十字花科植物油菜的種子。辛；甘；平。肝；腎經(jīng)。活血化瘀；消腫散結(jié)；潤腸通便。鈕子七：別名珠子參、大葉三七、竹節(jié)人參、扣子七、疙瘩七、盤七。五加科人參屬植物大葉三七，以根狀莖入藥。秋季采集，洗凈曬干。味苦、微甘，性溫。祛瘀生新，止痛止血。用于跌打損傷，風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛，胃痛；外用治外傷出血。黑芝麻：別名芝麻、油麻、巨勝。脂麻科植物脂麻的成熟種子。性平，味甘。歸肝經(jīng)、腎經(jīng)、大腸經(jīng)。補(bǔ)肝腎、益精血、潤腸燥。以下采用實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方式，借此對(duì)本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題，并達(dá)成技術(shù)效果的實(shí)現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實(shí)施。實(shí)施例1添加劑1一種海參飼料添加劑，所述添加劑包括以下重量份的組分：大鯢油0.4克、蟬蛻20克、桑椹25克、蠶沙14克、佛手瓜18克、蘆筍25克、百合13克、茭白21克、鐵釘菜40克、石莼50克、松花粉9克、甘草11克、跳八丈0.6克、蕓薹子0.7克、鈕子七0.2克、黑芝麻20克、油菜花粉10克和醋蛋液18克。所述制備方法包括以下步驟：(1)取大鯢體內(nèi)的脂肪組織，切碎，清洗干凈，加入脂肪組織質(zhì)量6倍的去離子水，武火煮沸后，后改文火煮6h，把所得到的油液過濾、去渣、離心，取上清油液，得到大鯢油；(2)取雞蛋若干個(gè)，加入雞蛋質(zhì)量3倍的6°米醋，密封浸泡1周后，啟封將雞蛋清與雞蛋黃與醋攪勻，繼續(xù)密封2天后，過濾取濾液得到醋蛋液；(3)將蟬蛻粉碎，將蠶沙粉碎，按所述質(zhì)量份數(shù)取大鯢油、黑芝麻、醋蛋液、粉碎后的蟬蛻和蠶沙,混合均勻后放置18h得混合物一；(4)按所述質(zhì)量份數(shù)比例取桑椹、佛手瓜、蘆筍、百合、茭白、鐵釘菜、石莼、甘草、跳八丈、蕓薹子、鈕子七混合，加入相對(duì)于混合物11倍的醇體積濃度為95％的乙醇，加熱至沸騰回流4小時(shí)，過濾，收集濾液，隨后在真空度0.06Mpa下減壓濃縮至50℃時(shí)相對(duì)密度為1.04的膏體，噴霧干燥，噴霧干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度150℃、出風(fēng)溫度82℃，隨后粉碎成粉末，制成干膏粉；(5)取所述質(zhì)量份松花粉、油菜花粉與步驟(3)得到的混合物一，步驟(4)得到的干膏粉混合均勻得到海參飼料添加劑。實(shí)施例2添加劑2一種海參飼料添加劑，所述添加劑包括以下重量份的組分：大鯢油0.6克、蟬蛻14克、桑椹30克、蠶沙10克、佛手瓜22克、蘆筍20克、百合15克、茭白16克、鐵釘菜48克、石莼45克、松花粉8克、甘草8克、跳八丈0.3克、蕓薹子0.5克、鈕子七0.4克、黑芝麻22克、油菜花粉15克和醋蛋液20克。所述制備方法包括以下步驟：(1)取大鯢體內(nèi)的脂肪組織，切碎，清洗干凈，加入脂肪組織質(zhì)量7倍的去離子水，武火煮沸后，后改文火煮5h，把所得到的油液過濾、去渣、離心，取上清油液，得到大鯢油；(2)取雞蛋若干個(gè)，加入雞蛋質(zhì)量3倍的6°米醋，密封浸泡1周后，啟封將雞蛋清與雞蛋黃與醋攪勻，繼續(xù)密封2天后，過濾取濾液得到醋蛋液；(3)將蟬蛻粉碎，將蠶沙粉碎，按所述質(zhì)量份數(shù)取大鯢油、黑芝麻、醋蛋液、粉碎后的蟬蛻和蠶沙,混合均勻后放置17h得混合物一；(4)按所述質(zhì)量份數(shù)比例取桑椹、佛手瓜、蘆筍、百合、茭白、鐵釘菜、石莼、甘草、跳八丈、蕓薹子、鈕子七混合，加入相對(duì)于混合物12倍的醇體積濃度為90％的乙醇，加熱至沸騰回流5小時(shí)，過濾，收集濾液，隨后在真空度0.05Mpa下減壓濃縮至40℃時(shí)相對(duì)密度為1.00的膏體，噴霧干燥，噴霧干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度165℃、出風(fēng)溫度80℃，隨后粉碎成粉末，制成干膏粉；(5)取所述質(zhì)量份松花粉、油菜花粉與步驟(3)得到的混合物一，步驟(4)得到的干膏粉混合均勻得到海參飼料添加劑。實(shí)施例3添加劑3一種海參飼料添加劑，所述添加劑包括以下重量份的組分：大鯢油0.5克、蟬蛻16克、桑椹20克、蠶沙12克、佛手瓜14克、蘆筍23克、百合10克、茭白17克、鐵釘菜55克、石莼47克、松花粉12克、甘草12克、跳八丈0.4克、蕓薹子0.4克、鈕子七0.5克、黑芝麻25克、油菜花粉13克和醋蛋液15克。所述制備方法包括以下步驟：(1)取大鯢體內(nèi)的脂肪組織，切碎，清洗干凈，加入脂肪組織質(zhì)量5的去離子水，武火煮沸后，后改文火煮6h，把所得到的油液過濾、去渣、離心，取上清油液，得到大鯢油；(2)取雞蛋若干個(gè)，加入雞蛋質(zhì)量3倍的6°米醋，密封浸泡1周后，啟封將雞蛋清與雞蛋黃與醋攪勻，繼續(xù)密封2天后，過濾取濾液得到醋蛋液；(3)將蟬蛻粉碎，將蠶沙粉碎，按所述質(zhì)量份數(shù)取大鯢油、黑芝麻、醋蛋液、粉碎后的蟬蛻和蠶沙,混合均勻后放置15h得混合物一；(4)按所述質(zhì)量份數(shù)比例取桑椹、佛手瓜、蘆筍、百合、茭白、鐵釘菜、石莼、甘草、跳八丈、蕓薹子、鈕子七混合，加入相對(duì)于混合物10倍的醇體積濃度為95％的乙醇，加熱至沸騰回流3小時(shí)，過濾，收集濾液，隨后在真空度0.08Mpa下減壓濃縮至45℃時(shí)相對(duì)密度為1.02的膏體，噴霧干燥，噴霧干燥機(jī)的進(jìn)風(fēng)溫度160℃、出風(fēng)溫度85℃，隨后粉碎成粉末，制成干膏粉；(5)取所述質(zhì)量份松花粉、油菜花粉與步驟(3)得到的混合物一，步驟(4)得到的干膏粉混合均勻得到海參飼料添加劑。