本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種快速釋放大米蛋白中苯丙氨酸的方法。

背景技術(shù)：

苯丙氨酸是一種人體必需氨基酸，在體內(nèi)大部分經(jīng)苯丙氨酸羥化酶催化作用氧化成酪氨酸，并與酪氨酸一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素，參與機體糖代謝和脂肪代謝。同時，苯丙氨酸是生產(chǎn)新型保健型甜味劑阿斯巴甜的主要原料。苯丙氨酸不能被苯丙酮尿癥患者正常代謝，而導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的永久性損傷。只要在新生兒期獲得診斷和給予及時的低苯丙氨酸飲食，可避免患兒的智力損害。食療法是治療苯丙酮尿癥一種公認的，長期堅持具有顯著效果的方法，即控制患兒食物中苯丙氨酸攝入量以達到機體代謝平衡的一種方法。

目前脫除蛋白中苯丙氨酸的方法主要有酶解吸附法。目前研究中酶解過程中存在著酶解時間過長、酶解過程造成后續(xù)工藝復(fù)雜等問題不適于大規(guī)模生產(chǎn)。Cabrera-Padilla等利用新型酶膜反應(yīng)器脫除蛋白中苯丙氨酸，在酶解過程中小分子物質(zhì)經(jīng)超濾處理，使反應(yīng)物和產(chǎn)物在體系中有效分離，可提高反應(yīng)效率，降低酶競爭抑制性，但在此情況下，利用糜蛋白酶和羧肽酶-A酶解乳清蛋白，酶解時間仍長達18h；周志偉等采用一種經(jīng)純化的粗制微生物蛋白酶作用于酪蛋白，酶解時間控制在12h；Lopes等在蛋白提取過程中將pH控制在9-12，在后續(xù)過程中需脫鹽處理，不利于實際工業(yè)生產(chǎn)?？梢姡⒁环N快速釋放苯丙氨酸的方法，選用合適的前處理方式，選擇效率高的酶種類，嚴格控制酶解過程中的反應(yīng)條件，對蛋白中苯丙氨酸的快速游離至關(guān)重要的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種快速釋放大米蛋白中苯丙氨酸的方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的快速釋放大米蛋白中苯丙氨酸的方法，將大米蛋白用水配制成一定濃度的大米蛋白溶液，經(jīng)超聲波細胞粉碎處理，然后利用中性蛋白酶和鏈霉蛋白酶分步酶解大米蛋白，以快速釋放大米蛋白中的苯丙氨酸。

所述方法具體包括以下步驟：

S1、將大米蛋白用水配制成一定濃度的大米蛋白溶液，經(jīng)超聲波細胞粉碎處理后，加入中性蛋白酶進行酶解，得到酶解液I；

S2、向酶解液I中加入鏈霉蛋白酶，繼續(xù)進行酶解，得到酶解液II；

S3、使酶解液II中的蛋白酶失活，離心所得上清液中含有釋放出的游離苯丙氨酸。

前述方法中，所述大米蛋白溶液的質(zhì)量百分濃度為1-2％，優(yōu)選1％。

前述方法中，進行超聲波細胞粉碎處理的條件如下：功率200-400W，超聲4-6s，間隔3-5s，共計4-6min。

前述的方法，S1具體操作如下：將大米蛋白用水配制成一定濃度的大米蛋白溶液，經(jīng)超聲波細胞粉碎處理后，按每克大米蛋白3200-6400U的加入量加入中性蛋白酶，于40-60℃反應(yīng)1-5h，得到酶解液I。

優(yōu)選中性蛋白酶的加入量為4000-5600U/g大米蛋白，更優(yōu)選4800-5600U/g大米蛋白，最優(yōu)選5600U/g大米蛋白；優(yōu)選反應(yīng)溫度為45-55℃，更優(yōu)選45-50℃，最優(yōu)選50℃；優(yōu)選反應(yīng)時間為2-4h，更優(yōu)選2-3h，最優(yōu)選2h。

