本發(fā)明涉及長鏈菊粉調(diào)節(jié)急性胰腺炎癥及其引起的相關(guān)組織損傷的作用，屬于急性胰腺炎的預(yù)防和治療技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

菊粉是一類天然果聚糖的混合物。果聚糖是果糖單元通過(2-1)鏈聯(lián)接而成并以葡萄糖單元終止的碳水化合物，以膠體形態(tài)含于細(xì)胞的原生質(zhì)中。主要見于菊科植物，例如，在菊芋的塊莖、天竺牡丹(大理菊)的塊根、薊的根。研究表明，膳食中的長鏈菊粉可以緩解壞死性結(jié)腸炎患者癥狀，低發(fā)酵寡聚糖、二糖、多元醇飲食可有效減少腸易激綜合征患者功能性胃腸癥狀，這說明長鏈菊粉在提供營養(yǎng)的同時(shí)對炎癥也具有一定的調(diào)節(jié)作用。

急性胰腺炎作為重要的消化疾病之一，會引起全身炎癥反應(yīng)綜合征以及多器官功能綜合不全征，包括腸道屏障受損等，其具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。急性胰腺炎與結(jié)腸炎的起因及部位不同，其治療干預(yù)策略也不相同，如丁酸及丁酸梭菌對結(jié)腸炎具有緩解作用，但卻對急性胰腺炎無保護(hù)作用。如何更有效的預(yù)防急性胰腺炎的發(fā)生、在臨床上如何更有效的阻斷炎癥擴(kuò)散、治療急性胰腺炎，使它避免發(fā)展成重癥急性胰腺炎甚至胰腺癌，從而減少胰腺炎的病死率以及并發(fā)癥發(fā)生率，探明急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制并開發(fā)相應(yīng)的預(yù)防和治療方法就尤為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明證明了長鏈菊粉對雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎小鼠發(fā)揮預(yù)防作用，并降低組織炎癥程度。本發(fā)明涉及的長鏈菊粉，在安全劑量范圍內(nèi)對雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎小鼠發(fā)揮保護(hù)作用，降低炎癥程度，可作為有效成分添加到防治急性胰腺炎的膳食中。

本發(fā)明所使用的長鏈菊粉結(jié)構(gòu)式如式(1)所示：

其中，n＝10～60

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種預(yù)防和/或緩解和/或輔助治療和/或治療急性胰腺炎的藥物或者藥物組合物，其特征在于，所述藥物或者藥物組合物以長鏈菊粉作為主要有效成分。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述藥物或者藥物組合物還包括藥學(xué)上可接受的賦型劑。所述藥學(xué)上可接受的賦型劑是指任何可用于藥學(xué)領(lǐng)域的稀釋劑、輔助劑和/或載體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的長鏈菊粉可以與其他活性成分組合使用，只要它們不產(chǎn)生其他不利的作用，例如過敏反應(yīng)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物或者藥物組合物可配制成若干種劑型，其中含有藥學(xué)領(lǐng)域中常用的一些賦形劑；例如，口服制劑(如片劑，膠囊劑，溶液或混懸液)；可注射的制劑(如可注射的溶液或混懸液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制劑(例如軟膏或溶液)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，用于本發(fā)明藥物組合物的載體是藥學(xué)領(lǐng)域中可得到的常見類型，包括：口服制劑用的粘合劑、潤滑劑、崩解劑、助溶劑、稀釋劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、無色素、矯味劑等；可注射制劑用的防腐劑、加溶劑、穩(wěn)定劑等；局部制劑用的基質(zhì)、稀釋劑、潤滑劑、防腐劑等。藥物制劑可以經(jīng)口服或胃腸外方式(例如靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或局部)給藥，如果某些藥物在胃部條件下是不穩(wěn)定的，可將其配制成腸衣片劑。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述長鏈菊粉是式(1)中的任一單體或者兩種以上單體按照任意比例混合得到的，都能降低血清胰脂肪酶和/或胰腺組織中MPO表達(dá)量、降低血清淀粉酶水平、調(diào)節(jié)炎癥水平。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述長鏈菊粉是一類天然果聚糖的混合物，可購自荷蘭sensus公司、比利時(shí)beneo orafti公司或者上海開楷貿(mào)易有限公司等，也可購自生產(chǎn)或者銷售式(1)長鏈菊粉的公司、生產(chǎn)或者銷售以式(1)長鏈菊粉為主要成分的可用于藥物或者食品的混合物的公司。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種預(yù)防和/或緩解和/或輔助治療和/或治療急性胰腺炎的食品，所述食品以長鏈菊粉作為主要有效成分。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述食品包括保健食品、飲品、腸內(nèi)營養(yǎng)制劑、膳食補(bǔ)充劑等。