安全性試驗(yàn)1、急性毒性試驗(yàn)(1)試驗(yàn)動(dòng)物、飼料及飼養(yǎng)清潔級(jí)昆明種小白鼠，體重18-22g，20只，雌雄各半。由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。全價(jià)營養(yǎng)生長飼料由廣州大臺(tái)農(nóng)飼料有限公司提供。Ⅱ級(jí)動(dòng)物房，人工晝夜節(jié)律，溫度：24±2℃，濕度：45±5％。(2)試驗(yàn)試劑羧甲基纖維素(分析純)，用蒸餾水配制成0.5％懸浮液待用。(3)試驗(yàn)方法試驗(yàn)方法選用最大耐受量法。取20只體重為18-22g健康的清潔級(jí)昆明種小白鼠，雌雄各10只。試驗(yàn)前禁食16h(隔夜)，不禁水。取5g本發(fā)明實(shí)施例1中的添加劑1，用0.4％羧甲基纖維素稀釋至18mL。分上、下午間隔4h二次經(jīng)口灌胃，第二次灌胃后2h進(jìn)食，總灌胃劑量為10g·(kg·bw)-1。連續(xù)觀察14d，記錄中毒表現(xiàn)及死亡情況。2、致突變性試驗(yàn)2.1試驗(yàn)菌株TA97、TA98、TA100、TA102四株鼠傷寒沙門氏菌。由黑龍江省疾病控制中心提供。2.2試驗(yàn)動(dòng)物及試劑(1)Ames試驗(yàn)：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的配制：牛肉膏2.4g，蛋白胨5.0g，氯化鈉2.4g，磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O)1.2g，蒸餾水500mL。加熱溶解將上述試劑，調(diào)pH至7.4，分裝、滅菌(0.103MPa，20min)，普通冰箱保存?zhèn)溆?不超過半年)。磷酸鹽貯備液配制：磷酸氫鈉氨(NaNH4HPO4·4H2O)17.4g，檸檬酸(C6H8O7·H2O)10.0g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)50.0g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.0g。硫酸鎂待其他試劑完全溶解后再緩緩放入，使其繼續(xù)溶解(否則會(huì)析出沉淀)。1.5％瓊脂培養(yǎng)基配制：瓊脂Agar6.0g，滴入蒸餾水至400mL，上述試劑融化后0.102MPa滅菌25min。底層培養(yǎng)基配制：滅菌瓊脂培養(yǎng)基(80℃)400mL，磷酸鹽貯備液7mL，40％葡萄糖溶液20mL，在容器中依次加入上述試劑，充分混勻，待溫度降至80℃左右時(shí)倒平皿，每皿25mL，37℃培養(yǎng)過夜的同時(shí)除去水分，然后檢查有無污染。頂層瓊脂配制：瓊脂3.0g，氯化鈉2.5g，滴入蒸餾水至500Ml。0.5mmol/L組氨酸-生物素溶液配制：D-生物素D-Biotin(分子量244)30.4mg，L-組氨酸L-Histidine(分子量155)19.3mg，滴入蒸餾水至250mL10％S-9混合液的配制：磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L，pH7.4)6mL，氯化鉀溶液(1.65mol/L)0.2mL，氯化鎂溶液(0.4mol/L)0.2mL，葡萄糖-6-磷酸鈉鹽溶液(0.05mol/L)1.0mL，輔酶-Ⅱ溶液(0.0025mol/L)1.5mL，肝S-9液1.0mL混勻，臨用時(shí)配制，置水浴中待用。肝S-9液由黑龍江省疾病控制中心提供。標(biāo)準(zhǔn)誘變劑分別為敵克松、疊氮鈉、2-乙酰氨基芴、1、8-二羥蒽醌，由黑龍江省疾病控制中心提供。(2)微核試驗(yàn)50只清潔級(jí)昆明種小白鼠，體重25-30g，雌雄各半。由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。全價(jià)營養(yǎng)生長飼料由廣州大臺(tái)農(nóng)飼料有限公司提供。人工晝夜節(jié)律，溫度：24±2℃，濕度：45±5％。小牛血清：小牛血清慮菌后放入恒溫水浴中，56℃滅活1h。滅活后將其儲(chǔ)存于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＜匪_(Giemsa)染液：稱取Giemsa3.8g，加入375ml甲醇(分析純)研磨，待完全溶解后，再加入125ml甘油。置于37℃恒溫箱48h震搖數(shù)次。過濾，靜置兩周后用。吉姆薩(Giemsa)應(yīng)用液：取一份Giemsa染液與6份磷酸鹽緩沖液混合而成。臨用時(shí)配制。1/15moL/L磷酸鹽緩沖液(pH6.8)配制：磷酸二氫鉀(KH2PO4)4.50g，磷酸二氫鈉(Na2HPO4·12H2O)11.78g，滴入蒸餾水至1000mL，全部試劑除注明外，均為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。(3)精子畸形試驗(yàn)50只清潔級(jí)昆明種雄性小白鼠，體重25-35g。由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。全價(jià)營養(yǎng)生長飼料由廣州大臺(tái)農(nóng)飼料有限公司提供。