前述的方法，S2具體操作如下：向酶解液I中按每克大米蛋白50-146U的加入量加入鏈霉蛋白酶，于30-50℃反應(yīng)1-5h，得到酶解液II。

優(yōu)選鏈霉蛋白酶的加入量為74-122U/g大米蛋白，更優(yōu)選98U/g大米蛋白；優(yōu)選反應(yīng)溫度為35-45℃，更優(yōu)選35-40℃，最優(yōu)選37℃；優(yōu)選反應(yīng)時間為2-4h，更優(yōu)選2h。

前述的方法，S3具體操作如下：將酶解液II于90-95℃恒溫水浴中放置10-20min，使蛋白酶失活，然后4000-4500r/min離心20-30min取上清液。

優(yōu)選地，本發(fā)明快速釋放大米蛋白中苯丙氨酸的方法包括以下步驟：

S1、將大米蛋白用水配制成質(zhì)量百分濃度為1％的大米蛋白溶液，經(jīng)超聲波細胞粉碎處理后，按每克大米蛋白5600U的加入量加入中性蛋白酶，于50℃反應(yīng)2h，得到酶解液I；進行超聲波細胞粉碎處理的條件為：功率300W，超聲5s，間隔4s，共計6min；

S2、向酶解液I中按每克大米蛋白98U的加入量加入鏈霉蛋白酶，于37℃反應(yīng)2h，得到酶解液II；

S3、將酶解液II于90℃恒溫水浴中放置10min，使蛋白酶失活，然后4200r/min離心20min取上清液。

前述的方法，進一步包括對所得上清液進行干燥的步驟。優(yōu)選采用冷凍干燥。

本發(fā)明所述大米蛋白中蛋白質(zhì)含量≥75％，脂肪含量≤1％，苯丙氨酸含量≥4.72％。

本發(fā)明所用中性蛋白酶來源于枯草芽抱桿菌，由枯草芽抱桿菌經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生，例如經(jīng)液體深層發(fā)酵，濃縮提取精制而制得；屬于單一酶類，無特異性酶切位點。所述中性蛋白酶可按現(xiàn)有技術(shù)方法制備，也可購買商品化產(chǎn)品，例如購自北京索萊寶科技有限公司，商品目錄號：Z8030，酶活為6×10⁴U/g。

本發(fā)明所用鏈霉蛋白酶來源于灰色鏈霉菌。所鏈霉蛋白酶可按現(xiàn)有技術(shù)方法制備，也可購買商品化產(chǎn)品，例如購自北京索萊寶科技有限公司，商品目錄號：P8360，酶活為7.00×10³U/g。

本發(fā)明對中性蛋白酶酶活的定義為：酪蛋白底物在特定條件下經(jīng)酶水解，每分鐘產(chǎn)生lμg酪氨酸為一個活力單位，以U表示。

本發(fā)明對鏈霉蛋白酶酶活定義為：酪蛋白底物在特定條件下經(jīng)酶水解，每分鐘產(chǎn)生lμg酪氨酸為一個活力單位，以U表示。

本發(fā)明通過對酶解條件進行多因素優(yōu)化，最終建立了一套能夠快速釋放大米蛋白中苯丙氨酸的方法。該方法操作簡單、條件溫和、易于工業(yè)化快速釋放大米蛋白中苯丙氨酸，為不同方法脫除苯丙氨酸，并進一步分離苯丙氨酸提供良好的技術(shù)支持。應(yīng)用該方法對大米蛋白進行處理，大米蛋白中游離苯丙氨酸占總苯丙氨酸含量的80％以上。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實驗例1中性蛋白酶不同酶解時間對苯丙氨酸游離效果的影響；

圖2為本發(fā)明實驗例2中性蛋白酶加入量對苯丙氨酸游離效果的影響；

圖3為本發(fā)明實驗例3中性蛋白酶酶解溫度對苯丙氨酸游離效果的影響；

圖4為本發(fā)明實驗例4鏈霉蛋白酶酶解時間對苯丙氨酸游離效果的影響；

圖5為本發(fā)明實驗例5鏈霉蛋白酶加入量對苯丙氨酸游離效果的影響；

圖6為本發(fā)明實驗例6鏈霉蛋白酶酶解溫度對苯丙氨酸游離效果的影響。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