本發(fā)明本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種降低血清胰脂肪酶和/或胰腺組織中MPO表達(dá)量的制劑，所述制劑是以有效劑量的長鏈菊粉作為主要活性成份。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種降低血清淀粉酶水平和/或提高胰腺組織中抑炎因子IL10表達(dá)水平的制劑，所述制劑是以有效劑量的長鏈菊粉作為主要活性成份。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種降低胰腺組織中促炎癥因子TNF-α，IL1β表達(dá)水平的制劑，所述制劑是以有效劑量的長鏈菊粉作為主要活性成份。

本發(fā)明的制劑是指藥物、保健食品、飲品、腸內(nèi)營養(yǎng)制劑、膳食補(bǔ)充劑、獸藥或者飼料添加劑等。

本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供長鏈菊粉的新應(yīng)用；所述長鏈菊粉結(jié)構(gòu)式如下：

其中，n＝10～60。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是制備預(yù)防和/或緩解和/或輔助治療和/或治療急性胰腺炎的藥物、保健食品、飲品、腸內(nèi)營養(yǎng)制劑、膳食補(bǔ)充劑、獸藥或者飼料添加劑方面的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是制備降低血清胰脂肪酶和/或胰腺組織中MPO表達(dá)量，或者降低胰腺組織中促炎癥因子TNF-α和/或IL1β表達(dá)水平的藥物、保健食品、飲品、腸內(nèi)營養(yǎng)制劑、膳食補(bǔ)充劑、獸藥或者飼料添加劑方面的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述應(yīng)用，是制備降低血清淀粉酶水平或者提高胰腺組織中抑炎因子IL10表達(dá)水平的藥物、保健食品、飲品、腸內(nèi)營養(yǎng)制劑、膳食補(bǔ)充劑、獸藥或者飼料添加劑方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明證明了只需要進(jìn)行短期長鏈菊粉喂食(3天)即可對雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎發(fā)揮保護(hù)作用，可作為有效的成分添加到防治急性胰腺炎的藥物當(dāng)中，降低臨床上急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展和炎癥程度。此外，發(fā)明人也曾嘗試以短鏈菊粉(n＜10)進(jìn)行喂食，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對于雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎無法發(fā)揮保護(hù)作用。

本發(fā)明通過長鏈菊粉對雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎模型進(jìn)行預(yù)防性處理，對其胰腺組織進(jìn)行病理組織形態(tài)觀察，小鼠血清胰脂肪酶、血清淀粉酶、組織中炎癥細(xì)胞釋放酶MPO的水平、組織及血清中抑炎因子IL10和促炎性細(xì)胞因子TNFα，IL1β進(jìn)行測定。比較長鏈菊粉處理組與炎癥模型組小鼠的各個(gè)指標(biāo)水平，長鏈菊粉處理組小鼠各項(xiàng)指標(biāo)顯著優(yōu)于炎癥模型組。

附圖說明

圖1是用髓過物氧化酶試劑盒、血清淀粉酶試劑盒和血清胰脂肪酶酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒分別測定的小鼠胰腺組織中髓過物氧化酶(MPO)水平(圖1A)、血清中的淀粉酶(AMY)水平(圖1B)以及血清中的胰脂肪酶(lipase)(圖1C)，比較長鏈菊粉處理組與炎癥模型組的炎癥程度；其中，control表示對照組，AP表示急性胰腺炎模型組，ITF IV表示長鏈菊粉預(yù)防處理組。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

