本發(fā)明涉及一種食品保鮮技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種超臨界流體處理脂肪酶的技術(shù)。

背景技術(shù)：

脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)，除此之外還表現(xiàn)出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應(yīng)體系的特點(diǎn)，如在油水界面促進(jìn)酯水解，而在有機(jī)相中可以酶促合成和酯交換。脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中。由于微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，具有比動(dòng)植物更廣的作用pH、作用溫度范圍以及底物專一性，且微生物來(lái)源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，主要的發(fā)酵微生物有根霉、曲霉和假絲酵母等等。作為一種生物催化劑，脂肪酶具有一般催化劑高效性、高選擇性、反應(yīng)條件溫和等共同優(yōu)點(diǎn)，是綠色環(huán)保的催化劑，越來(lái)越受到各個(gè)領(lǐng)域的關(guān)注。在食品工業(yè)方面，主要用于乳制品的增香、魚(yú)片脫脂和食用油加工；在紡織領(lǐng)域中主要用于羊毛防縮、絲綢除油去蠟以及改善滌綸親水性等方面；在化工工業(yè)中主要用于生產(chǎn)芥酸及其衍生物。同時(shí)，脂肪酶在洗滌添加劑、廢水處理添加劑、醫(yī)藥、造紙行業(yè)以及手性藥物的合成等方面也有相應(yīng)的應(yīng)用。

在乳制品生產(chǎn)和加工過(guò)程中,原料乳從收集到加工常常需要存放一段時(shí)間。為了防止乳酸菌或病原菌等微生物引起原料乳的腐敗,常用的方式是利用冷藏方法保存鮮乳。將擠出的乳迅速冷卻是保證鮮乳較長(zhǎng)時(shí)間保持新鮮狀態(tài)的必要條件，但一般的冷藏溫度對(duì)嗜冷菌(嗜冷菌被定義為在7℃或7℃以下能夠繁殖的一類細(xì)菌,是一類常見(jiàn)的能引起乳品腐敗的微生物)的抑制作用很小。一般地講，嗜冷菌的繁殖本身不會(huì)引起乳的嚴(yán)重腐敗，嗜冷菌能產(chǎn)生耐熱的脂肪酶，這些耐熱的脂肪酶在巴氏消毒過(guò)程中基本不受影響，即使經(jīng)過(guò)超高溫處理仍會(huì)有部分殘留，而殘留的脂肪酶則是使乳制品出現(xiàn)凝集、蛋白質(zhì)酸化以及出現(xiàn)腐敗變味的主要原因。因此，為了保證乳制品的質(zhì)量，降低脂肪酶的活性是十分必要的。

目前，工業(yè)中常采用的是巴氏滅菌和超高溫瞬時(shí)滅活的方法，雖能殺死大多數(shù)細(xì)菌，但對(duì)于其他一些細(xì)菌產(chǎn)生的脂肪酶的滅活效果不佳，成本較高，且達(dá)不到預(yù)期的效果。因此，開(kāi)發(fā)一種能有效降低脂肪酶活性的方法是解決上述問(wèn)題的關(guān)鍵之一。

由于超臨界流體技術(shù)具有無(wú)水、無(wú)毒、節(jié)能減排、生態(tài)環(huán)保等諸多優(yōu)勢(shì)，近年來(lái)受到了社會(huì)各界越來(lái)越多的關(guān)注。超臨界流體技術(shù)實(shí)現(xiàn)了污水的零排放，在源頭上解決了環(huán)境及處理產(chǎn)品自身被污染的問(wèn)題，大大減少了生產(chǎn)成本和能耗。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種超臨界流體降低脂肪酶活性的方法，該方法可有效降低脂肪酶的活性，可應(yīng)用于食品保鮮加工技術(shù)領(lǐng)域，以解決食品貯藏過(guò)程中微生物產(chǎn)生的脂肪酶破壞其品質(zhì)。

本發(fā)明的一種超臨界流體降低脂肪酶活性的方法，包括以下步驟：

(1)將脂肪酶直接散裝置于由纖維材料制成的處理容器中。

(2)將裝有脂肪酶的處理容器置于超臨界流體系統(tǒng)的處理釜中進(jìn)行超臨界流體處理。

(3)將上述處理后的脂肪酶進(jìn)行封裝，放入冰箱中進(jìn)行冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步的，步驟(1)中，所述脂肪酶來(lái)自豬胰腺的酶制劑。