以下實施例中所用的中性蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，商品目錄號：Z8030，酶活為6×10⁴U/g；所用的鏈霉蛋白酶購自北京索萊寶科技有限公司，商品目錄號：P8360，酶活為7.00×103U/g。所用的大米蛋白，其蛋白質(zhì)含量≥75％，脂肪含量≤1％，苯丙氨酸含量4.72％。以下實施例中采用熒光法測定游離苯丙氨酸含量。

實施例1快速釋放大米蛋白中苯丙氨酸的方法

所述方法包括以下步驟：

(1)將大米蛋白用水配制成質(zhì)量百分濃度為1％的大米蛋白溶液，經(jīng)超聲波細胞粉碎處理(功率300W，超聲5s，間隔4s，共計6min)后，按每克大米蛋白5600U的加入量加入中性蛋白酶，于50℃反應(yīng)2h，得到酶解液I；

(2)向酶解液I中按每克大米蛋白98U的加入量加入鏈霉蛋白酶，于37℃反應(yīng)2h，得到酶解液II；

(3)將酶解液II于90℃恒溫水浴中放置10min，使蛋白酶失活，然后4200r/min離心20min，收集得到的上清液中含有大量釋放出的游離苯丙氨酸。采用熒光法測定上清液中游離苯丙氨酸含量，大米蛋白中游離苯丙氨酸量占總苯丙氨酸含量的80.12％。然后將該溶液進行冷凍干燥保存。

實施例2快速釋放大米蛋白中苯丙氨酸的方法

所述方法包括以下步驟：

(1)將大米蛋白用水配制成質(zhì)量百分濃度為2％的大米蛋白溶液，經(jīng)超聲波細胞粉碎處理(功率400W，超聲6s，間隔3s，共計4min)后，按每克大米蛋白6400U的加入量加入中性蛋白酶，于40℃反應(yīng)1h，得到酶解液I；

(2)向酶解液I中按每克大米蛋白146U的加入量加入鏈霉蛋白酶，于30℃反應(yīng)1h，得到酶解液II；

(3)將酶解液II于95℃恒溫水浴中放置20min，使蛋白酶失活，然后4500r/min離心25min，收集得到的上清液中含有大量釋放出的游離苯丙氨酸。采用熒光法測定上清液中游離苯丙氨酸含量，大米蛋白中游離苯丙氨酸量占總苯丙氨酸含量的66.52％。然后將該溶液進行冷凍干燥保存。

實施例3快速釋放大米蛋白中苯丙氨酸的方法

所述方法包括以下步驟：

(1)將大米蛋白用水配制成質(zhì)量百分濃度為1.5％的大米蛋白溶液，經(jīng)超聲波細胞粉碎處理(功率200W，超聲4s，間隔5s，共計5min)后，按每克大米蛋白3200U的加入量加入中性蛋白酶，于60℃反應(yīng)5h，得到酶解液I；

(2)向酶解液I中按每克大米蛋白50U的加入量加入鏈霉蛋白酶，于50℃反應(yīng)5h，得到酶解液II；

(3)將酶解液II于93℃恒溫水浴中放置15min，使蛋白酶失活，然后4000r/min離心30min，收集得到的上清液中含有大量釋放出的游離苯丙氨酸。采用熒光法測定上清液中游離苯丙氨酸含量，大米蛋白中游離苯丙氨酸量占總苯丙氨酸含量的65.76％。然后將該溶液進行冷凍干燥保存。

