本發(fā)明涉及食品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及一種營養(yǎng)強化型酸奶及其制備的技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

自從2000年全國范圍實施的“學(xué)生飲用奶計劃”，牛奶作為健康食品的代表，幾乎己經(jīng)滲透到了每一個家庭，極大的促進(jìn)了家長對于學(xué)生的營養(yǎng)保健意識。我國人民消費者購買的主要乳制品品種為：鮮奶(87.0％)、酸奶(66.8％)，而酸奶是一種含有較強乳酸菌的健康飲料，能增強消化功能，促進(jìn)食欲，增強腸的蠕動和機體的物質(zhì)代謝，經(jīng)常飲用有增進(jìn)人體健康的作用卿。酸奶由于乳酸菌的發(fā)酵作用，在營養(yǎng)成分得到改善的同時，也產(chǎn)生了一些生理活性物質(zhì)如有機酸、芳香物質(zhì)、抗生物質(zhì)、細(xì)胞壁外多糖、活性酶、乳酸菌增殖因子及乳酸菌等，對機體功能有顯著的調(diào)節(jié)作用，達(dá)到防病治病的功能之一。

目前市面上的酸奶飲品主要注重口感，例如草莓酸奶、藍(lán)莓酸奶巧克力酸奶等等；專利公開號為CN106135410A的中國專利，公開了一種蜂蜜酸奶及其制備方法，該專利在原料中添加了蜂蜜，提高了酸奶的價值，該飲品適合于女士及老年人，有助于人體吸收、延緩衰老；專利公開號為CN106212679A的中國專利，公開了一種莼菜酸奶，相比較常規(guī)酸奶，該酸奶含有大量的氨基酸及鋅鐵等元素，但是莼菜主要產(chǎn)于中國浙江、江蘇和湖北省，是一種季節(jié)性蔬菜，其他地區(qū)不易獲得?，F(xiàn)有技術(shù)中的酸奶普遍注重口感，無法滿足學(xué)生在生長發(fā)育階段的營養(yǎng)攝入量，因此需要針對學(xué)生這個群體，在酸奶制作過程中加入需適量的營養(yǎng)強化劑和尋求合適的發(fā)酵菌種，以為此達(dá)到學(xué)生膳食營養(yǎng)素推薦攝入量，克服現(xiàn)有的問題和不足。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對目前國內(nèi)外常規(guī)酸奶無法滿足兒童學(xué)生膳食營養(yǎng)素推薦攝入量的技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在于提供一種適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶及其制備方法，通過采用輻射滅菌、混合菌種發(fā)酵和添加營養(yǎng)強化劑以及篩選一種專用型發(fā)酵菌種等一系列獨特的制備工藝，建立一個穩(wěn)定的發(fā)酵的高鈣酸、高鐵酸和高鋅酸凝乳體系，提供了一種適于學(xué)生飲用的風(fēng)味發(fā)酵乳制品，對食品加工技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的實用性。

本發(fā)明首先提供一種適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶發(fā)酵的優(yōu)良菌種，選用的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1，根據(jù)新疆的地理環(huán)境的特殊性，通過從新疆瑪納斯縣及南北疆畜牧區(qū)采集的自制酸駝乳中取樣，篩選出一批生長良好的微生物菌株，經(jīng)培養(yǎng)、分離與篩選后，從中優(yōu)選出一株編號為WWMR-1的菌株，菌種經(jīng)培養(yǎng)后菌落呈邊緣整齊、表面光滑乳白色凸起的圓形，直徑0.5-3mm的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，染色鑒定結(jié)果為革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌；該細(xì)菌在過氧化氫酶試驗中呈陰性、接觸酶呈陰性，不能夠還原硝酸鹽、不液化明膠、不產(chǎn)生吲哚和H₂S、不運動，不能夠發(fā)酵阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、鼠李糖和木糖，能夠在15℃生長，具有接種后生長穩(wěn)定，延遲期短，適應(yīng)快，發(fā)酵初期產(chǎn)酸能力較強。經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。

本發(fā)明具體采用的一種適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶發(fā)酵的優(yōu)良菌種編號為WWMR-1的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，該細(xì)菌經(jīng)MRS培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，再經(jīng)改良MRS培養(yǎng)基中會產(chǎn)生溶鈣圈進(jìn)行初步篩選，將其初步界定乳酸菌菌株；該菌株在MRS培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)24h，能形成菌落邊緣整齊、表面光滑乳白色凸起的圓形，直徑0.5-3mm的菌落；進(jìn)行革蘭氏染色，染色鑒定結(jié)果為革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌；該菌株培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度37℃，最適培養(yǎng)溫度37℃；優(yōu)先生長于MRS培養(yǎng)基表面，MRS培養(yǎng)基組分牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，檸檬酸氫二胺2.0g/L，吐溫-801.0ml/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，七水硫酸鎂0.2g/L，七水硫酸錳0.05g/L，蒸餾水1.0L，固體培養(yǎng)基加瓊脂20.0g/L；菌株在固體培養(yǎng)基上菌落直徑大小為0.5-3mm，正面呈圓形，側(cè)面凸起；邊緣整齊、表面光滑；菌落不透明，呈乳白色；具有一定粘稠性；革蘭氏陽性菌。

結(jié)合上述編號為WWMR-1的該菌種菌落形態(tài)、生理生化特性，初步確定為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacterio-logy》)第九版和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》等對干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測定、生理生化檢測，結(jié)合該菌種的16S rDNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，確定菌種編號為WWMR-1菌株為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，該菌株已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101，保藏日期是2013年9月23日，保藏號是CGMCC No.8244。經(jīng)上述微生物學(xué)綜合鑒定歸屬為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC No.8244。