進(jìn)一步的，步驟(1)中，所述脂肪酶為固體粉末。

進(jìn)一步的，所述處理容器通過(guò)網(wǎng)狀框架支撐在所述處理釜中，優(yōu)選金屬絲網(wǎng)狀框架。

進(jìn)一步的，所述處理容器罩設(shè)在所述框架外/設(shè)置在所述網(wǎng)狀框架內(nèi)。

進(jìn)一步的，步驟(2)中，處理溫度為30-90℃。

進(jìn)一步的，步驟(2)中，超臨界流體的壓強(qiáng)為8-23MPa。

進(jìn)一步的，步驟(2)中，處理時(shí)間為1-4h。

進(jìn)一步的，步驟(2)中，所述超臨界流體系統(tǒng)還設(shè)有超臨界流體循環(huán)裝置。

進(jìn)一步的，步驟(2)中，所述超臨界流體為超臨界二氧化碳流體、超臨界正己烷流體和超臨界丙烷流體中的一種或幾種，優(yōu)選超臨界二氧化碳流體。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明的超臨界流體降低脂肪酶活性的方法，將脂肪酶直接散裝于專用處理容器中并封裝固定于超臨界流體系統(tǒng)的處理釜中，通過(guò)改變不同的超臨界流體條件實(shí)現(xiàn)對(duì)脂肪酶的處理，從而降低脂肪酶的活性及穩(wěn)定性；

2、本發(fā)明的處理方法工藝簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，能夠有效地降低脂肪酶的活性，從而可應(yīng)用于改善乳制品貯藏過(guò)程中出現(xiàn)變質(zhì)的問(wèn)題，且不會(huì)破壞乳制品的風(fēng)味并節(jié)約成本；

3、避免了超高溫瞬時(shí)滅活的高能耗和產(chǎn)品品質(zhì)變化及其自身被污染等問(wèn)題；

4、金屬絲組成的網(wǎng)狀框架和纖維材料制成的封裝袋構(gòu)成處理容器，不但利于超臨界流體通過(guò)，使脂肪酶的處理效果更好，而且方便固定于處理釜中；

5、超臨界二氧化碳流體具有綠色環(huán)保、節(jié)能減排等優(yōu)點(diǎn)。

上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說(shuō)明書(shū)的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說(shuō)明如后。

附圖說(shuō)明

圖1圖示了本發(fā)明的實(shí)施例1、2、3中處理壓強(qiáng)對(duì)脂肪酶活性及活性降低率的影響；

圖2圖示了本發(fā)明的實(shí)施例4、5、6、7中處理溫度對(duì)脂肪酶活性及活性降低率的影響；

圖3圖示了本發(fā)明的實(shí)施例8、9、10中處理時(shí)間對(duì)脂肪酶活性及活性降低率的影響。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

下列實(shí)施例中所涉及的試劑如下：乙醇、磷酸二氫鉀、十二水磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、均為分析純，聚乙烯醇、橄欖油均為化學(xué)純，酚酞指示劑，鄰苯二甲酸氫鉀為工作基準(zhǔn)試劑，脂肪酶為生物純。

實(shí)施例1

一種超臨界流體降低脂肪酶活性的方法，包括以下步驟：

(1)稱取0.500g脂肪酶，散裝于專用處理容器中并封裝；

(2)將處理容器固定于超臨界二氧化碳流體系統(tǒng)的處理釜內(nèi)，將處理釜置于超臨界二氧化碳流體系統(tǒng)中，密閉系統(tǒng)后，在超臨界二氧化碳流體壓強(qiáng)為8MPa，溫度為40℃的條件下對(duì)脂肪酶進(jìn)行處理1.0h；將上述經(jīng)過(guò)處理后的脂肪酶放入冰箱中進(jìn)行冷藏保存?zhèn)溆?，并根?jù)脂肪酶的活性測(cè)試方法進(jìn)行活性測(cè)試。

