本發(fā)明涉及一種滇橄欖多酚的富集純化方法，屬于天然活性成分純化分離技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

滇橄欖（Fructusphyllanthi），又名余甘子，為大戟科葉下珠屬植物滇橄欖（Phyllanthusemblica L）的果實(shí)，其果鮮食酸甜酥脆而微澀，回味甘甜；我國野生滇橄欖分布在云南、廣西、福建、海南等地；作為一種常用藏藥，與訶子，毛訶子三者在藏藥中常被稱為“三大果”使用頻率很高，在《藏藥標(biāo)準(zhǔn)》所載的 290 種藏藥成藥中，含滇橄欖的有72種，占總數(shù)的25%，衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)1995年版藏藥標(biāo)準(zhǔn)所載200種成藥中，有59種含滇橄欖，占29%，滇橄欖被載入《中國藥典》1977年版一部；大量的研究證實(shí)，滇橄欖具有清咽潤喉、開胃消食、解酒、調(diào)節(jié)血脂、美容、抗衰老等功效。

從已有的文獻(xiàn)分析，可以發(fā)現(xiàn)比較明確的橄欖和滇橄欖解酒護(hù)肝的藥效成分中至少含有部分的黃酮類物質(zhì)、醇類物質(zhì)、多酚類物質(zhì)，但其具體的成分的鑒別及配比的系統(tǒng)研究還未開展。國內(nèi)對(duì)滇橄欖的開發(fā)利用極為重視，我國主要對(duì)滇橄欖提取物做了大量研究工作，并且已經(jīng)開發(fā)出眾多功能性產(chǎn)品，在食品保健、香精香料及醫(yī)藥臨床上以得到廣泛應(yīng)用（《一種口腔護(hù)理制劑及其制備方法》，申請(qǐng)?zhí)枺?01110291992.4；《以滇橄欖、梅子、苦丁茶和煙草制備的煙用香料及其應(yīng)用》，申請(qǐng)?zhí)枺?01410520369.5；《滇橄欖復(fù)方茶及其制備方法》，申請(qǐng)?zhí)枺?01310593498.2）。滇橄欖中含有較多的多酚，目前對(duì)滇橄欖多酚提取分離純化研究較少且多酚的得率不高。而且，最新的研究趨勢(shì)中，對(duì)于多酚在提高滋味能力方面的功效的投入越來越大。因而，開展有針對(duì)性的滇橄欖多酚提取新技術(shù)的研究及在提高滋味能力功效方面的應(yīng)用效果研究，可以提高滇橄欖的應(yīng)用價(jià)值。

目前，常見的滇橄欖多酚物質(zhì)收集方法包括沉淀法、溶劑萃取法、超濾法、大孔吸附樹脂法。前兩者方法存在溶劑耗用量大、操作繁瑣、材料不易再生等缺點(diǎn)，相比而言，超濾和大孔吸附樹脂具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。在這些方法的比較研究中，可以看出其各有優(yōu)缺點(diǎn)。液液萃取是使用最廣泛的萃取技術(shù)，其具有處理量大、溶劑選擇多樣、濃縮倍數(shù)更高的優(yōu)點(diǎn)，多用于定性分析；由于液液萃取工作量極大、有機(jī)溶劑使用量多及定量準(zhǔn)確性比較差等缺點(diǎn)，目前急需更方便、安全、高效的萃取收集技術(shù)。頂空取樣、固相微萃取和攪拌棒吸附萃取具有操作簡單，快速、無溶劑、易于自動(dòng)化操作的特點(diǎn)，適合于大量樣品的定量分析，但由于吸附材料的選擇性偏好差異，容易造成某些類型活性物質(zhì)的損失，這些方法很難實(shí)現(xiàn)對(duì)滇橄欖多酚物質(zhì)的全面萃取、富集。固相萃取是目前使用最為廣泛的樣品前處理技術(shù)，廣泛用于食品、藥品、煙草、環(huán)境等領(lǐng)域樣品的分析。固相萃取具有操作靈活，吸附材料種類多樣，溶劑使用量少，濃縮倍數(shù)高等特點(diǎn)特別適合于滇橄欖類微量及痕量重要多酚的分離、富集。由于滇橄欖組分種類、性質(zhì)的復(fù)雜性，多酚的濃度含量跨度大，目前還沒有一種滿足所有需求的前處理方法，并一次性完成對(duì)所有多酚類物質(zhì)的富集濃縮。

