本發(fā)明涉及一種輻照降解赭曲霉毒素的方法，特別是涉及一種利用γ射線輻照降解赭曲霉毒素A的方法。
背景技術(shù)：
赭曲霉毒素主要是由曲霉屬中的赭曲霉和青霉屬中的純綠青霉產(chǎn)生的一種有毒代謝產(chǎn)物。赭曲霉毒素分為A、B、C、D四種，化學結(jié)構(gòu)極為相似，其中，對人類和動植物危害最大的是赭曲霉毒素A，即OTA(Ochratoxin A，以下簡稱為OTA)，OTA是苯丙氨酸與異香豆素反應(yīng)衍生出的一種無色結(jié)晶化合物，分子式為C20H18ClNO6，摩爾分子量為403.82g/mol，結(jié)構(gòu)式如圖1所示。易溶于極性有機溶劑，微溶于水，其OTA的甲醇溶液在冰箱中保存一年不會分解。在紫外照射下OTA呈綠色熒光，其最大吸收波長為333nm。1993年，國際癌癥機構(gòu)(IARC)將OTA列為一種可能對人類有致癌作用的真菌毒素。
由于OTA產(chǎn)生菌在自然界的廣泛分布，農(nóng)產(chǎn)品便成為了其主要污染對象。全世界范圍內(nèi)，OTA的污染非常嚴重，廣泛存在于各種農(nóng)產(chǎn)品和飼料中。1996年和1997年，世界上玉米中OTA污染率和污染水平最高的國家-克羅地亞對國內(nèi)產(chǎn)105份玉米和104份玉米中OTA的污染水平進行檢測，結(jié)果表明：OTA平均含量分別為3.61μg/kg和19.8μg/kg，最高污染水平高達224μg/kg和614μg/kg。另外，許多國家的調(diào)查顯示其各類農(nóng)產(chǎn)品中都存在著不同程度的OTA污染，我國農(nóng)產(chǎn)品中同樣存在著嚴重的OTA污染。調(diào)查顯示，在植物性食品中，谷類的OTA污染率高較高，其中玉米的污染率為4.32％，平均污染水平為8～80μg/kg，而最大污染水平達201μg/kg，小麥的污染率高達12.43％，咖啡、葡萄及葡萄酒、干果、啤酒中也有OTA污染；在動物性食品中，對奶及奶制品的危害較大。2006年，對河北省食管癌、胃癌高發(fā)區(qū)的磁縣和贊皇縣居民食用小麥OTA污染情況分析發(fā)現(xiàn)，OTA的檢出率為45.16％，平均含量2.41μg/kg，最高達14.25μg/kg。2008年，楊家玲檢測了采自全國18個大城市的主要糧食類486個樣品中OTA的含量，將檢測結(jié)果與國內(nèi)和國際允許最高限量標準進行了比較，有3個大米樣品、6個掛面樣品、1個面粉樣品、2個大豆樣品的OTA含量超過國家標準；OTA在全國糧食類食品中的檢出陽性率為2.47％；共有6個抽樣城市出現(xiàn)了陽性樣本；掛面共抽取51個樣本,有6個掛面樣品超過我國國家標準的最高限量5μg/kg，約占掛面總樣本量的11.8％,是調(diào)查的糧食類食品中污染最嚴重的。第56次FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)暫定OTA對人體的每周最大耐受量為100ng/kg.bw，國際健康組織建議谷物中OTA的最高濃度為5.0μg/kg，目前我國和歐盟也采用了這一限量標準?？梢?，所調(diào)查樣本中存在著不同的OTA污染。
由于OTA在農(nóng)產(chǎn)品中的污染較為嚴重對人和動物的健康造成很大的危害，目前對其中毒機理和毒性的研究很多。其毒作用可能的作用機理主要表現(xiàn)為：破壞鈣離子的動態(tài)平衡；影響蛋白質(zhì)的合成；能夠抑制線粒體的呼吸作用以及對DNA造成破壞；促進膜脂質(zhì)的過氧化。研究表明：OTA具有強烈的腎毒性，肝毒性，神經(jīng)毒性和免疫毒性，并具有一定的致畸，致癌，致突變性。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種輻照降解赭曲霉毒素的方法，其能高效的降解玉米及玉米制品中的赭曲霉毒素A。
為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種輻照降解赭曲霉毒素的方法，包括：
步驟一、將待降解樣品用清水淋洗，烘干至其含水量≤10％，研磨成粒徑為20mm的顆粒，置于體積濃度為70％的乙醇溶液中，浸泡2h后，水浴溫度為30℃下，水浴超聲5min；