同時，本發(fā)明提供了菌株干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1制作適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶的發(fā)酵工藝：在無菌條件下，挑取該菌株，37℃，135r/min培養(yǎng)18-24h。

本發(fā)明為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，提供一種適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶的制備方法，具體步驟如下：

(1)原料預(yù)熱：選擇100000份的新鮮奶制品，采用輻射滅菌機滅菌1s-3s，滅菌后90℃恒溫水浴10min，水浴過程中不斷攪拌，水浴10min后迅速冷卻至40℃-45℃，加入2000份-6000份蔗糖、3份-4份鐵營養(yǎng)強化劑、2份-3份鋅營養(yǎng)強化劑，均勻攪拌。

(2)乳酸發(fā)酵：按重量百分比計，接種2％-6％的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244，添加1000份老酸奶醪液后加入鈣營養(yǎng)強化劑50份-70份、香蘭素4份-5份，于33℃-45℃在發(fā)酵罐中發(fā)酵4h-8h。

(3)后發(fā)酵：酸奶酸度達(dá)到80°T-90°T發(fā)酵完成，2℃-8℃條件下進(jìn)行后發(fā)酵15h-18h。

本發(fā)明中，原料采用新鮮的牛奶或羊奶。

本發(fā)明中，鐵營養(yǎng)強化劑選用檸檬酸鐵銨、乳酸亞鐵和硫酸亞鐵中的任意一種，優(yōu)先選擇硫酸亞鐵。

本發(fā)明中，鋅營養(yǎng)強化劑選用葡萄糖酸鋅、乳酸鋅或硫酸鋅中的任意一種，優(yōu)先選擇硫酸鋅。

本發(fā)明中，鈣營養(yǎng)強化劑選用碳酸鈣、葡萄糖酸鈣和乳酸鈣中的任意一種，優(yōu)先選擇添加碳酸鈣。

本發(fā)明中，老酸奶醪液類似發(fā)酵中的酵頭，第一次選用農(nóng)村土法自然自制的酸奶，優(yōu)先選用牧區(qū)牧民自然發(fā)酵自制的酸駱駝乳，生產(chǎn)中可選用每次上次制作好的酸奶即可。

本發(fā)明中，乳酸發(fā)酵溫度優(yōu)先選擇42℃。

本發(fā)明中，乳酸發(fā)酵時間優(yōu)先選擇5h。

本發(fā)明采用的鐵營養(yǎng)強化劑、鋅營養(yǎng)強化劑和鈣營養(yǎng)強化劑均為食品級，均可從市場購買獲得。本發(fā)明選用的老酸奶醪液初始發(fā)酵選用農(nóng)村土法自然發(fā)酵的酸奶，具有產(chǎn)酸能力高，發(fā)酵周期短的特點。

同時，本發(fā)明優(yōu)選進(jìn)一步提供適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶的制備方法，具體步驟如下：

(1)原料預(yù)熱：選擇100g的新鮮奶制品，采用輻射滅菌機滅菌3s，滅菌后90℃恒溫水浴10min，水浴過程中不斷攪拌，水浴10min后迅速冷卻至45℃，加入6g蔗糖、3.3mg硫酸亞鐵、2.3mg硫酸鋅，均勻攪拌。

(2)乳酸發(fā)酵：按重量百分比接種3％干酪乳桿菌，添加1g老酸奶醪液，然后加入碳酸鈣60mg、香蘭素5g，于42℃在發(fā)酵罐中發(fā)酵5.4h。

(3)后發(fā)酵：酸奶酸度達(dá)到90°T發(fā)酵完成，8℃條件下進(jìn)行后發(fā)酵18h。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供上述制備適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶在兒童或者學(xué)生膳食營養(yǎng)搭配中的應(yīng)用。

通過實施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達(dá)到以下效果:

(1)本發(fā)明提供發(fā)酵制備適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1，本菌株能在低pH值時活性較強，熱穩(wěn)定性好，在發(fā)酵過程中產(chǎn)生有機酸,主要是乳酸，使pH值降低來抑制一些腐敗菌和致病菌的生長，并改善食品的品質(zhì)和風(fēng)味。

(2)本發(fā)明最終選用的鈣鹽營養(yǎng)強化劑碳酸鈣，鐵鹽營養(yǎng)強化劑硫酸亞鐵，鋅鹽營養(yǎng)強化劑硫酸鋅，使得發(fā)酵完成后的酸奶持水性，酸度，黏度和感官質(zhì)量最好。

(3)本申請通過提供輻射滅菌、混合菌種發(fā)酵和添加營養(yǎng)強化劑等一系列獨特的制備工藝，建立一個穩(wěn)定的發(fā)酵的高鈣酸、高鐵酸和高鋅酸凝乳體系，提供了一種適于學(xué)生飲用的風(fēng)味發(fā)酵乳制品，制作的酸奶鈣元素含量最高可達(dá)1230.5ug/ml，鐵元素含量最高可達(dá)3.58ug/ml，鋅含量最高可達(dá)4.56ug/ml，動物實驗結(jié)果顯示，高劑量的鈣鐵鋅強化型酸奶能夠提高小鼠血液中的鈣鐵鋅含量，其中血鈣濃度升高70％、血鐵濃度升高165％，血鋅濃度升高199％，是一種適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶，獲得了良好的技術(shù)效果。