人工晝夜節(jié)律，溫度：24±2℃，濕度：45±5％。甲醇。1％～2％伊紅染色液：稱取伊紅1～2g，溶于100mL蒸餾水備用。全部試劑除標(biāo)明外，均為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。2.3試驗(yàn)方法2.3.1Ames試驗(yàn)(1)原理：鼠傷寒沙門氏菌的突變型(即組氨酸缺陷型)菌株在有組氨酸條件下的培養(yǎng)基上可以正常生長，在無組氨酸存在的培養(yǎng)基上不能生長。但若有致突變物存在于無組氨酸的培養(yǎng)基中時(shí)，則沙門氏菌突變型可回復(fù)突變?yōu)橐吧?表現(xiàn)型)，因而可以生長于無組氨酸的培養(yǎng)基上，所以可根據(jù)菌落形成數(shù)量為標(biāo)準(zhǔn)來判斷受試物致突性的強(qiáng)弱。一些特殊的受試物需要經(jīng)過代謝活化系統(tǒng)處理后才能使沙門氏菌突變型回復(fù)突變?yōu)橐吧?，代謝活化系統(tǒng)采用S-9混合液(制備方法：利用多氯聯(lián)苯(Polychlorinatedbiphenyl,PCB)誘導(dǎo)大鼠肝勻漿(S-9))。(2)試驗(yàn)菌株：采用TA97、TA98、TA100、TA102四株鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株，TA97和TA98可以檢測(cè)各種移碼型誘變劑；TA100可檢測(cè)引起堿基對(duì)置換的誘變劑；TA102能檢測(cè)出其他測(cè)試菌株不能檢出或極少檢出的某些誘變劑。(3)5個(gè)本發(fā)明實(shí)施例1中的添加劑1劑量分別為5000、1000、200、40和8μg/皿。(4)增菌培訓(xùn)取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5ml,加入無菌小三角瓶或無菌試管中，將冷凍保存的菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩(100次/min)培養(yǎng)10h至對(duì)數(shù)增長期，每毫升活菌數(shù)多于1×109～2×109個(gè)，用黑紙包裹培養(yǎng)瓶，以防細(xì)菌被光線照射。(5)準(zhǔn)備數(shù)個(gè)底層培養(yǎng)基平皿。(6)將頂層培養(yǎng)基融化并分裝于無菌小試管，每管2ml，保溫于45℃水浴鍋中。(7)將0.1ml的測(cè)試菌株新鮮增菌液依次加入保溫的頂層培養(yǎng)基中，混勻；然后滴入0.1ml受試物(活化時(shí)另加入0.5ml10％S-9混合液)，再混勻，快速倒在底層培養(yǎng)基上，并使其在底層上均勻分布，平放固化，無菌箱中(37℃)培養(yǎng)48h觀察結(jié)果。(8)另做溶劑對(duì)照(即陰性對(duì)照，蒸餾水0.1ml/皿)和陽性對(duì)照(分別采用疊氮鈉1.5μg/皿、敵克松50μg/皿、2-乙酰氨基芴10μg/皿、1,8-二羥蒽醌50μg/皿)。溶劑對(duì)照加滅菌蒸餾水；陽性對(duì)照不加受試物，只加標(biāo)準(zhǔn)誘變劑；其他方法同上。重復(fù)兩次。2.3.2微核試驗(yàn)表1微核試驗(yàn)設(shè)計(jì)(n＝10)劑量組劑量(g·(kg·bw·d)-1)陰性組0.5％羧甲基纖維素低劑量組0.5中劑量組5高劑量組9陽性組0.04按30h給受試物法給藥，陽性對(duì)照組用環(huán)磷酸胺一次腹腔注射0.04g·(kg·bw)-1，其余各組灌胃，2次給藥間隔24h，第2次給藥后6h處死動(dòng)物。制片：在第2次給藥6h后將小鼠脫頸椎處死，取小鼠脊椎，剔去肌肉，剪開一端的骨椎，用尖嘴鉗擠出骨髓滴到小牛血清(0.05mL，置于載玻片上)中。推片：混勻后，推片若干張，靜置干燥。固定：用甲醇溶液將干燥的涂片固定5～10min，取出晾干。當(dāng)日不染色的涂片亦應(yīng)固定后保存。染色：用1:10的吉姆薩-磷酸緩沖液(pH為6.4)染色固定好的涂片15～30min。用蒸餾水沖洗，干燥后待檢。每只小白鼠計(jì)數(shù)1000個(gè)PCE(Poiychromaticerythrocytes，PCE)，微核率以‰表示；另外，在計(jì)數(shù)PCE時(shí)，同時(shí)計(jì)數(shù)RBC(Redbloodcellcount，RBC)數(shù)，計(jì)算PCE/RBC值。2.3.3精子畸形試驗(yàn)表2精子畸形試驗(yàn)設(shè)計(jì)(n＝10)每日染毒一次，連續(xù)5d，每天記錄體重、進(jìn)食量和攝入添加劑量。陽性對(duì)照組采用0.04g·(kg·bw·d)-1環(huán)磷酰胺進(jìn)行腹腔注射，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1的給藥方式為灌胃。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)要求每組至少有5只存活動(dòng)物。精子采樣與鏡檢：于首次給受試物后第5周(35d)將小鼠用頸椎脫臼法處死，打開腹腔，摘取兩側(cè)附睪，放入小平皿中(盛有約2ml生理鹽水)。將附睪以眼科剪剪碎(不能太碎)。將組織碎片用四層擦紙濾去。濾液離心5min(1000～1500r/min)。留存約0.5ml液體，其余上清液棄除，將其與沉淀物搖勻后，在潔凈的載玻片上滴1滴進(jìn)行涂片(一般每只小鼠做4～5張涂片)。涂片在空氣中干燥后，采用甲醇溶液固定5min。