圖2是用HE染色的方法觀察胰腺組織的病理變化；其中，control表示對照組，AP表示急性胰腺炎模型組，ITF IV表示長鏈菊粉預(yù)防處理組。

圖3是用酶聯(lián)免疫吸附法測定小鼠胰腺組織勻漿上清液中的炎癥因子釋放水平，比較長鏈菊粉處理組與炎癥模型組的炎癥程度；其中，腫瘤壞死因子用TNF-α表示(圖3A)，白介素因子用IL10(圖3B，圖3C)、IL1β(圖3D，圖3E)表示，control表示對照組，AP表示急性胰腺炎模型組，ITF IV表示長鏈菊粉預(yù)防處理組。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

圖4是用熒光定量PCR測定小鼠結(jié)腸組織中緊密連接蛋白的mRNA表達(dá)，比較長鏈菊粉處理組與炎癥模型組的結(jié)腸緊密程度；其中，緊密連接蛋白用ZO1，occludin表示，control表示對照組，AP表示炎癥模型組，ITF IV表示長鏈菊粉預(yù)防處理組。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

圖5是用酶聯(lián)免疫吸附法測定小鼠結(jié)腸組織勻漿上清液中的炎癥因子釋放水平，比較長鏈菊粉處理組與炎癥模型組的炎癥程度；其中，白介素因子用IL10、IL1β表示(圖5B、C)，腫瘤壞死因子用TNF-α表示(圖5A)，control表示對照組，AP表示炎癥模型組，ITF IV表示長鏈菊粉預(yù)防處理組。*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1.急性胰腺炎模型建立

將8周齡雌性BALB/C小鼠隨機(jī)分成對照組(control)、急性胰腺炎組(AP)、長鏈菊粉預(yù)防組(ITF IV)，采用腹腔注射的方式分別給對照組、急性胰腺炎組及預(yù)防組小鼠注射生理鹽水(0.90％)和雨蛙素(50ug/kg)；每小時(shí)注射一次，連續(xù)注射8次。實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，三組小鼠喂食飼料相同，除預(yù)防組于注射雨蛙素造模前連續(xù)攝入三天5％(長鏈菊粉質(zhì)量g/普通小鼠飼料總重g)長鏈菊粉飼料。長鏈菊粉購自荷蘭sensus公司。

實(shí)施例2.長鏈菊粉抵抗急性胰腺炎發(fā)生時(shí)胰腺組織MPO的表達(dá)

白細(xì)胞尤其中性粒細(xì)胞的活化作為急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制中的重要一環(huán)，在其病理過程中發(fā)揮著極其重要的作用。MPO是中性粒細(xì)胞的功能標(biāo)志和激活標(biāo)志，其水平及活性變化代表著嗜中性多形核白細(xì)胞的功能和活性狀態(tài)。中性白細(xì)胞中存在有髓過氧化酶，每個(gè)細(xì)胞所含的酶的量是一定的，約占細(xì)胞干重的5％，該酶具有使過氧化氫還原的能力，利用這一特點(diǎn)可以分析酶的活力，并測定中心白細(xì)胞的數(shù)目。其原理如下：

MPO+H₂O₂→復(fù)合物；復(fù)合物+AH₂(供氫體)→H₂O+MPO+A產(chǎn)物

通過供氫體鄰連茴香胺供氫后生成黃色化合物，在460nm處通過比色測定A產(chǎn)物的生成量，從而推算出MPO的活力及H₂O₂減少的量和白細(xì)胞的數(shù)目。如圖1A，結(jié)果表明，急性胰腺炎組的胰腺M(fèi)PO活力較正常組明顯上升，長鏈菊粉處理組的MPO活力較疾病組明顯下降。由此可得，經(jīng)長鏈菊粉預(yù)防處理后急性胰腺炎小鼠的胰腺M(fèi)PO活力顯著下調(diào)，從而改善急性胰腺炎。

實(shí)施例3.長鏈菊粉降低急性胰腺炎發(fā)生時(shí)血清淀粉酶(AMY)的水平

已有數(shù)據(jù)顯示，90％以上急性胰腺炎患者的血清中的AMY都會增高，因此本發(fā)明檢測了AMY含量變化。

淀粉酶能水解淀粉生成葡萄糖、麥芽糖及糊精，在底物濃度已知并且過量的情況下，加入碘液與未水解的淀粉生成藍(lán)色復(fù)合物，根據(jù)藍(lán)色的深淺可推算出水解的淀粉量，從而計(jì)算出AMY的活力。如圖1B，結(jié)果顯示，急性胰腺炎組的AMY活力較正常組明顯上升，長鏈菊粉處理組的AMY活力較疾病組明顯下降。由此可得，經(jīng)長鏈菊粉預(yù)防處理后急性胰腺炎小鼠的AMY活力顯著下調(diào)，從而改善急性胰腺炎。