附圖說明

圖1顯示為不同接種量對制備適用學(xué)生飲用酸奶發(fā)酵的影響。

圖2顯示為不同發(fā)酵溫度對制備適用學(xué)生飲用酸奶發(fā)酵的影響。

圖3顯示為不同發(fā)酵時間對制備適用學(xué)生飲用酸奶發(fā)酵的影響。

圖4顯示為不同蔗糖添加量對制備適用學(xué)生飲用酸奶發(fā)酵的影響。

圖5顯示為發(fā)酵時間和接種量對制備適用學(xué)生飲用酸奶酸度影響的響應(yīng)面圖。

圖6顯示為發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對制備適用學(xué)生飲用酸奶酸度影響的響應(yīng)面圖。

圖7顯示為發(fā)酵溫度和接種量對制備適用學(xué)生飲用酸奶酸度影響的響應(yīng)面圖。

圖8顯示為接種量和發(fā)酵時間對制備適用學(xué)生飲用酸奶粘度影響的響應(yīng)面圖。

圖9顯示為發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對制備適用學(xué)生飲用酸奶粘度影響的響應(yīng)面圖。

圖10顯示為發(fā)酵溫度和接種量對制備適用學(xué)生飲用酸奶粘度影響的響應(yīng)面圖。

圖11顯示為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC No.8244的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

具體實施方式

下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。

本發(fā)明中選用的試劑與培養(yǎng)基如下：

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸二胺2g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，吐溫-801mL，蒸餾水1000mL。

采用的主要的儀器設(shè)備：

LD2X-50KB立式電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器廠)；HR40-ⅡA2生物安全柜(青島海爾特種電器有限公司)；DHP-781電熱恒溫培養(yǎng)箱(河北省黃石市醫(yī)療器械廠)；DZKW-172電熱恒溫水浴鍋(北京市光明醫(yī)療儀器廠)，輻射滅菌機(上海輻新輻照技術(shù)有限公司)。

采用新鮮牛奶由新疆烏魯木齊南山地區(qū)提供；選用的老酸奶醪液，老酸奶醪液類似發(fā)酵中的酵頭，第一次選用農(nóng)村土法自然自制的酸奶，優(yōu)先選用牧區(qū)牧民自然發(fā)酵自制的酸駱駝乳，生產(chǎn)中可選用每次上次制作好的酸奶即可；干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1自篩鑒定為典型的新種菌種。

另外，在下述的說明中，如無特別說明，％皆指m/m質(zhì)量百分比，本發(fā)明中選用的所有試劑、原料和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本發(fā)明的實施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本發(fā)明以下實施方式的實施。

實施例一：干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC No.8244的分離與純化

初篩:通過從新疆瑪納斯縣及南北疆畜牧區(qū)采集的自制酸駝乳中取樣，取農(nóng)牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸駝乳1mL放入裝有9mL無菌生理鹽水的試管中，在旋渦混合器上充分混合均勻。將發(fā)酵酸駝乳以10倍級進(jìn)行稀釋，稀釋度為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。用移液器吸取上述稀釋度樣液各1mL，采用傾注法倒入改良MRS培養(yǎng)基，平板置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。觀察并記錄菌落特征并挑取有透明圈的不同形態(tài)單個菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，挑取革蘭氏染色陽性菌落，在顯微鏡油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并對疑似的菌種進(jìn)行編號。

菌種的純化:將疑似產(chǎn)透明圈的菌株再接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24h，重復(fù)3～4次純化乳酸菌。純化后的乳酸菌菌株接種于改良MRS斜面，37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24h后，4℃保存?zhèn)溆?。從酸駝乳中進(jìn)行微生物菌種的培養(yǎng)、分離與篩選，獲得一批細(xì)菌，并從中分離篩選出干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，編號為WWMR-1，經(jīng)微生物學(xué)分類與鑒定，屬于干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。

本發(fā)明具體采用的一種適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶發(fā)酵的優(yōu)良干酪乳桿菌的編號為WWMR-1，其能夠產(chǎn)乳酸。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊》(《Bergey，s Manual of Systematic Bacterio-logy》)第九版和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》等對干酪乳桿菌WWMR-1菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測定，生理生化檢測，確定干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)中的成員。該菌株已于申請日前保藏于布達(dá)佩斯條約微生物國際保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101，保藏日期是2013年9月23日，保藏號是CGMCC No.8244。16SrRNA同源分析、系統(tǒng)發(fā)育分析和細(xì)胞脂肪酸組分分析結(jié)果都表明WWMR-1菌株為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。該菌株培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度37℃，最適培養(yǎng)溫度37℃；優(yōu)先生長于MRS培養(yǎng)基表面，MRS培養(yǎng)基組分牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，葡萄糖20.0g/L，乙酸鈉5.0g/L，檸檬酸氫二胺2.0g/L，吐溫-801.0ml/L，磷酸氫二鉀2.0g/L，七水硫酸鎂0.2g/L，七水硫酸錳0.05g/L，蒸餾水1L，固體培養(yǎng)基加瓊脂20.0g/L。菌株在固體培養(yǎng)基上菌落直徑大小為0.5-3mm，正面呈圓形，側(cè)面凸起；邊緣整齊、表面光滑；菌落不透明，呈乳白色；具有一定粘稠性；革蘭氏陽性菌，與同類常見的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)具有明顯的區(qū)分，具有新菌種的特點。