步驟二、采用γ輻照經(jīng)步驟一處理后的待降解樣品，輻照劑量為4kGy；
步驟三、檢測經(jīng)步驟二處理后的待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度，若待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度≤5μg/Kg，則待降解樣品合格；若待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度＞5μg/Kg，則采用γ輻照待降解樣品，輻照劑量為5～10kGy，直至待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度≤5μg/Kg。
優(yōu)選的是，所述的輻照降解赭曲霉毒素的方法中，所述步驟一中，乙醇溶液的體積與待降解樣品的體積比為3:1。
優(yōu)選的是，所述的輻照降解赭曲霉毒素的方法中，所述步驟三中，若待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度＞5μg/Kg，則采用γ輻照待降解樣品，輻照劑量為6kGy。
優(yōu)選的是，所述的輻照降解赭曲霉毒素的方法中，所述步驟三中，若待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度＞5μg/Kg，則采用γ輻照待降解樣品，輻照劑量為10kGy。
優(yōu)選的是，所述的輻照降解赭曲霉毒素的方法中，所述步驟三中，檢測經(jīng)步驟二處理后的待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度，具體為：
a、分別采用體積濃度為50％的甲醇溶液配制濃度為1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml和100μg/ml的標準赭曲霉毒素A溶液，采用高效液相色譜檢測標準赭曲霉毒素A溶液，建立赭曲霉毒素A濃度與峰面積的標準曲線；
b、稱取20g經(jīng)過步驟三輻照后的待降解樣本，置于烘干裝置中，在溫度為70℃下，烘干1h，加入5g氯化鈉和75mL提取液，攪拌，過濾，得到第一濾液，量取10mL第一濾液，將量取的第一濾液用水稀釋至50mL，得到第二濾液，過濾第二濾液，直至其澄清；
c、將赭曲霉毒素A免疫親和柱與固相萃取裝置連接，向?qū)Ⅳ髑苟舅谹免疫親和柱中加入10mL第二濾液，將真空泵與固相萃取裝置連接，調(diào)節(jié)壓力，使赭曲霉毒素A免疫親和柱中液體流速為1滴/s，當空氣進入赭曲霉毒素A免疫親和柱時，依次用10mL真菌清洗緩沖液和10mL水淋洗，直至空氣再次進入赭曲霉毒素A免疫親和柱時，棄去全部由赭曲霉毒素A免疫親和柱中流出液體，抽干赭曲霉毒素A免疫親和柱中溶液；
d、向赭曲霉毒素A免疫親和柱中加入1mL洗脫液，流速為1滴/s，收集洗脫液，用甲醇溶液定容為1mL，采用高效液相色譜測定，根據(jù)a中建立的赭曲霉毒素A濃度與峰面積的標準曲線和高效液相色譜測出的待降解樣本中赭曲霉毒素A的峰面積，計算出經(jīng)步驟二處理后的待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度，其中，洗脫液為甲醇溶液。
優(yōu)選的是，所述的輻照降解赭曲霉毒素的方法中，所述b中，提取液的制備為：
將150g氯化鈉、20g碳酸氫鈉溶于950mL水中，加入水定容至1mL，即得到提取液。
優(yōu)選的是，所述的輻照降解赭曲霉毒素的方法中，所述c中，真菌清洗緩沖液的制備為：
將25g氯化鈉、5.0g碳酸氫鈉溶于200mL水中，搖勻，加入0.1g吐溫-20，加入水定容至1mL，即得到真菌清洗緩沖液。
優(yōu)選的是，所述的輻照降解赭曲霉毒素的方法中，待降解樣品為受赭曲霉毒素A污染的玉米或玉米制品。
本發(fā)明至少包括以下有益效果：本發(fā)明中采用γ射線輻照降解玉米及其制品的赭曲霉毒素A，其不僅能有效的降解赭曲霉毒素A，而且不會損害玉米及其制品的營養(yǎng)成分，同時本發(fā)明中，采用將玉米及其制品研磨成小粒和浸泡在乙醇溶液中的前處理，研磨成小粒不僅提高了在乙醇中的浸泡效果，而且增加了輻照的面積，而在乙醇中浸泡能有效的提高γ射線對赭曲霉毒素A對降解。