本發(fā)明涉及一種基于特殊樹脂吸附材料（LiChrolut EN樹脂）富集滇橄欖多酚的方法，起到對(duì)滇橄欖資源綜合利用的目的，工藝過程能盡量減少目標(biāo)成分的損失，最后得到天然的滇橄欖多酚提取物。LiChrolut EN樹脂的選擇性吸附，對(duì)于多酚有較好的吸附作用，而對(duì)樣品中含量更豐富的的糖類、色素、氨基酸、咖啡堿、維生素等吸附效果較差，適合于萃取滇橄欖多酚成分，本方法的特征是成品滇橄欖多酚無溶劑殘留，無特殊異味，香氣新鮮、濃郁，得率更高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種基于特殊樹脂吸附材料（LiChrolut EN樹脂）富集滇橄欖多酚的方法，起到對(duì)滇橄欖資源綜合利用的目的，工藝過程能盡量減少目標(biāo)致香成分的損失，最后得到天然的滇橄欖多酚提取物。該滇橄欖多酚收集方法，更適合于萃取滇橄欖中成分極少且濃度含量跨度大的多酚類組分，其特征是成品滇橄欖多酚無溶劑殘留，無特殊異味，香氣新鮮、濃郁，提取率更高。從而提供了一種綠色環(huán)保、前景廣闊的滇橄欖多酚富集純化技術(shù)。

按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案：一種滇橄欖多酚的富集純化方法，步驟如下：

（1）滇橄欖前處理：稱取一定量的干燥滇橄欖，置于45℃真空干燥箱中烘至接近絕干，然后將真空干燥箱溫度調(diào)至105℃烘至恒重，并按40~80目粒度選擇要求過篩后，備用；

（2）滇橄欖粗多酚的制備：準(zhǔn)確稱?。?）得到的滇橄欖粉末5.00g，放置于500mL圓底燒瓶中，按1︰20~1︰60 g/mL的料液比加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液300mL，40℃水浴中回流提取6h后過濾，所得濾液即為上固相萃取柱前的滇橄欖粗多酚；

（3）固相萃取柱的填裝：自行填裝對(duì)滇橄欖多酚具有良好吸附功能的固相萃取柱；

（4）LiChrolut EN固相萃取柱的活化處理：上樣前先依次分別采用20 mL二氯甲烷，20 mL甲醇、30mL超純水對(duì)萃取柱進(jìn)行活化處理；

（5）上樣：?。?）得到的滇橄欖粗多酚，以去離子水按照2~6 倍體積的稀釋倍數(shù)稀釋后上樣LiChrolut EN固相萃取柱，控制過程中1.0~3.0 mL/min的上樣流速，上樣完成后先用石油醚除脂，然后用有機(jī)溶劑萃取，得到有機(jī)溶劑相萃取物和水相殘留物，萃取3次，每次萃取時(shí)間30min，溶劑用量為3×200mL；

（6）分級(jí)處理：將（5）萃取得到的有機(jī)溶劑相萃取物在35℃真空濃縮至10mL，然后置于培養(yǎng)皿中，并用少量純水清除殘留于萃取柱壁上的液體，合并后冷凍干燥即為最終的滇橄欖多酚成品。

步驟（4）所述所用固相萃取柱選擇為德國默克密理博公司LiChrolut EN/1000 mg、LiChrolut EN/500 mg或LiChrolut EN/200 mg。

步驟（5）所述萃取用有機(jī)溶劑為乙醚、乙酸乙酯或正丁醇。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用LiChrolut EN樹脂的選擇性吸附，對(duì)于多酚有較好的吸附作用，而對(duì)樣品中含量更豐富的的糖類、色素、氨基酸、咖啡堿、維生素等吸附效果較差，測(cè)定所得滇橄欖多酚的得率最高可達(dá)到247.9 mg GAE/100 g；滋味能力最高可達(dá)到1.52，比粗多酚滋味能力提高2.2～2.8倍。

具體實(shí)施方式

以下給出實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

（1）滇橄欖前處理：稱取一定量的干燥滇橄欖，置于45℃真空干燥箱中烘至接近絕干，然后將真空干燥箱溫度調(diào)至105℃烘至恒重，并按滇橄欖60目粒度選擇要求過篩后，備用；