生理生化鑒定：該細(xì)菌在過氧化氫酶試驗中呈陰性、接觸酶呈陰性，不能夠還原硝酸鹽、不液化明膠、不產(chǎn)生吲哚和H₂S、不運動，不能夠發(fā)酵阿拉伯糖、蜜二糖、棉籽糖、鼠李糖和木糖，能夠在15℃生長，具有接種后生長穩(wěn)定，延遲期短，適應(yīng)快，發(fā)酵初期產(chǎn)酸能力較強，與同類常見的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)具有顯著的區(qū)分，具有新菌種的明顯特點。

分子生物學(xué)鑒定：基于16S rDNA序列擴增和PCR產(chǎn)物測序，獲得rDNA序列經(jīng)GenBank\Blast同源序列比對分析，其與現(xiàn)有技術(shù)所報道的已知干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)同源性較高，相似度：99％；從GenBank中獲取干酪乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rRNA基因序列，進(jìn)行同源進(jìn)化分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果參見附圖11；結(jié)果顯示，菌種編號為WWMR-1的菌株隸屬于干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)，與Lactobacillus casei親源關(guān)系最近，同源相似性為99％，確定菌株WWMR-1為干酪乳桿菌，結(jié)合上述提供的菌種編號為WWMR-1 CGMCC No.8244的菌落形態(tài)、生理生化特性，生物學(xué)分類名稱為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)為典型的新菌種，與同類常見的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)具有明顯的區(qū)分，具有新菌種最鮮明的特點。

實施例二：利用干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC No.8244制備適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶

本發(fā)明采用的適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶的制備方法具體步驟如下：

(1)原料預(yù)熱：選擇100000份的新鮮奶制品，采用輻射滅菌機滅菌1s-3s，滅菌后90℃恒溫水浴10min，水浴過程中不斷攪拌，水浴10min后迅速冷卻至40-45℃，加入2000份-6000份蔗糖、3份-4份鐵營養(yǎng)強化劑、2份-3份鋅營養(yǎng)強化劑，均勻攪拌。

(2)乳酸發(fā)酵：按重量百分比計，接種2％-6％干酪乳桿菌，添加1000份老酸奶醪液后加入鈣營養(yǎng)強化劑50份-70份、香蘭素4份-5份，于33℃-45℃在發(fā)酵罐中發(fā)酵4h-8h。

(3)后發(fā)酵：酸奶酸度達(dá)到80°T-90°T發(fā)酵完成，2℃-8℃條件下進(jìn)行后發(fā)酵15h-18h。

本發(fā)明中，原料采用新鮮的牛奶或羊奶。

本發(fā)明中，鐵營養(yǎng)強化劑選用檸檬酸鐵銨、乳酸亞鐵和硫酸亞鐵中的任意一種，優(yōu)先選擇硫酸亞鐵。

本發(fā)明中，鋅營養(yǎng)強化劑選用葡萄糖酸鋅、乳酸鋅或硫酸鋅中的任意一種，優(yōu)先選擇硫酸鋅。

本發(fā)明中，鈣營養(yǎng)強化劑選用碳酸鈣、葡萄糖酸鈣和乳酸鈣中的任意一種，優(yōu)先選擇添加碳酸鈣。

本發(fā)明中，老酸奶醪液類似發(fā)酵中的酵頭，第一次選用農(nóng)村土法自然自制的酸奶，優(yōu)先選用牧區(qū)牧民自然發(fā)酵自制的酸駱駝乳，老酸奶醪液初始發(fā)酵選用農(nóng)村土法自然發(fā)酵的酸奶，具有產(chǎn)酸能力高，發(fā)酵周期短的特點，生產(chǎn)中可選用每次上次制作好的酸奶即可。

本發(fā)明中，乳酸發(fā)酵溫度優(yōu)先選擇42℃。

本發(fā)明中，乳酸發(fā)酵時間優(yōu)先選擇5h。

實施例三：營養(yǎng)強化劑的選擇與強化量的確定

本發(fā)明中選取具有較高性價比的鈣源進(jìn)行對比分析和篩選，為鈣鐵鋅強化酸奶的研究提供基本依據(jù)。選用碳酸鈣，葡萄糖酸鈣和乳酸鈣，作為鈣鹽營養(yǎng)強化劑，在加熱后的100g牛奶中加入相同的劑量60mg，發(fā)酵完成后的酸奶酸度和粘度均較好，但持水性和感官質(zhì)量較碳酸鈣最好。確定碳酸鈣為鈣營養(yǎng)強化劑，在向加熱后的100g牛奶中加入碳酸鈣50mg，60mg和70mg，發(fā)酵完成后的加入60mg碳酸鈣的酸奶，乳清析出最少。確定碳酸鈣的添加量為60mg。

本發(fā)明中選取具有較高性價比的鐵源進(jìn)行對比分析和篩選，為鈣鐵鋅強化酸奶的研究提供基本依據(jù)。選用檸檬酸鐵銨，乳酸亞鐵和硫酸亞鐵作為鐵鹽營養(yǎng)強化劑，在加熱前的100g牛奶中加入相同的劑量3.3mg，發(fā)酵完成后的酸奶酸度和粘度較乳酸亞鐵和硫酸亞鐵最好。硫酸亞鐵的經(jīng)濟成本比乳酸亞鐵低，確定硫酸亞鐵為鐵營養(yǎng)強化劑，在向加熱前的100g牛奶中加入碳酸鈣2.3mg，3.3mg和4.3mg，發(fā)酵完成后的加入3.3mg硫酸亞鐵的酸奶，酸度和感官質(zhì)量最好。確定硫酸亞鐵的添加量為3.3mg。