本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實施例1中玉米樣品的輻照降解率。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。
應(yīng)當理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。
實施例1、
驗證γ射線對OTA的降解
1、試驗器材：
Agilent1100液相系統(tǒng)(美國Agilent公司)；Agilent 6510系列四級桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Agilent公司)；FW100高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；LD4-2低俗離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；固相萃取裝置(美國Supelco公司)；Oasis HLB固相萃取柱(3cc/60mg，Waters公司)；甲醇(色譜純Fisher)；正己烷(色譜純，天津市大茂化學試劑廠)；氯化鈉、碳酸氫鈉、甲酸，為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；超純水。OTA標準品10mg(購于Fermentek公司，CAS 303-47-9，純度>99.0％)；
2、分析檢測條件如下所示：
色譜條件：
色譜柱：Innoval C18柱、250mm×4.6mm×5μm；流動相為：(甲醇):V(水):V(甲酸)＝60：40：0.1；柱溫：35℃；進樣體積：5μL；熒光檢測器：激發(fā)波長333nm，發(fā)射波長477nm。
質(zhì)譜條件：
離子源：電噴霧離子源；毛細管電壓：4.0kV；極性模式：正離子；碰撞氣：N2；碎裂電壓：125V；錐孔電壓：65V；霧化氣壓力：45psi；霧化氣溫度：350℃；干燥氣體流速：9L/min；掃描質(zhì)量范圍：100–1000m/z；采集速率：1.4spectra/s。
3、玉米中OTA檢測方法的建立
(1)樣品染毒處理
向1千克玉米中添加2mL OTA標準溶液，在20℃，濕度為85％的條件下培養(yǎng)14d，得到玉米樣品，其中，玉米樣品中OTA含量為71μg/kg。
(2)樣品制備
提取：將玉米樣品研磨成粉末，準確稱取20g磨碎的玉米樣品，加入5.0g氯化鈉以及75mL提取液，高速攪拌提取2min，過濾，準確量取10ml濾液同時加入40ml水稀釋，過濾至濾液澄清。
凈化：將OTA免疫親和柱連接于固相萃取裝置上，準確加入10.0mL濾液注入小柱中，將真空壓力泵與固相萃取裝置相連接，調(diào)節(jié)壓力，使溶液以1滴/s的速度通過小柱，直至空氣進入小柱中，依次用10mL真菌清洗緩沖液以及10mL水淋洗小柱，直至空氣進入，棄去全部流出液，抽干小柱。
洗脫：準確加入1mL甲醇進行洗脫，流速為1滴/s，收集洗脫液于1mL容量瓶中，用甲醇定容至1mL，供高效液相色譜測定。
(3)回收率實驗
檢測方法的準確度用加標回收率來衡量。在同一玉米樣品中分別添加高、中、低(50、20、5μg/kg)的OTA，分析測定得到玉米中OTA的回收率，見表1。
表1玉米中OTA的加標回收率
由表中數(shù)據(jù)可見，玉米中OTA的加標回收率較高，當添加濃度為20μg/kg時，回收率達100.74％，此外三種不同添加濃度的變異系數(shù)都較低，表明該方法的準確度可以滿足玉米中OTA的檢測要求。
4、γ射線輻照降解玉米中的赭曲霉毒素A及測定結(jié)果
將含有OTA的玉米于中國農(nóng)業(yè)輻照中心60Co-γ輻照裝置中進行輻照處理，平均劑量率為0.31Gy/s。輻照劑量為0、2、4、6、8、10kGy。用重鉻酸銀Ag2Cr2O7劑量計跟蹤比對，測定樣品的實際吸收劑量。每一處理設(shè)置3個平行樣品。