用2％伊紅溶液在其自然干燥后染色1h，用水輕沖，干燥待檢。在低倍鏡下找到精子重疊較少、背景清晰的部分，用高倍鏡順序檢查精子，并計(jì)數(shù)。凡不完整，輪廓不清，或重疊，或明顯屬人為剪碎者均不計(jì)算。一個(gè)精子只計(jì)其中較為明顯的一種畸形。精子的畸形主要表現(xiàn)在頭部，其次在尾部，畸形類型有香蕉形、無定形、無鉤、胖頭、雙頭、雙尾、尾折疊等。記錄異常的精子數(shù)和異常類型，并計(jì)算畸形類型的精子構(gòu)成比。每鼠計(jì)1000個(gè)完整精子，畸形率以‰表示。精子畸形率(‰)＝精子畸形總數(shù)/檢查精子總數(shù)×10003、慢性和亞慢性試驗(yàn)3.1試驗(yàn)動(dòng)物、飼料及飼養(yǎng)3.1.1大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)清潔級(jí)Wistar大白鼠，體重150-180g，80只，雌雄各半。由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。全價(jià)營養(yǎng)生長飼料由北京澳協(xié)力飼料有限公司提供。Ⅱ級(jí)動(dòng)物房，人工晝夜節(jié)律，溫度：24±2℃，濕度：45±5％。3.1.2蛋雞56d喂養(yǎng)試驗(yàn)32周齡海賽蛋雞240只，由哈爾濱益農(nóng)禽業(yè)提供。基礎(chǔ)飼糧由哈爾濱華達(dá)飼料廠提供。蛋雞飼養(yǎng)在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)基地蛋雞舍。3.2試驗(yàn)試劑普通化學(xué)試劑：甲醛、石蠟、乙醇、二甲苯、蘇木精、伊紅、丙酮、磷酸鹽緩沖液等。生化指標(biāo)測(cè)定試劑盒：谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-oxalacetictransaminease，GOT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-pyruvictransaminase，GPT)、尿素氮(Ureanitrogen，BUN)、肌酐(Creatinine，CRE)、膽固醇(Cholesterol，CHO)、血糖(Glucose，GLU)、TG、白蛋白(Albumin，ALB)、總蛋白(Totalprotein，TP)測(cè)試試劑盒均購自中生北控(生產(chǎn)批號(hào)：100731)血細(xì)胞分析儀測(cè)試試劑：染色劑(STROMATOLYSER-4DSFFS-800A)、血蛋白檢測(cè)試劑(SULFOLYSERSLS-210A1015)、嗜堿性粒細(xì)胞和白細(xì)胞檢測(cè)試劑(STROMATOLYSER-FBR1039)、稀釋液(PK-30LG2109)。全部試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。3.3試驗(yàn)方法3.4.1大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)表3大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)(n＝20)組別處理對(duì)照組全價(jià)飼料低劑量組全價(jià)飼料+0.4％本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1中劑量組全價(jià)飼料+2％本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1高劑量組全價(jià)飼料+10％本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1動(dòng)物購入隔離喂養(yǎng)1周后供試驗(yàn)用，每組雌雄各半。試驗(yàn)動(dòng)物自由采食、自由飲水。(1)血液指標(biāo)：一般性指標(biāo)：觀察大鼠的采食、飲水、發(fā)病及死亡等情況，每日早晚兩次，體重和飼料每周各稱一次，并計(jì)算平均增重、采食量、始重、末重及飼料利用率。血液學(xué)指標(biāo)：30d喂養(yǎng)結(jié)束后，采血液樣品，測(cè)定紅細(xì)胞(Redbloodcellcount，RBC)、白細(xì)胞(Whitebloodcellcount，WBC)、血紅蛋白(Hemoglobin，HGB)、淋巴細(xì)胞數(shù)(Lymphocyte，LYM)及白細(xì)胞分類。生化指標(biāo)：30d喂養(yǎng)結(jié)束后，采集大鼠血液樣品離心取血清，測(cè)定GOT、GPT、BUN、CRE、CHO、GLU、TG、ALB、TP。(2)病理學(xué)檢查：尸檢：觀察并記錄各系統(tǒng)器官、組織的肉眼變化，典型病變拍照。臟器系數(shù)：心臟、肝臟、腎臟、脾臟、睪丸或卵巢等組織及體重稱重，并計(jì)算臟器系數(shù)。組織學(xué)檢查：在上述解剖試驗(yàn)動(dòng)物以肉眼觀察變化的同時(shí)，取心臟、腎臟、脾臟、肝臟、胃、睪丸或卵巢等臟器組織1～2塊，以甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE(HEmatine，HE)染色，顯微鏡下觀察并記錄組織學(xué)變化。