本發(fā)明中選取具有較高性價比的鋅源進(jìn)行對比分析和篩選，為鈣鐵鋅強化酸奶的研究提供基本依據(jù)。選用葡萄糖酸鋅，乳酸鋅和硫酸鋅作為鐵鹽營養(yǎng)強化劑，在加熱前的100g牛奶中加入相同的劑量2.3mg，發(fā)酵完成后的酸奶酸度，粘度和持水性較乳酸鋅和硫酸鋅最好。硫酸鋅的經(jīng)濟成本比乳酸鋅低，確定硫酸鋅為鋅營養(yǎng)強化劑，在向加熱前的100g牛奶中加入硫酸鋅2.0mg，2.3mg和2.6mg，發(fā)酵完成后的加入2.3mg硫酸鋅的酸奶，酸度和感官質(zhì)量最好。確定硫酸鋅的添加量為2.3mg。

實施例四：

選擇100g的新鮮奶制品，采用輻射滅菌機滅菌1s，滅菌后90℃恒溫水浴10min，水浴過程中不斷攪拌，水浴10min后迅速冷卻至40℃，加入2g蔗糖、3mg硫酸亞鐵、2mg硫酸鋅，均勻攪拌。接種2％干酪乳桿菌，添加1g老酸奶醪液，然后加入碳酸鈣50mg、香蘭素4g，于33℃在發(fā)酵罐中發(fā)酵4h。酸奶酸度達(dá)到80°T發(fā)酵完成，2℃條件下進(jìn)行后發(fā)酵15h。

實施例五：

選擇100g的新鮮奶制品，采用輻射滅菌機滅菌2s，滅菌后90℃恒溫水浴10min，水浴過程中不斷攪拌，水浴10min后迅速冷卻至42℃，加入5g蔗糖、3mg硫酸亞鐵、3mg硫酸鋅，均勻攪拌。接種4％干酪乳桿菌，添加1g老酸奶醪液，然后加入碳酸鈣60mg、香蘭素5g，于42℃在發(fā)酵罐中發(fā)酵5h。酸奶酸度達(dá)到80°T發(fā)酵完成，6℃條件下進(jìn)行后發(fā)酵16h。

實施例六：選擇100g的新鮮奶制品，采用輻射滅菌機滅菌3s，滅菌后90℃恒溫水浴10min，水浴過程中不斷攪拌，水浴10min后迅速冷卻至43℃，加入4g蔗糖、4mg硫酸亞鐵、2mg硫酸鋅，均勻攪拌。接種5％干酪乳桿菌，添加1g老酸奶醪液，然后加入碳酸鈣50mg、香蘭素5g，于40℃在發(fā)酵罐中發(fā)酵4h。酸奶酸度達(dá)到90°T發(fā)酵完成，2℃條件下進(jìn)行后發(fā)酵15h-18h。

實施例七：

選擇100g的新鮮奶制品，采用輻射滅菌機滅菌3s，滅菌后90℃恒溫水浴10min，水浴過程中不斷攪拌，水浴10min后迅速冷卻至45℃，加入6g蔗糖、4mg硫酸亞鐵、3mg硫酸鋅，均勻攪拌。接種6％干酪乳桿菌，添加1g老酸奶醪液，然后加入碳酸鈣70mg、香蘭素5g，于45℃在發(fā)酵罐中發(fā)酵8h。酸奶酸度達(dá)到90°T發(fā)酵完成，8℃條件下進(jìn)行后發(fā)酵18h。

實施例八：

選擇100g的新鮮奶制品，采用輻射滅菌機滅菌3s，滅菌后90℃恒溫水浴10min，水浴過程中不斷攪拌，水浴10min后迅速冷卻至45℃，加入6g蔗糖、3.3mg硫酸亞鐵、2.3mg硫酸鋅，均勻攪拌。接種3％干酪乳桿菌，添加1g老酸奶醪液，然后加入碳酸鈣60mg、香蘭素5g，于44℃在發(fā)酵罐中發(fā)酵5.4h。酸奶酸度達(dá)到90°T發(fā)酵完成，8℃條件下進(jìn)行后發(fā)酵18h。

實施例九：鈣鐵鋅強化型酸奶發(fā)酵工藝的優(yōu)化

在上述實施例一提供的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244基礎(chǔ)上，按照實施例二至實施例八提供的利用干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244制備適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步確定優(yōu)化的鈣鐵鋅強化型酸奶發(fā)酵工藝。

1、單因素試驗設(shè)計及結(jié)果分析

分別選取干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244的發(fā)酵接種量為2％、3％、4％、5％、6％；培養(yǎng)溫度為33℃、36℃、39℃、42℃、45℃；發(fā)酵時間為4h、5h、6h、7h、8h；蔗糖添加量為2％、4％、6％、8％、10％；進(jìn)行單因素發(fā)酵試驗，通過測定酸度、糖度、粘度、持水力，進(jìn)行單因素考察。

(1)不同接種量對發(fā)酵的影響

由附圖1可知，42℃發(fā)酵5h后，酸乳發(fā)酵劑干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244的發(fā)酵接種量為3％、4％和5％的酸乳的滴定酸度高于接種量為2％和6％的酸乳；對粘度的測定發(fā)現(xiàn)，隨著接種量的增加，酸乳的粘度也隨之增高，可見提高酸乳的接種量，可以提高酸乳的粘度；對持水力的測定結(jié)果來看，酸乳的持水力隨著酸乳發(fā)酵劑接種量的增加先增大后降低，接種量為5％時，酸乳的持水力達(dá)到最大值，為90％，與接種量為3％時酸乳的持水力差異并不大；通過對不同接種量酸乳的感官分析發(fā)現(xiàn)，酸乳的品質(zhì)隨著接種量的增加而變好，在接種量為3％時酸乳的感官評分最高，酸甜爽口，而在接種量為5％、6％時，有乳清析出，在接種量為6％時有大量乳清析出且過稠。從以上的分析結(jié)果可以看出，接種量為3％的酸乳42℃發(fā)酵5h后，酸乳的酸度、糖度適中，粘度和持水力以及感官評分均要高于其他發(fā)酵組酸乳，故3％為最佳的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244的發(fā)酵接種量。