實施例4快速釋放大米蛋白中苯丙氨酸的方法

與實施例1的區(qū)別僅在于步驟(1)中將濃度為1％的大米蛋白溶液加熱至80℃水浴震蕩15min，代替超聲波細胞粉碎處理。

采用上述方法釋放大米蛋白中的苯丙氨酸，最終游離苯丙氨酸含量占總苯丙氨酸含量的52.70％。

實施例5快速釋放大米蛋白中苯丙氨酸的方法

與實施例1的區(qū)別僅在于步驟(2)中以糜蛋白酶代替鏈霉蛋白酶。

采用上述方法釋放大米蛋白中的苯丙氨酸，最終游離苯丙氨酸含量占總苯丙氨酸含量的61.35％。

酶解條件的多因素優(yōu)化：

實驗例1中性蛋白酶酶解時間對苯丙氨酸游離效果的影響

第一步：將大米蛋白用水配制成質(zhì)量百分濃度為1％的大米蛋白溶液，經(jīng)超聲波細胞粉碎處理(功率300W，超聲5s，間隔4s，共計6min)；

第二步：第一步反應(yīng)后大米蛋白溶液中加入中性蛋白酶(加入量5600U/g蛋白)，在50℃的恒溫水浴振蕩器中進行酶解1h/2h/3h/4h/5h；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液；

第四步：上清液即為苯丙氨酸充分游離的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

中性蛋白酶酶解時間對苯丙氨酸游離效果影響的結(jié)果見圖1。由圖1可以看出：1-2h內(nèi)，游離苯丙氨酸量顯著增高，2-5h內(nèi)，游離苯丙氨酸量基本保持不變，這可能是由于在2h左右，酶制劑與底物已充分接觸，反應(yīng)完全，苯丙氨酸在該反應(yīng)條件下已充分游離，因此選擇2h作為鏈酶蛋白酶的最佳酶解時間。

實驗例2中性蛋白酶加入量對苯丙氨酸游離效果的影響

第一步：將大米蛋白用水配制成質(zhì)量百分濃度為1％的大米蛋白溶液，經(jīng)超聲波細胞粉碎處理(功率300W，超聲5s，間隔4s，共計6min)；

第二步：第一步反應(yīng)后大米蛋白溶液中加入中性蛋白酶(加入量3200/4000/4800/5600/6400U/g蛋白)，在50℃的恒溫水浴振蕩器中進行酶解2h；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液；

第四步：上清液即為苯丙氨酸充分游離的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

中性蛋白酶加入量對苯丙氨酸游離效果影響的結(jié)果見圖2。由圖2可以看出：中性蛋白酶加入量3200U/g蛋白、4000U/g蛋白、4800U/g蛋白、5600U/g蛋白、6400U/g蛋白，在加酶量3200-5600U/g蛋白之間，苯丙氨酸游離量顯著升高，這可能是由于加酶量在底物蛋白充分接觸，5600-6400U/g蛋白之間，苯丙氨酸的游離量逐漸降低，這可能是因為加酶量過大，酶進行自我分解，導致苯丙氨酸游離效果下降。

實驗例3中性蛋白酶酶解溫度對苯丙氨酸游離效果的影響

第一步：將大米蛋白用水配制成質(zhì)量百分濃度為1％的大米蛋白溶液，經(jīng)超聲波細胞粉碎處理(功率300W，超聲5s，間隔4s，共計6min)；

第二步：第一步反應(yīng)后大米蛋白溶液中加入中性蛋白酶(加入量5600U/g蛋白)，在40/45/50/55/60℃的恒溫水浴振蕩器中進行酶解2h；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液；

第四步：上清液即為苯丙氨酸充分游離的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

中性蛋白酶不同酶解溫度對苯丙氨酸游離效果影響的結(jié)果見圖3。由圖3可以看出：中性蛋白酶推薦最適溫度是50℃。在45-50℃之間，游離苯丙氨酸量顯著升高，溫度在50℃以上，游離苯丙氨酸量先趨于平緩后呈下降趨勢，這可能是由于中性蛋白酶活性在50℃左右達到最高，但考慮到資源成本的節(jié)約，選定50℃作為最適酶解溫度。

實驗例4鏈霉蛋白酶酶解時間對苯丙氨酸游離效果的影響

第一步：將大米蛋白用水配制成質(zhì)量百分濃度為1％的大米蛋白溶液，經(jīng)超聲波細胞粉碎處理(功率300W，超聲5s，間隔4s，共計6min)；

第二步：第一步反應(yīng)后加入中性蛋白酶(加入量5600U/g蛋白)，在50℃的恒溫水浴振蕩器中進行酶解2h；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后，加入鏈霉蛋白酶(加入量100U/g蛋白)混合均勻，在37℃的恒溫水浴振蕩器中進行酶解1/2/3/4/5h；