3.4.2蛋雞56d喂養(yǎng)試驗(yàn)表4蛋雞56d喂養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)(n＝60)組別處理對(duì)照組基礎(chǔ)飼糧低劑量組基礎(chǔ)飼糧+0.4％本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1中劑量組基礎(chǔ)飼糧+2％本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1高劑量組基礎(chǔ)飼糧+10％本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1動(dòng)物購入后在本試驗(yàn)條件下適應(yīng)7天后再開始試驗(yàn)。試驗(yàn)動(dòng)物自由采食、自由飲水。(1)血液指標(biāo)：一般性指標(biāo)：觀察蛋雞的采食、飲水、發(fā)病及死亡等情況，每日早晚兩次，對(duì)蛋重和飼料每天各稱一次，并計(jì)算料蛋比、產(chǎn)蛋率。血液學(xué)指標(biāo)：在56天喂養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)蛋雞進(jìn)行采血測(cè)定RBC、WBC、HGB、LYM。生化指標(biāo)：在56天喂養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)蛋雞進(jìn)行采集血液離心取血清測(cè)定GOT、GPT、BUN、CRE、CHO、GLU、TG、ALB、TP。(2)病理學(xué)檢查：尸檢：肉眼觀察并記錄各系統(tǒng)器官、組織的變化，典型病變拍照。臟器系數(shù)：稱心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、胰腺、腺胃、肌胃等組織重及體重。組織學(xué)檢查：在上述解剖試驗(yàn)動(dòng)物以肉眼觀察變化的同時(shí)，取肝臟、脾臟、腎臟、腺胃等臟器組織1～2塊以甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察并記錄組織學(xué)變化。3.4數(shù)據(jù)處理結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。急性毒性試驗(yàn)、大白鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)和蛋雞56d喂養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差(one-wayANOVA)分析；Ames試驗(yàn)結(jié)果和小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果均進(jìn)行卡方檢驗(yàn)；小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和Duncan′s法多重比較。P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為差異極顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。4、結(jié)果與分析4.1急性毒性表5急性毒性由表5可見，試驗(yàn)結(jié)束后，所有小鼠在試驗(yàn)期間全部無異常，飲水、采食及糞便均正常，全部存活；兩種性別小鼠的體重增重未見顯著差異(P>0.05)。在試驗(yàn)結(jié)束后將全部小鼠脫頸處死，解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、胃、腎、胸腺等臟器均未出現(xiàn)異常病理變化。結(jié)果表明，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1的LD50>10mg·(kg·bw)-1，屬于實(shí)際無毒類物質(zhì)。4.2致突變性4.2.1Ames試驗(yàn)由表6、7、8、9可見，與陰性對(duì)照組相比，在加與不加S-9情況下兩次Ames試驗(yàn)陽性對(duì)照組回復(fù)突變菌落數(shù)極顯著增高(P<0.01)，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1各劑量組回復(fù)突變菌落數(shù)無顯著差異(P>0.05)，無劑量反應(yīng)關(guān)系，即此劑量下本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1對(duì)鼠傷寒沙門氏菌為致突變陰性。表6本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1對(duì)回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(第一次試驗(yàn)，-S9)注：同列中*表示差異極顯著(P<0.01)。