(2)不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響

由附圖2可知，酸乳在33℃、36℃發(fā)酵5h的條件下，酸乳的滴定酸度明顯低于在42℃的發(fā)酵條件下酸乳的滴定酸度；對載度的測定發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵溫度的增加，酸乳的粘度先增高后下降，發(fā)酵溫度為42℃時達(dá)到最高，為645m Pa·s，明顯高于33℃、36℃、39℃、45℃下發(fā)酵的酸乳；對持水力的測定結(jié)果來看，在33℃、36℃下發(fā)酵的酸乳的持水力趨近于1，但在39℃、42℃、45℃下發(fā)酵的酸乳持水力差值不大；通過對不同發(fā)酵溫度酸乳的感官分析發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵溫度為33℃、36℃時，酸乳過稀，而發(fā)酵溫度為45℃時則有大量乳清析出。從以上的分析結(jié)果可以看出，發(fā)酵溫度為42℃接種量2％的酸乳發(fā)酵5h后，酸乳的酸度、糖度適中，粘度和持水力以及感官評分均要高于其他發(fā)酵組酸乳，故42℃為最佳的酸乳發(fā)酵溫度。

(3)不同發(fā)酵時間對發(fā)酵的影響

由附圖3可知，發(fā)酵5h、6h、7h的酸乳的滴定酸度高于4h發(fā)酵酸乳的滴定酸度；不同發(fā)酵時間酸乳的粘度測定發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵5h時粘度達(dá)到最高，為672m Pa·s，隨著發(fā)酵時間增長，粘度逐步降低，發(fā)酵8h時明顯低于發(fā)酵5h酸乳的粘度；對持水力的測定結(jié)果看出，發(fā)酵時間為4h、5h酸乳的持水力低于發(fā)酵6h以上的酸乳的持水力。通過對不同發(fā)酵時間酸乳的感官分析發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵時間的延長，酸乳的乳清析出量有所增加，但在發(fā)酵5h時酸乳的酸度適中，粘度和持水力以及感官評分均要高于其他發(fā)酵組酸乳。

(4)不同糖添加量對發(fā)酵的影響

如附圖4可知，隨著蔗糖添加量的增大，酸乳的滴定酸度變化不明顯:對粘度的測定發(fā)現(xiàn)，酸乳的粘度也隨著蔗糖添加量的增加而增大；對持水力的測定結(jié)果來看，蔗糖添加量對酸乳的持水力影響不明顯；通過對不同蔗糖添加量酸乳的感官分析發(fā)現(xiàn)，隨著蔗糖添加量的增大，酸乳的品質(zhì)越來越好，在蔗糖添加量為6％時酸乳的感官評分最高，在蔗糖添加量大于8％時，由于此時酸乳的甜度過高，影響酸乳口感。從以上的分析結(jié)果可以看出，蔗糖添加量為6％時，酸乳的酸度和甜均適中，粘度和持水力以及感官評分均要高于其他發(fā)酵組酸乳，故6％為最佳的蔗糖添加量。

2、響應(yīng)面優(yōu)化試驗及結(jié)果分析

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理分別對影響發(fā)酵的酸度含量(Z)和粘度(Y)的三個因素：發(fā)酵時間(A)、發(fā)酵溫度(B)、接種量(C)，利用響應(yīng)面軟件Design-Expert8.05軟件，根據(jù)Box-Behnken實驗組合設(shè)計進(jìn)行三因素三水平實驗。響應(yīng)面試驗的因素和水平編碼值如表1。

表1：響應(yīng)面試驗的因素和水平編碼值

發(fā)酵響應(yīng)面優(yōu)化分析：綜合單因素試驗結(jié)果，采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法對其進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗設(shè)計及響應(yīng)值結(jié)果見表2。

表2：響應(yīng)面試驗及響應(yīng)值

按照表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸方程擬合，得到發(fā)酵乳酸度(Y)及粘度(Z)分別對發(fā)酵時間(A)、發(fā)酵溫度(B)、接種量(C)的擬合方程為：

酸度＝77.00+6.13A+4.13B+4.00C-0.50AB-4.75AC-3.75BC-3.50A²-6.50B²-8.75C²粘度＝668.00+168.88A+114.25B+55.13C+25.00AB+60.25AC+54.50BC-158.13A²-187.88B²-165.13C²

表3：酸度響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析

注：表3及表4中，“*”表示顯著(0.01<p<0.05)；“**”表示極顯著(p<0.01)

表4：粘度響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析

回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性，由F檢驗來判定，概率P的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由表3、表4可知，當(dāng)模型F值分別為F＝18.40，P＝0.0004<0.01，F(xiàn)＝43.29，P<0.0001，說明模型是極顯著的。酸度與粘度的失擬項分別為F＝1.14時，P＝0.4327>0.05，F(xiàn)＝1.69，P＝0.3052>0.05說明模型失擬項不顯著。決定系數(shù)分別為R²＝0.9594，R²＝0.9824校正系數(shù)分別為R²_Adj＝0.9073，R²_Adj＝0.9597表明實測值與預(yù)測值之間具有很好的擬合度。由此可以說明模型的建立呈顯著性，說明此模型的擬合程度較好，試驗操作準(zhǔn)確可信，因此可以利用此模型對酸奶發(fā)酵過程進(jìn)行分析和預(yù)測。