實(shí)施例4.長鏈菊粉降低急性胰腺炎發(fā)生時(shí)血清胰脂肪酶(lipase)的水平

血清淀粉酶增高程度常與病情嚴(yán)重程度不成正比，且血清淀粉酶也可以在除急性胰腺炎以外的許多疾病中升高，如胃穿孔，胰腺腫瘤等。因此單獨(dú)用血清淀粉酶診斷急性胰腺炎是有局限性的。血清脂肪酶在急性胰腺炎發(fā)病后活性升高，也可用于急性胰腺炎的測定。通常但其特異性更高，持續(xù)時(shí)間更長，因此，對血清脂肪酶進(jìn)行測定以驗(yàn)證結(jié)論的準(zhǔn)確性。

采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定小鼠血清lipase水平。分別向預(yù)先包被了小鼠lipase單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入lipase溫育；溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗lipase抗體，再與聯(lián)袂親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中小鼠lipase的濃度呈正相關(guān)。如圖1C，結(jié)果顯示，AP小鼠的血清胰脂肪酶較control組小鼠高，且ITF IV小鼠的血清胰脂肪酶較急性胰腺炎小鼠明顯下調(diào)。由此可得，經(jīng)長鏈菊粉預(yù)防處理后急性胰腺炎小鼠血清胰脂肪酶在血清中的表達(dá)水平顯著降低，從而改善急性胰腺炎。

實(shí)施例5.長鏈菊粉緩解小鼠急性胰腺炎胰腺組織水腫及炎癥浸潤程度

用HE染色的方法，將對照組(control)、炎癥模型組(AP)、表示長鏈菊粉預(yù)防處理組(ITF IV)的胰腺經(jīng)固定、脫水、染色、脫蠟、透明和封片等主要過程，觀察胰腺組織的組織完整性，胰腺水腫程度和炎癥細(xì)胞浸潤程度。如圖2，結(jié)果顯示，control組胰腺組織結(jié)構(gòu)密實(shí)，無明顯裂紋。AP小鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)疏松，有明顯水腫及炎癥浸潤現(xiàn)象，而ITF IV組較AP組則有明顯的改善作用。

實(shí)施例6.長鏈菊粉減少急性胰腺炎小鼠胰腺組織中炎癥因子的釋放

在急性胰腺炎中，TNFα與IL1β是促炎因子。急性胰腺炎發(fā)生后TNFα高表達(dá)，阻斷其升高可減輕炎癥病情。IL1β在急性胰腺炎早期即升高，并與TNFα協(xié)同作用，不但可以刺激自身的釋放，還可以促進(jìn)彼此的釋放。IL10是一種有效的炎癥抑制因子，能降低血清淀粉酶，抑制炎癥炎癥介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的多種功能，包括TNF和IL1的產(chǎn)生，減輕胰腺組織水腫、出血，減輕胰腺炎的嚴(yán)重程度。

采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定小鼠胰腺組織5％勻漿上清液IL10、IL1β和TNFα水平。分別向預(yù)先包被了小鼠IL10、IL1β和TNFα單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入IL10、IL1β和TNFα，溫育；溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗IL10、IL1β和TNFα抗體，再與聯(lián)袂親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中小鼠IL10、IL1β和TNFα的濃度呈正相關(guān)。如圖3A，結(jié)果顯示，AP組胰腺TNFα水平明顯高于control組，而ITF IV組的TNFα水平相較于AP組則顯著下調(diào)。如圖3B和3C，AP組胰腺與血清中IL10水平明顯低于control組，而ITF IV組的IL10水平相較于AP組則顯著上升。如圖3D和3E，AP組胰腺與血清中IL1β水平明顯高于control組，而ITF IV組的IL1β水平相較于AP組則顯著下調(diào)。綜上可得，經(jīng)長鏈菊粉預(yù)防處理后，能夠急性胰腺炎小鼠IL1β和TNFα在其胰腺組織及血清中的表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)IL10在其胰腺組織及血清中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，從而改善急性胰腺炎的胰腺炎癥程度。