表7、8、9同表7本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1對(duì)回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(第一次試驗(yàn)，+S9)表8本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1對(duì)回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(第二次試驗(yàn)，-S9)表9本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1對(duì)回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(第二次試驗(yàn)，+S9)4.2.2小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)表10小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)(n＝10)注：同列中肩標(biāo)*者表示差異極顯著(P<0.01)由表10可見，與陰性對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組微核率極顯著提高(P<0.01)，雌、雄小鼠本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1各組微核率均無顯著差異(P>0.05)，說明在此劑量下本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核率無顯著影響，即本試驗(yàn)結(jié)果為陰性。此外，除陽性對(duì)照組外，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1各組與陰性對(duì)照組相比PCE/RBC無顯著差異(P>0.05)，說明此劑量下本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物未見細(xì)胞毒性作用。4.2.3小鼠精子畸形試驗(yàn)由表11可見，各組小鼠均有一定數(shù)量的畸形精子出現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組精子畸形率極顯著提高(P<0.01)，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1各組差異均不顯著(P>0.05)，無劑量反應(yīng)關(guān)系，說明在此劑量下本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1對(duì)小鼠精子畸形發(fā)生率沒有影響。表11小鼠精子畸形試驗(yàn)(n＝10)組別精子畸形數(shù)(個(gè))精子畸形率(‰)陰性組295.8低劑量組295.8中劑量組408.0高劑量組448.8陽性組513*102.6*注：同列中肩標(biāo)*者表示差異極顯著(P<0.01)4.3慢性和亞慢性4.3.1大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)4.3.1.1一般性指標(biāo)表12大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)體重增重、進(jìn)食量、食物利用率(n＝10)由表12可見，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1喂飼大鼠30d后體重增重、總進(jìn)食量以及食物利用率與對(duì)照組相比均無顯著差異(P>0.05)。4.3.1.2血液學(xué)指標(biāo)表13大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)血液學(xué)指標(biāo)(1)(n＝10)表14大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)血液學(xué)指標(biāo)(2)(n＝10)由表13和14可見，與對(duì)照組相比，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1飼喂大鼠30d后雌雄大鼠的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白以及白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)差異均不顯著(P>0.05)。4.3.1.3血液生化指標(biāo)表15大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)血液生化指標(biāo)(1)(n＝10)表16大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)血液生化指標(biāo)(2)(n＝10)由表15和16可見，與對(duì)照組相比，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1飼喂大鼠30d后雌雄大鼠的9項(xiàng)血液生化指標(biāo)差異均不顯著(P>0.05)。4.3.1.4病理學(xué)檢查(1)大體觀察試驗(yàn)結(jié)束后解剖各組大鼠進(jìn)行肉眼尸檢。各組大鼠氣管、心臟、胸主動(dòng)脈、肝、腎、腎上腺、脾、胃、盲腸、結(jié)腸、直腸、胰腺、部分腸系膜淋巴結(jié)、乳腺、十二指腸、空腸、前列腺、睪丸、附睪精囊或卵巢、子宮、陰道、坐骨神經(jīng)、膀胱、皮膚等組織均未見明顯異常。表17大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)臟器體重比(1)(n＝10)表18大鼠30d喂養(yǎng)試驗(yàn)臟器體重比(2)(n＝10)由表17、18可見，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1飼喂大鼠30d后與對(duì)照組雌雄大鼠的臟器體重比相比差異均不顯著(P>0.05)。