從表3中可以看出，一次項A、B、C與二次項B²、C²均對鈣鐵鋅強化型酸奶發(fā)酵的Y值影響表現(xiàn)出極顯著水平，交互項AC、BC與A²對鈣鐵鋅強化型酸奶發(fā)酵Y值的影響表現(xiàn)為顯著水平，交互項AB對鈣鐵鋅強化型酸奶Y值的影響不具有顯著水平的影響。從表4中可以看出一次項A、B與二次項A²、B²、C²對鈣鐵鋅強化型酸奶發(fā)酵液的Z值影響表現(xiàn)出極顯著水平，交互相AB、AC、BC與一次項C對鈣鐵鋅強化型酸奶發(fā)酵液Z值的影響呈現(xiàn)顯著水平。

響應(yīng)面圖分析：為了考察各個交互項對發(fā)酵液酸度和粘度的影響，在其他因素固定不變的情況下，利用Design-Expert 8.05軟件對回歸方程進(jìn)行運算，作出交互項的響應(yīng)面圖，結(jié)果參見附圖5至附圖10。

由附圖5可知，隨著接種量的增大，酸度和粘度呈先上升后下降的趨勢，發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度之間的交互作用對酸度影響不顯著但對粘度影響顯著；發(fā)酵溫度及接種量的交互作用顯著。

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面軟件分析，得出鈣鐵鋅強化型酸奶最佳發(fā)酵條件為：接種量3.52％，發(fā)酵溫度為44℃，發(fā)酵時間5.4h。在此條件下酸度平均為76.9999°T，粘度為735.736mPa.s。經(jīng)驗證試驗所測得的實際酸度、粘度與理論值差異較小，證明兩個數(shù)學(xué)模型對優(yōu)化鈣鐵鋅強化型酸奶發(fā)酵工藝條件可行。

在上述條件下得到的適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶產(chǎn)品的典型性如下：

(1)感官指標(biāo)：色澤：乳白色；香氣：乳香味濃郁，滋味：酸甜爽口、無異味。

(2)理化指標(biāo)：總酸：74.67°T，粘度718.13mPa.s。

(3)微生物指標(biāo)：菌落總數(shù)(cfu/mL)≤100；大腸菌群(MPN/100mL)≤3；致病菌：未檢出。

實施例十：制備的奶制品中鈣鐵鋅含量的測定

測定方法：

將上述實施例一提供的干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244基礎(chǔ)上，按照實施例二至實施例八提供的利用干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1 CGMCC No.8244制備酸奶的基礎(chǔ)上，進(jìn)行鈣鐵鋅進(jìn)行測定，取新鮮牛奶、常規(guī)酸奶、鈣鐵鋅強化型酸奶、雙氧水、濃硫酸、硝酸、超純水、鈣鐵鋅元素的標(biāo)準(zhǔn)工作液(1000ug/ml，國家鋼鐵材料測試中心-鋼鐵研究總院)等材料儀器備用。

常規(guī)酸奶、鈣鐵鋅強化型酸奶下述同樣采用同樣方法，用移液管移取4ml新鮮牛奶于坩堝中，加入4ml濃硫酸，2ml雙氧水，靜置約10min，然后將坩堝放在電爐上加熱至冒出白煙。待其冷卻至50℃-60℃，在向坩堝中加入2ml濃硫酸，蓋上坩堝蓋。將裝有預(yù)處理樣品的坩堝依次放入馬弗爐中，讓其灰化完全。溫度調(diào)至650℃，時間為2h。取出坩堝，觀察坩堝中的樣品是否已成純白色的灰分，如是則灰化已經(jīng)完全。冷卻后，用稀硝酸充分溶解灰分，并移入100ml容量瓶中。最后用超純水定容，并搖勻備用。每個樣品分別取3次樣品，每個樣品處理后分別上樣測定3次，取其平均值。然后配置三元素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線參見表5。

表5：標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置

測定結(jié)果：根據(jù)儀器測定元素的線性范圍，適當(dāng)稀釋或濃縮樣品溶液，測定其吸光度值。經(jīng)計算器回歸分析，得出回歸方程，將樣品測定的吸光度值代入回歸方程，計算出樣品中各元素的含量。

表6：鈣元素測定結(jié)果表(μg/ml)

由表6可知，常規(guī)酸奶和鈣鐵鋅強化型酸奶的鈣元素含量均大于新鮮牛奶的鈣元素含量。經(jīng)過換算，得出鈣鐵鋅強化型酸奶的鈣元素含量最高，到達(dá)了1230.5ug/ml，常規(guī)酸奶的鈣元素含量最低，其含量為765.0ug/ml。

表7：鐵元素測定結(jié)果表(μg/ml)

由表7可知，常規(guī)酸奶和鈣鐵鋅強化型酸奶的鐵含量大于新鮮牛奶的鐵元素含量。經(jīng)過換算可得，鈣鐵鋅強化型酸奶的鐵元素含量高到3.58ug/ml，其余樣品鐵含量相當(dāng)。

表8：鋅元素測定結(jié)果表(μg/ml)