處理后的脂肪酶的活性測(cè)試方法包括以下步驟：

(1)溶液配制：

底物溶液：稱取聚乙烯醇40.000g于燒杯中，緩慢加入900ml水，室溫下浸泡48h后，在沸水中不斷攪拌直至聚乙烯醇顆粒完全溶解，待溶液冷卻后定容至1000ml，用干凈紗布過(guò)濾后將濾液儲(chǔ)存?zhèn)溆?；量取上述濾液150ml于燒杯中，再加橄欖油50ml，用高速剪切乳化機(jī)處理10min(分兩次處理，間隔5min)，既得乳白色PVA乳化液，該溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(C＝0.05mol/L，按GB/T 601配制)：先稱取氫氧化鈉110.000g，溶于100ml水中，取27ml稀釋定容到1000ml；再準(zhǔn)確稱取烘至恒定重量的鄰苯二甲酸氫鉀(工作基準(zhǔn)試劑)3.600g，加入80ml水溶解，再滴入2滴酚酞溶液，用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定至粉紅色，并保持30s，記下此時(shí)消耗的氫氧化鈉的體積(V)，同時(shí)做空白試驗(yàn)，以此標(biāo)定氫氧化鈉的濃度；最后準(zhǔn)確量取上述氫氧化鈉溶液100ml，定容至1000ml，計(jì)算氫氧化鈉的實(shí)際濃度，計(jì)算稀釋后的氫氧化鈉實(shí)際濃度為0.051mol/L。

酚酞指示液(10g/L，按GB/T 603配制)：稱取酚酞1.000g，加乙醇完全溶解后定容至100ml。

磷酸緩沖液(pH＝7.5)：準(zhǔn)確稱取磷酸二氫鉀1.960g和十二水磷酸氫二鈉39.620g于燒杯中，加水溶解定容到500ml，并用pH計(jì)校準(zhǔn)。

脂肪酶溶液：準(zhǔn)確稱取脂肪酶0.077g，用磷酸緩沖液溶解并定容至25ml。

(2)脂肪酶活性測(cè)試

開(kāi)始前先用pH校正液校正pH計(jì)。取兩個(gè)100ml燒杯，向空白杯和樣品杯中各加入底物溶液4ml和緩沖液5ml，再向空白杯中加入15ml乙醇溶液。將空白被和樣品杯置于40℃水浴中預(yù)熱5min，然后向兩杯中各加待測(cè)酶液1ml，立即混勻計(jì)時(shí)。準(zhǔn)確反應(yīng)15min后，立即向樣品杯中加入15ml乙醇搖勻以終止反應(yīng)，取出燒杯后用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，以pH計(jì)顯示pH值為10.3作為滴定終點(diǎn)，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。

(3)脂肪酶活性計(jì)算

脂肪酶活性定義：1g固體脂肪酶在40℃和pH為7.5的條件下，1min水解底物產(chǎn)生1μmol的可滴定的脂肪酸為一個(gè)活力單位，單位Ug^-1?；钚杂?jì)算公式(Ⅰ)如下：

式中：X表示脂肪活性，單位：Ug^-1；

V₁：滴定樣品時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位：ml；

V₀：滴定空白時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，單位：ml；

C：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，單位：mol/L；

50：0.05mol/L氫氧化鈉溶液1.00ml相當(dāng)于脂肪酸50umol；

n：酶的稀釋倍數(shù)；

0.05：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算系數(shù)；

1/15：反應(yīng)時(shí)間15min，以1min計(jì)。

活性降低率R的計(jì)算公式(Ⅱ)如下：

式中：R表示脂肪酶的活性降低率；

X₁表示超臨界流體處理后脂肪酶的活性，單位為Ug^-1；

X₀表示超臨界流體處理前脂肪酶的活性，單位為Ug^-1。

根據(jù)上述方案中的方法和步驟測(cè)得超臨界流體處理前脂肪酶的活性為25807Ug^-1；根據(jù)上述方案中的方法和步驟測(cè)定本實(shí)施例處理后的脂肪酶的活性為18053Ug^-1，活性降低率為30.0％。由于脂肪酶的活性降低率表示的是脂肪酶處理前后脂肪酶的活性的損失率，亦即反映脂肪酶在處理前后活性的穩(wěn)定性，故經(jīng)過(guò)實(shí)施例1的工藝處理后，脂肪酶的活性大幅降低，其穩(wěn)定性也顯著降低，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例2