（2）滇橄欖粗多酚的制備：準(zhǔn)確稱取（1）得到的60目的滇橄欖粉末5.00g，放置于500mL圓底燒瓶中，按料液比為1︰40 g/mL加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液300mL，40℃水浴中回流提取6h后過濾，所得濾液即為上固相萃取柱前的滇橄欖粗多酚；采用Dot 值法即多酚類物質(zhì)的濃度/各自的濃度閾值測(cè)定并計(jì)算滇橄欖粗多酚滋味品質(zhì)值為0.62；

（3）固相萃取柱的填裝：自行填裝對(duì)滇橄欖多酚具有良好吸附功能的LiChrolut EN（500 mg）固相萃取柱；

（4）LiChrolut EN固相萃取柱的活化處理：上樣前先依次分別采用用20 mL二氯甲烷，20 mL甲醇、30mL超純水對(duì)萃取柱進(jìn)行活化處理；

（5）上樣：取一定量（2）得到的滇橄欖粗多酚，以去離子水稀釋4倍后上樣LiChrolut EN固相萃取柱，控制過程中上樣流速為2.0 mL/min，上樣完成后先用石油醚除脂，然后用正丁醇萃取，得到正丁醇相萃取物和水相殘留物，萃取3次，每次萃取時(shí)間30min，溶劑用量為3×200mL；

（6）分級(jí)處理：將（5）萃取得到的正丁醇相萃取物在35℃真空濃縮至10mL左右，然后置于培養(yǎng)皿中，并用少量純水清除殘留于萃取柱壁上的液體，合并后冷凍干燥即為最終的滇橄欖多酚成品。

以Folin-Ciocalteu法測(cè)定并計(jì)算得率為247.9 mg GAE/100 g；采用Dot 值法即多酚類物質(zhì)的濃度/各自的濃度閾值測(cè)定并計(jì)算滋味品質(zhì)值為1.52。

實(shí)施例2

（1）滇橄欖前處理：稱取一定量的干燥滇橄欖，置于45℃真空干燥箱中烘至接近絕干，然后將真空干燥箱溫度調(diào)至105℃烘至恒重，并按滇橄欖80目粒度選擇要求過篩后，備用；

（2）滇橄欖粗多酚的制備：準(zhǔn)確稱?。?）得到的80目的滇橄欖粉末5.00g，放置于500mL圓底燒瓶中，按料液比為1︰40 g/mL加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液300mL，40℃水浴中回流提取6h后過濾，所得濾液即為上固相萃取柱前的滇橄欖粗多酚；采用Dot 值法即多酚類物質(zhì)的濃度/各自的濃度閾值測(cè)定并計(jì)算滇橄欖粗多酚滋味品質(zhì)值為0.59；

（3）固相萃取柱的填裝：自行填裝對(duì)滇橄欖多酚具有良好吸附功能的LiChrolut EN（500 mg）固相萃取柱；

（4）LiChrolut EN固相萃取柱的活化處理：上樣前先分別采用用20 mL二氯甲烷，20 mL甲醇、30mL超純水對(duì)萃取柱進(jìn)行活化處理；

（5）上樣：取一定量（2）得到的滇橄欖粗多酚，以去離子水稀釋6倍后上樣LiChrolut EN固相萃取柱，控制過程中上樣流速為2.0 mL/min，上樣完成后先用石油醚除脂，然后用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯相萃取物和水相殘留物，萃取3次，每次萃取時(shí)間30min，溶劑用量為3×200mL；

（6）分級(jí)處理：將（5）萃取得到的乙酸乙酯相萃取物在35℃真空濃縮至10mL左右，然后置于培養(yǎng)皿中，并用少量純水清除殘留于萃取柱壁上的液體，合并后冷凍干燥即為最終的滇橄欖多酚成品。

以Folin-Ciocalteu法測(cè)定并計(jì)算得率為240.6 mg GAE/100 g；采用Dot 值法即多酚類物質(zhì)的濃度/各自的濃度閾值測(cè)定并計(jì)算滋味品質(zhì)值為1.48。