根據(jù)表8得出，鈣鐵鋅強化型酸奶的鋅含量最高，經(jīng)過換算，達(dá)到4.56ug/ml。其余樣品的鋅含量相當(dāng)，其中新鮮牛奶的鋅含量最低。

根據(jù)以上3種元素含量的檢測可知，三種乳制品中的3種無機營養(yǎng)元的含量都稍有差異。未經(jīng)過加工處理的新鮮牛奶中的各元素含量較其他經(jīng)過加工處理過的乳制品偏低。本申請通過對鈣鐵鋅三種營養(yǎng)元素的強化，增加了乳制品的營養(yǎng)價值，彌補了天然牛奶存在的缺陷和不足，同時也滿足國家規(guī)定的每日兒童膳食營養(yǎng)素推薦攝入量。

實施例十一：鈣鐵鋅強化型酸奶對大鼠鈣鐵鋅吸收的影響

(1)實驗動物：健康成年SD大鼠，清潔級，64只，雌雄各半，體重200-220g，購自新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。隨機分為對照組、鈣鐵鋅強化型酸奶低劑量組、中劑量和高劑量組，每組16只，飼養(yǎng)周期為14天，采用常規(guī)飼養(yǎng)模式飼養(yǎng)。

(2)各組每日添加計量的確定:對照組在日常飼料中添加常規(guī)酸奶，自由進(jìn)食，低劑量組、中劑量和高劑量組分別添加本申請實施例制備的鈣鐵鋅強化型酸奶，低劑量組強飼2g飼料和5g鈣鐵鋅強化型酸奶，中劑量強飼2g飼料和10g鈣鐵鋅強化型酸奶，高劑量強飼2g飼料和15g鈣鐵鋅強化型酸奶；鈣鐵鋅強化型酸奶為按照實施例二至實施例八提供的利用干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC No.8244制備。

(3)測定方法：

采用摘除眼球取血方法，收集血樣，制備成血漿，采用BC-3000型血液自動分析儀測定血漿中鈣、鐵、鋅的含量，分析所用試劑盒購自于長春匯力生物科技有限公司，7天飼喂后測定不同劑量組的大鼠糞便中鈣、鐵、鋅含量，結(jié)果參見表9。

(4)測定結(jié)果：

表9：各組大鼠不同時間段內(nèi)血漿中鈣、鐵、鋅含量

由表9可知，14天飼喂后，對照組相和低劑量組第14d血漿中各元素含量均發(fā)生降低的情況，中劑量組有細(xì)微的升高，而高劑量組血漿中血鈣濃度升高70％、血鐵濃度升高165％，血鋅濃度升高199％，具有明顯的增幅。

綜上所述，本發(fā)明利用干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)WWMR-1CGMCC No.8244制備鈣鐵鋅強化型酸奶，通過提供輻射滅菌、混合菌種發(fā)酵和添加營養(yǎng)強化劑等一系列獨特的制備工藝，建立一個穩(wěn)定的發(fā)酵的高鈣酸、高鐵酸和高鋅酸凝乳體系，提供了一種適于學(xué)生飲用的風(fēng)味發(fā)酵乳制品，制作的酸奶鈣元素含量最高可達(dá)1230.5ug/ml，鐵元素含量最高可達(dá)3.58ug/ml，鋅含量最高可達(dá)4.56ug/ml，動物實驗結(jié)果顯示，高劑量的鈣鐵鋅強化型酸奶能夠提高小鼠血液中的鈣鐵鋅含量，其中血鈣濃度升高70％、血鐵濃度升高165％，血鋅濃度升高199％，獲得了良好的技術(shù)效果。

如上所述，即可較好地實現(xiàn)本發(fā)明，上述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種改變和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明確定的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)；武運

<120> 一種適用學(xué)生飲用的鈣鐵鋅強化型酸奶及其制備方法

<130> WWMR-1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1064

<212> DNA

<213> WWMR-1

<220>

<221> WWMR-1

<222> (1)..(1064)

<400> 1

accacttttt ttcacttaga cggctcgctc cctaaagggt tacgccaccg gcttcgggtg 60

ttacaaactc tcatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg 120

gcgtgctgat ccgcgattac tagcgattcc gacttcgtgt aggcgagttg cagcctacag 180

tccgaactga gaatggcttt aagagattag cttgacctcg cggtctcgca actcgttgta 240

ccatccattg tagcacgtgt gtagcccagg tcataagggg catgatgatt tgacgtcatc 300

cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt cttactagag tgcccaacta aatgctggca 360

actagtcata agggttgcgc tcgttgcggg acttaaccca acatctcacg acacgagctg 420

acgacaacca tgcaccacct gtcattttgc ccccgaaggg gaaacctgat ctctcaggtg 480

atcaaaagat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa accacatgct 540

ccaccgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg tcgtactccc 600

caggcggaat gcttaatgcg ttagctgcgg cactgaaggg cggaaaccct ccaacaccta 660

gcattcatcg tttacggcat ggactaccag ggtatctaat cctgttcgct acccatgctt 720

tcgagcctca gcgtcagtta cagaccagac agccgccttc gccactggtg ttcttccata 780

tatctacgca tttcaccgct acacatggag ttccactgtc ctcttctgca ctcaagtttc 840

ccagtttccg atgcgcttcc tcggttaagc cgagggcttt cacatcagac ttaaaaaacc 900

gcctgcgctc gctttacgcc caataaatcc ggataacgct tgccacctac gtattaccgc 960

ggctgctggc acgtagttag ccgtgctttc tggttggata ccgtccacgc cgacaacagt 1020

tactctgccg accattcttc ttccacaaca gagtttttac gacc 1064