本實(shí)施例步驟與實(shí)施例1基本相同，其區(qū)別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理?xiàng)l件為：壓強(qiáng)為10MPa。

對(duì)本實(shí)施例處理后的脂肪酶進(jìn)行同實(shí)施例1方法和條件相同的活性測(cè)試，測(cè)得的脂肪酶活性為18164Ug^-1，活性降低率為29.6％，脂肪酶的活性及穩(wěn)定性均有明顯地降低，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例3

本實(shí)施例步驟與實(shí)施例1基本相同，其區(qū)別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理?xiàng)l件為：壓強(qiáng)為20MPa。

對(duì)本實(shí)施例處理后的脂肪酶進(jìn)行同實(shí)施例1方法和條件相同的活性測(cè)試，測(cè)得的脂肪酶活性為18940Ug^-1，活性降低率為26.6％，脂肪酶的活性及穩(wěn)定性均有所降低，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

實(shí)施例4

本實(shí)施例步驟與實(shí)施例1基本相同，其區(qū)別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理?xiàng)l件為：壓強(qiáng)為15MPa，溫度為60℃。

對(duì)本實(shí)施例處理后的脂肪酶進(jìn)行同實(shí)施例1方法和條件相同的活性測(cè)試，測(cè)得的脂肪酶活性為18829Ug^-1，活性降低率為27.0％，脂肪酶的活性及穩(wěn)定性均有所降低，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

實(shí)施例5

本實(shí)施例步驟與實(shí)施例4基本相同，其區(qū)別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理?xiàng)l件為：溫度為70℃。

對(duì)本實(shí)施例處理后的脂肪酶進(jìn)行同實(shí)施例1方法和條件相同的活性測(cè)試，測(cè)得的脂肪酶活性為17832Ug^-1，活性降低率為30.9％，脂肪酶的活性及穩(wěn)定性均有明顯降低，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

實(shí)施例6

本實(shí)施例步驟與實(shí)施例4基本相同，其區(qū)別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理?xiàng)l件為：溫度為80℃。

對(duì)本實(shí)施例處理后的脂肪酶進(jìn)行同實(shí)施例1方法和條件相同的活性測(cè)試，測(cè)得的脂肪酶活性為16060Ug^-1，活性降低率為37.8％，脂肪酶的活性及穩(wěn)定性均有所降低，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

實(shí)施例7

本實(shí)施例步驟與實(shí)施例4基本相同，其區(qū)別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理?xiàng)l件為：溫度為90℃。

對(duì)本實(shí)施例處理后的脂肪酶進(jìn)行同實(shí)施例1方法和條件相同的活性測(cè)試，測(cè)得的脂肪酶活性為13069Ug^-1，活性降低率為49.4％，脂肪酶的活性及穩(wěn)定性均有大幅的降低，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

實(shí)施例8

本實(shí)施例步驟與實(shí)施例1基本相同，其區(qū)別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理?xiàng)l件為：壓強(qiáng)為15MPa，溫度為50℃，處理時(shí)間為1.5h。

對(duì)本實(shí)施例處理后的脂肪酶進(jìn)行同實(shí)施例1方法和條件相同的活性測(cè)試，測(cè)得的脂肪酶活性為18607Ug-¹，活性降低率為27.9％，脂肪酶的活性及穩(wěn)定性均有所降低，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

實(shí)施例9

本實(shí)施例步驟與實(shí)施例8基本相同，其區(qū)別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理?xiàng)l件為：處理時(shí)間為2.0h。

對(duì)本實(shí)施例處理后的脂肪酶進(jìn)行同實(shí)施例1方法和條件相同的活性測(cè)試，測(cè)得的脂肪酶活性為18829Ug^-1，活性降低率為27.0％，脂肪酶的活性及穩(wěn)定性均有所降低，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

實(shí)施例10

本實(shí)施例步驟與實(shí)施例8基本相同，其區(qū)別在于：采用的超臨界二氧化碳流體的處理?xiàng)l件為：處理時(shí)間為2.5h。

對(duì)本實(shí)施例處理后的脂肪酶進(jìn)行同實(shí)施例1方法和條件相同的活性測(cè)試，測(cè)得其活性為19383Ug^-1，活性降低率為24.9％。脂肪酶的活性和穩(wěn)定性均有所降低，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。