(2)臟器組織病理檢查試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)所有大鼠心臟、肝臟、脾、腎、胃、睪丸或卵巢進(jìn)行HE染色。顯微鏡下觀察，各劑量組與對(duì)照組相比未見任何明顯異常4.3.2蛋雞56d喂養(yǎng)試驗(yàn)4.3.2.1一般性指標(biāo)由表19可見，與對(duì)照組相比，蛋雞經(jīng)56d本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1飼喂后日采食量、平均蛋重差異均不顯著(P>0.05)；平均產(chǎn)蛋率顯著提高，料蛋比顯著降低(P<0.05)，表明適當(dāng)劑量本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1能夠提高蛋雞的生產(chǎn)性能。表19蛋雞喂養(yǎng)試驗(yàn)一般性指標(biāo)(n＝60)注：同行中肩上字母不同者表示差異顯著(P<0.05)4.3.2.2血液學(xué)指標(biāo)由表20可見，與對(duì)照組相比，蛋雞經(jīng)56d本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1飼喂后白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白、紅細(xì)胞比容、紅細(xì)胞平均體積、平均紅細(xì)胞血色素、紅細(xì)胞平均蛋白濃度、血小板差異均不顯著(P>0.05)。表20蛋雞喂養(yǎng)試驗(yàn)血液學(xué)指標(biāo)(n＝60)4.3.2.3血液生化指標(biāo)表21蛋雞喂養(yǎng)試驗(yàn)血液生化指標(biāo)(n＝60)注：同行中肩上標(biāo)注*者表示差異顯著(P<0.05)由表21可見，與對(duì)照組相比，高劑量組蛋雞血液BUN水平顯著降低(P<0.05)，其他指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)。4.3.2.4病理學(xué)檢查(1)大體觀察試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)各組蛋雞解剖，進(jìn)行肉眼尸檢。各組蛋雞的主要臟器氣管、心臟、肝、腎、腎上腺、脾、胃、盲腸、結(jié)腸、直腸、胰腺、部分腸系膜淋巴結(jié)、十二指腸、卵巢、子宮、皮膚等經(jīng)肉眼觀察，未見明顯異常。表22蛋雞喂養(yǎng)試驗(yàn)臟器體重比(n＝60)項(xiàng)目對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組心臟體重比3.59±0.514.12±0.562.39±0.133.64±0.49肝臟體重比23.69±4.2826.18±3.2823.41±3.6827.01±6.01腎體重比6.01±1.037.03±0.116.23±0.487.17±0.27脾體重比1.13±1.120.84±0.321.01±0.120.71±0.72法氏囊體重比1.09±0.490.85±0.180.49±0.300.42±0.12腺胃體重比4.09±0.323.91±0.213.39±0.714.21±0.28肌胃體重比16.14±1.1415.83±1.1514.18±2.2817.55±2.08由表22可見，與對(duì)照組相比，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1各組蛋雞臟器體重差異均不顯著(P>0.05)。(2)臟器組織病理檢查蛋雞肝臟、脾、腎、腺胃經(jīng)HE染色，在顯微鏡下觀察，各劑量組與對(duì)照組相比較均未見任何明顯異常。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1的半數(shù)致死量大于10g·(kg·bw)-1，屬于實(shí)際無毒類物質(zhì)。2.本試驗(yàn)條件下，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1沒有致突變性。3.本試驗(yàn)條件下，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1對(duì)大鼠和蛋雞沒有慢性和亞慢性毒性，并可提高蛋雞的生產(chǎn)性能。綜上所述，本試驗(yàn)結(jié)果提示，本試驗(yàn)條件下，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1既沒有急性毒性、致突變性，也沒有慢性或亞慢性毒性，本發(fā)明實(shí)施例1添加劑1在適當(dāng)?shù)膭┝肯峦耆梢宰鳛橐环N綠色、天然、安全的功能性飼料添加劑，并應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中。本發(fā)明的實(shí)施例2和實(shí)施例3的添加劑同樣進(jìn)行了上述試驗(yàn)，同樣證明本發(fā)明實(shí)施例2和實(shí)施例3的添加劑既沒有急性毒性、致突變性，也沒有慢性或亞慢性毒性，在適當(dāng)?shù)膭┝肯峦耆梢宰鳛橐环N綠色、天然、安全的功能性飼料添加劑，并應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)中。對(duì)比試驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)用刺參：購自山東省青島市某養(yǎng)殖場(chǎng)。