實(shí)施例3

（1）滇橄欖前處理：稱取一定量的干燥滇橄欖，置于45℃真空干燥箱中烘至接近絕干，然后將真空干燥箱溫度調(diào)至105℃烘至恒重，并按滇橄欖60目粒度選擇要求過篩后，備用；

（2）滇橄欖粗多酚的制備：準(zhǔn)確稱取（1）得到的60目的滇橄欖粉末5.00g，放置于500mL圓底燒瓶中，按料液比為1︰60 g/mL加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液300mL，40℃水浴中回流提取6h后過濾，所得濾液即為上固相萃取柱前的滇橄欖粗多酚；采用Dot 值法即多酚類物質(zhì)的濃度/各自的濃度閾值測(cè)定并計(jì)算滇橄欖粗多酚滋味品質(zhì)值為0.53；

（3）固相萃取柱的填裝：自行填裝對(duì)滇橄欖多酚具有良好吸附功能的LiChrolut EN（1000 mg）固相萃取柱；

（4）LiChrolut EN固相萃取柱的活化處理：上樣前先依次分別用20 mL二氯甲烷，20 mL甲醇、30mL超純水對(duì)萃取柱進(jìn)行活化處理；

（5）上樣：取一定量（2）得到的滇橄欖粗多酚，以去離子水稀釋2倍后上樣LiChrolut EN固相萃取柱，控制過程中上樣流速為3.0 mL/min，上樣完成后先用石油醚除脂，然后用乙醚萃取，得到乙醚相萃取物和水相殘留物，萃取3次，每次萃取時(shí)間30min，溶劑用量為3×200mL；

（6）分級(jí)處理：將（5）萃取得到的乙醚相萃取物在35℃真空濃縮至10mL左右，然后置于培養(yǎng)皿中，并用少量純水清除殘留于萃取柱壁上的液體，合并后冷凍干燥即為最終的滇橄欖多酚成品。

以Folin-Ciocalteu法測(cè)定并計(jì)算得率為238.2 mg GAE/100 g；采用Dot 值法即多酚類物質(zhì)的濃度/各自的濃度閾值測(cè)定并計(jì)算滋味品質(zhì)值為1.41。

實(shí)施例4

（1）滇橄欖前處理：稱取一定量的干燥滇橄欖，置于45℃真空干燥箱中烘至接近絕干，然后將真空干燥箱溫度調(diào)至105℃烘至恒重，并按滇橄欖40目粒度選擇要求過篩后，備用；

（2）滇橄欖粗多酚的制備：準(zhǔn)確稱取（1）得到的40目的滇橄欖粉末5.00g，放置于500mL圓底燒瓶中，按料液比為1︰20 g/mL加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液300mL，40℃水浴中回流提取6h后過濾，所得濾液即為上固相萃取柱前的滇橄欖粗多酚；采用Dot 值法即多酚類物質(zhì)的濃度/各自的濃度閾值測(cè)定并計(jì)算滇橄欖粗多酚滋味品質(zhì)值為0.49；

（3）固相萃取柱的填裝：自行填裝對(duì)滇橄欖多酚具有良好吸附功能的LiChrolut EN（2000 mg）固相萃取柱；

（4）LiChrolut EN固相萃取柱的活化處理：上樣前先依次分別用20 mL二氯甲烷，20 mL甲醇、30mL超純水對(duì)萃取柱進(jìn)行活化處理；

（5）上樣：取一定量（2）得到的滇橄欖粗多酚，以去離子水稀釋4倍后上樣LiChrolut EN固相萃取柱，控制過程中上樣流速為1.0 mL/min，上樣完成后先用石油醚除脂，然后用正丁醇萃取，得到正丁醇相萃取物和水相殘留物，萃取3次，每次萃取時(shí)間30min，溶劑用量為3×200mL；

（6）分級(jí)處理：將（5）萃取得到的正丁醇相萃取物在35℃真空濃縮至10mL左右，然后置于培養(yǎng)皿中，并用少量純水清除殘留于萃取柱壁上的液體，合并后冷凍干燥即為最終的滇橄欖多酚成品。

以Folin-Ciocalteu法測(cè)定并計(jì)算得率為230.1 mg GAE/100 g；采用Dot 值法即多酚類物質(zhì)的濃度/各自的濃度閾值測(cè)定并計(jì)算滋味品質(zhì)值為1.36。