輻照后的含有OTA的玉米樣品經(jīng)過提取、凈化、檢測后根據(jù)高效液相色譜的峰面積以及標準曲線，計算出OTA的濃度，從而得到輻照后玉米中OTA的濃度，除以未輻照時玉米中OTA的濃度即可得到降解率，見圖1。
在圖1中，X軸為輻照劑量，Y軸為降解率，從圖1中可以看出，玉米樣品中的OTA經(jīng)過γ射線輻照后，隨著輻照劑量的增加，OTA的降解率逐漸增加，在10kGy時，玉米樣品中OTA的降解率可達到50％。目前，我國國家標準規(guī)定谷物中OTA的限量標準為5μg/kg，當OTA含量為8μg/kg時，經(jīng)10kGy劑量輻照后可達到國家規(guī)定的標準。由此可見，γ射線輻照可以實現(xiàn)對玉米中OTA的降解，降解效果顯著。
實施例2、
本實施例中待降解樣品為受赭曲霉毒素A污染的玉米或玉米制品。
一種輻照降解赭曲霉毒素的方法，包括：
步驟一、將待降解樣品采用清水淋洗，烘干至其含水量≤10％，研磨成粒徑為20mm的顆粒，置于體積濃度為70％的乙醇溶液中，浸泡2h后，水浴溫度為30℃下，水浴超聲5min，其中，乙醇溶液的體積與待降解樣品的體積比為3:1；
步驟二、采用γ輻照經(jīng)步驟一處理后的待降解樣品，輻照劑量為4kGy；
步驟三、檢測經(jīng)步驟二處理后的待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度，若待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度≤5μg/Kg，則待降解樣品合格；若待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度＞5μg/Kg，則采用γ輻照待降解樣品，輻照劑量為5～10kGy，檢測待降解樣品中赭曲霉毒素A濃度，若＞5μg/Kg，繼續(xù)采用γ輻照待降解樣品，輻照劑量為5～10kGy，直至待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度≤5μg/Kg，若≤5μg/Kg，則待降解樣品合格，優(yōu)選輻照劑量為6kGy和10kGy；其中，檢測經(jīng)步驟二處理后的待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度，具體為：
a、分別采用體積濃度為50％的甲醇溶液配制濃度為1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml和100μg/ml的標準赭曲霉毒素A溶液，采用高效液相色譜檢測標準赭曲霉毒素A溶液，建立赭曲霉毒素A濃度與峰面積的標準曲線；
b、稱取20g經(jīng)過步驟三輻照后的待降解樣品，置于烘干裝置中，在溫度為70℃下，烘干1h，加入5g氯化鈉和75mL提取液，攪拌，過濾，得到第一濾液，量取10mL第一濾液，將量取的第一濾液用水稀釋至50mL，得到第二濾液，過濾第二濾液，直至其澄清，其中，提取液的制備為：將150g氯化鈉、20g碳酸氫鈉溶于950mL水中，加入水定容至1mL，即得到提取液；
c、將赭曲霉毒素A免疫親和柱與固相萃取裝置連接，向?qū)Ⅳ髑苟舅谹免疫親和柱中加入10mL第二濾液，將真空泵與固相萃取裝置連接，調(diào)節(jié)壓力，使赭曲霉毒素A免疫親和柱中液體流速為1滴/s，當空氣進入赭曲霉毒素A免疫親和柱時，依次用10mL真菌清洗緩沖液和10mL水淋洗，直至空氣再次進入赭曲霉毒素A免疫親和柱時，棄去全部由赭曲霉毒素A免疫親和柱中流出液體，抽干赭曲霉毒素A免疫親和柱中溶液，其中，真菌清洗緩沖液的制備為：將25g氯化鈉、5.0g碳酸氫鈉溶于200mL水中，搖勻，加入0.1g吐溫-20，加入水定容至1mL，即得到真菌清洗緩沖液；
d、向赭曲霉毒素A免疫親和柱中加入1mL洗脫液，流速為1滴/s，收集洗脫液，用甲醇溶液定容為1mL，采用高效液相色譜測定，根據(jù)a中建立的赭曲霉毒素A濃度與峰面積的標準曲線和高效液相色譜測出的待降解樣品中赭曲霉毒素A的峰面積，計算出經(jīng)步驟二處理后的待降解樣品中的赭曲霉毒素A的濃度；其中，洗脫液為甲醇溶液。
盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。