在青島市膠南海域?qū)嶒?yàn)基地進(jìn)行海參飼喂實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)海水為自然海域潮起落海水，經(jīng)過濾并在池中持續(xù)充氣，每天一個(gè)循環(huán)水量。試驗(yàn)前，于水槽中馴化暫養(yǎng)2周。待刺參攝食、排泄等規(guī)律后，挑選500頭規(guī)格整齊、體質(zhì)健壯的個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用水的氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫、PH、溶解氧等值均在正常范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)用基礎(chǔ)飼料：用市場(chǎng)采購飼料。試驗(yàn)采用單因子隨機(jī)化完全區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)4個(gè)處理。每組放置50頭海參幼苗。試驗(yàn)前將各基礎(chǔ)原料過100目篩后，充分混合后配置成飼料。空白組不添加添加劑；實(shí)施例1組添加實(shí)施例1的添加劑，添加量為基礎(chǔ)飼料的0.07％；實(shí)施例2組添加實(shí)施例2的添加劑，添加量為基礎(chǔ)飼料的0.07％；實(shí)施例3組添加實(shí)施例3的添加劑，添加量為基礎(chǔ)飼料的0.07％。實(shí)驗(yàn)用海水經(jīng)砂濾器過濾，鹽度為3.0％左右，pH值為8.0左右，水溫保持在18℃左右。每天15:00投喂，投喂的干飼料量為刺參體重的8％左右，視刺參的攝食、體增重及水溫變化等情況而及時(shí)調(diào)整，稍過量投喂。正試期60天。刺參體重和體長的測(cè)定試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，對(duì)各組刺參計(jì)數(shù)。試驗(yàn)開始前及每30d測(cè)定各水槽刺參體長(BL)及體質(zhì)量(BM)。體長測(cè)量方法是將刺參放在盛有海水的解剖盤中，靜置待其身體自然伸展后，測(cè)量各刺參體長。將幼參取出，令其體腔內(nèi)的水盡量排空并用干濾紙或干毛巾快速吸附體表水分至微干，用電子天平稱量(測(cè)定體重前停喂24小時(shí))。按以下公式計(jì)算各試驗(yàn)組刺參的存活率(SR)SR＝Nt*100％/N0；其中，N0實(shí)驗(yàn)開始時(shí)頭數(shù)，Nt實(shí)驗(yàn)結(jié)束頭數(shù)。表23不同添加劑對(duì)刺參質(zhì)量和存活率的影響處理初始質(zhì)量g30天終質(zhì)量g60天終質(zhì)量g存活率SR％空白1.11±0.041.35±0.09a2.08±0.14a88實(shí)施例1組1.09±0.031.75±0.11b2.79±0.13b98實(shí)施例2組1.06±0.031.73±0.12b2.76±0.12b98實(shí)施例3組1.08±0.021.68±0.14ab2.65±0.13b96注：同列字母相同表示無顯著差異(P>0.05)；字母不同，則有顯著差異(P<0.05)。表24各組刺參體長的測(cè)定注：同列字母相同表示無顯著差異(P>0.05)；字母不同，則有顯著差異(P<0.05)。試驗(yàn)證明，本發(fā)明的添加劑可以有效促進(jìn)刺參的生長率和成活率。2、抗病能力實(shí)驗(yàn)用刺參：購自山東省青島市某養(yǎng)殖場(chǎng)。在青島市膠南海域?qū)嶒?yàn)基地進(jìn)行海參飼喂實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)海水為自然海域潮起落海水，經(jīng)過濾并在池中持續(xù)充氣，每天一個(gè)循環(huán)水量。試驗(yàn)前，于水槽中馴化暫養(yǎng)2周。待刺參攝食、排泄等規(guī)律后，挑選300頭規(guī)格整齊、體質(zhì)健壯的個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用水的氨氮、亞硝酸鹽、硫化氫、PH、溶解氧等值均在正常范圍內(nèi)。當(dāng)養(yǎng)殖池內(nèi)出現(xiàn)腐皮病現(xiàn)象時(shí)，將此養(yǎng)殖池隨機(jī)選出200頭分成四池分開養(yǎng)殖。標(biāo)記分別為處理1、處理2、處理3、處理4。處理1為空白對(duì)照組，不加入添加劑；處理2在飼料中混入本發(fā)明實(shí)施例1的添加劑，添加量為飼料質(zhì)量的0.1％；處理3在飼料中混入本發(fā)明實(shí)施例2的添加劑，添加量為飼料質(zhì)量的0.1％；處理4在飼料中混入本發(fā)明實(shí)施例3的添加劑，添加量為飼料質(zhì)量的0.1％。表25各組抗病能力試驗(yàn)結(jié)果組別試驗(yàn)開始頭數(shù)成活頭數(shù)成活率(％)處理1502142處理25050100處理35050100處理4504998結(jié)果表明空白對(duì)照組海參的抗病能力比較弱，免疫力不高海參反復(fù)發(fā)病，最終導(dǎo)致成活率僅42％；處理2-4，使用本發(fā)明實(shí)施例的添加劑后抗病能力增強(qiáng)，沒有繼續(xù)感染，腐皮病得到有效控制。說明使用本發(fā)明實(shí)施例的添加劑后海參的抗病能力增強(qiáng)，免疫力提高。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3