實(shí)施例7.長鏈菊粉緩解小鼠急性胰腺炎引起的結(jié)腸組織通透程度。

急性胰腺炎的發(fā)生會導(dǎo)致腸道屏障受損，腸道通透性降低。緊密連接蛋白(ZO1、occludin)的含量是反映腸道組織緊密與通透程度的重要指標(biāo)。

采用熒光定量PCR法(QPCR)測定小鼠結(jié)腸組織的緊密連接蛋白mRNA表達(dá)相對含量。組織樣品通過使用高通量組織研磨機(jī)在trizol中進(jìn)行破碎，之后使用氯仿等進(jìn)行抽提，離心后吸取上清，加入等體積的異丙醇進(jìn)行沉淀RNA，離心后棄上清，用75％乙醇DEPC進(jìn)行洗滌所得RNA。對得到的RNA進(jìn)行濃度和純度的測量后，使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將組織樣品中的RNA反轉(zhuǎn)到cDNA。根據(jù)mRNA設(shè)計(jì)的引物在正式實(shí)驗(yàn)前需進(jìn)行QPCR測試其特異性和擴(kuò)增效率，得到結(jié)果后，首先根據(jù)熔解曲線判斷引物特異性，選擇標(biāo)準(zhǔn)為：單峰且峰形偏窄，無明顯引物二聚體熔解曲線峰。引物驗(yàn)證結(jié)果良好后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn).

使用SYBR Green mix進(jìn)行相關(guān)基因的擴(kuò)增檢測。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)熱30秒；95℃5分鐘；接下來循環(huán)39次：95℃30秒；58℃30秒；之后進(jìn)行引物特異性檢測，從65℃保持5秒之后每秒上升0.1℃至95℃，觀察引物特異性。如圖4，結(jié)果顯示，AP組結(jié)腸ZO1和occludin的mRNA水平明顯低于control組，而ITF IV組的ZO1和occludin的mRNA水平相較于AP組則顯著上升。由此可得，經(jīng)長鏈菊粉預(yù)防處理后，急性胰腺炎小鼠腸道緊密連接蛋白(ZO1，occludin)的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，其從而改善由急性胰腺炎引起的腸道組織通透程度減弱。

實(shí)施例8.長鏈菊粉減少急性胰腺炎小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子的釋放

急性胰腺炎會導(dǎo)致腸道屏障受損，其中包括腸道炎癥的發(fā)生。TNFα與IL1β是促炎因子，IL10是一種有效的炎癥抑制因子。本發(fā)明中研究了短期長鏈菊粉喂食對由急性胰腺炎引起的腸道組織損傷，包括炎癥的改善。

采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定小鼠結(jié)腸組織5％勻漿上清液IL10、IL1β和TNF-α水平。分別向預(yù)先包被了小鼠IL10、IL1β和TNF-α單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加入IL10、IL1β和TNF-α，溫育；溫育后，加入生物素標(biāo)記的抗IL10、IL1β和TNF-α抗體，再與聯(lián)袂親和素-HRP結(jié)合，形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中小鼠IL10、IL1β和TNF-α的濃度呈正相關(guān)。如圖5A和5C，結(jié)果顯示，AP組結(jié)腸TNFα與IL1β水平明顯高于control組，而ITF IV組的TNFα與IL1β水平相較于AP組則顯著下調(diào)。如圖5B，AP組結(jié)腸中IL10水平明顯低于control組，而ITF IV組的IL10水平相較于AP組則顯著上升。綜上可得，經(jīng)長鏈菊粉預(yù)防處理后，急性胰腺炎小鼠IL1β和TNF-α在結(jié)腸組織中的表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)IL10在結(jié)腸組織中的表達(dá)水平顯著上調(diào)，從而改善由急性胰腺炎引起的腸道炎癥程度。

綜上，本發(fā)明采用短期長鏈菊粉喂食(3天)的方法，對雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎模型進(jìn)行預(yù)防性處理，發(fā)現(xiàn)短期長鏈菊粉喂食可對雨蛙素誘導(dǎo)的小鼠急性胰腺炎發(fā)揮保護(hù)作用，可作為有效的成分添加到防治急性胰腺炎的藥物當(dāng)中，降低臨床上急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展和炎癥程度。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。