第四步：第三步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第五步：上清液即為苯丙氨酸充分游離的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

鏈霉蛋白酶不同酶解時間對苯丙氨酸游離效果影響的結(jié)果見圖4。由圖4可以看出：在鏈霉蛋白酶酶解1-2h內(nèi)，游離苯丙氨酸量逐漸升高，2-3h內(nèi)，游離苯丙氨酸量逐漸下降，3h后游離苯丙氨酸量基本保持不變，這可能是由于在3h左右，鏈霉蛋白酶與底物充分接觸，苯丙氨酸在該反應(yīng)條件下已充分游離，在中性蛋白酶酶解后，鏈霉蛋白酶對大米蛋白水解液進行特異性剪切。因此，選擇2h作為鏈霉蛋白酶的最佳酶解時間。

實驗例5鏈霉蛋白酶加入量對苯丙氨酸游離效果的影響

第一步：將大米蛋白用水配制成質(zhì)量百分濃度為1％的大米蛋白溶液，經(jīng)超聲波細胞粉碎處理(功率300W，超聲5s，間隔4s，共計6min)；

第二步：第一步反應(yīng)后加入中性蛋白酶(加入量5600U/g蛋白)，在50℃的恒溫水浴振蕩器中進行酶解2h；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后，加入鏈霉蛋白酶(加入量50/74/98/122/146U/g蛋白)混合均勻，在37℃的恒溫水浴振蕩器中進行酶解2h；

第四步：第三步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第五步：上清液即為苯丙氨酸充分游離的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

鏈霉蛋白酶加入量對苯丙氨酸游離效果影響的結(jié)果見圖5。由圖5可以看出：在鏈霉蛋白酶加入量在50-98U/g蛋白范圍內(nèi)，游離苯丙氨酸量顯著升高，但如果加入量高于98U/g蛋白，游離苯丙氨酸量劇烈下降。這可能是由于鏈霉蛋白酶可作用的酶切位點已充分反應(yīng)，苯丙氨酸已從大米蛋白中充分解離出來，加酶量過多會使在反應(yīng)中自我分解，導致苯丙氨酸不能充分游離。因此，選擇98U/g蛋白作為鏈霉蛋白酶的最佳加入量。

實驗例6鏈霉蛋白酶酶解溫度對苯丙氨酸游離效果的影響

第一步：將大米蛋白用水配制成質(zhì)量百分濃度為1％的大米蛋白溶液，經(jīng)超聲波細胞粉碎處理(功率300W，超聲5s，間隔4s，共計6min)；

第二步：第一步反應(yīng)后加入中性蛋白酶(加入量5600U/g蛋白)，在50℃的恒溫水浴振蕩器中進行酶解2h；

第三步：第二步反應(yīng)結(jié)束后，加入鏈霉蛋白酶(加入量98U/g蛋白)混合均勻，在恒溫水浴振蕩器中進行酶解2h，酶解溫度控制在30/35/40/45/50℃；

第四步：第三步反應(yīng)結(jié)束后取出，放入90℃恒溫水浴中保持l0min，使蛋白酶失活，4200r/min離心20min取上清液即得大米蛋白酶解液；

第五步：上清液即為苯丙氨酸充分游離的大米蛋白溶液，該溶液經(jīng)冷凍干燥保存。

鏈霉蛋白酶酶解溫度對苯丙氨酸游離效果影響的結(jié)果，見圖6。由圖6可以看出：在30-50℃范圍內(nèi)，游離苯丙氨酸量先升高后趨于平緩，溫度在40℃以上，游離苯丙氨酸量顯著下降，這是因為溫度過高，酶活逐漸下降，反應(yīng)效率低，考慮到經(jīng)濟效益。因此，選擇35℃作為鏈霉蛋白酶最佳酶解溫度。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。