本發(fā)明涉及一種貽貝多肽口服液的制備方法。

背景技術：

我國目前是世界上貽貝產量最大的國家,年產量超過100萬噸。由于加工技術落后,我國貽貝主要用于生鮮、冷凍制品的出口,導致貽貝的附加值較低,蛋白質資源浪費嚴重。而且,紫貽貝作為滋補食療品,對肝腎不足、眩暈盜汗、體弱貧血、腰痛、老年高血壓病、動脈血管硬化等癥狀均有一定療效,而多項研究也表明,貽貝多肽具有顯著的抗炎、抗微生物、抗凝血、抗癌、降血壓等功能活性。

貽貝作為一種重要的海洋經濟貝類，活性多糖、功能性多肽、牛磺酸、多不飽和脂肪酸含量豐富，具有很高的食用價值和保健價值。目前，我國的貽貝加工水平不高，加工技術落后，機械化程度低，加工產品主要是傳統(tǒng)類型，加工附加值低。如冷凍調理加工，王宏海等對貽貝肉的冷凍調理加工進行了研究，通過選料、洗滌、采肉、調味、瀝水、裹面包糠外衣、冷凍等工藝制得產品，在-18℃以下保存可達6個月；軟罐頭加工，童軍峰等以新鮮海灣貽貝為原料進行軟罐頭加工研究，原料清洗后，以2%鹽水溶液浸泡除腥，沸水中蒸煮5～8min后取肉、瀝干，之后真空包裝，真空度維持在0.09mpa左右，最后進行高壓殺菌，，所得產品香氣濃郁，富有彈性，咀嚼感好。劉昌衡等以鮮活貽貝為原料，經暫養(yǎng)吐沙、15℃以下自來水清洗、蒸10min、去殼取肉、調味、殺菌、真空包裝、二次殺菌得到產品。劉洪亮等以冷凍加工后的貽貝為原料，經解凍、清洗、脫腥、瀝干、蒸煮、調味、干燥、包裝、殺菌等工藝制得成品；熏制加工，李夢嬌等采用當前較為先進的液熏技術對貽貝進行加工。以新鮮貽貝為原料，經洗凈、蒸煮取肉、脫腥、瀝干、調味、干燥、熏制、裝罐、密封、滅菌等工藝制得成品；調味品加工，劉樹青等利用復合蛋白酶對貽貝肉水解，在酶解溫度50℃、酶解時間6h、加酶量0.4%的條件下，水解液的氨基酸態(tài)氮值和水解率分別達到0.83%與45%，在此基礎上，對水解液用酵母菌發(fā)酵脫腥，所得產品酯香濃郁，品質最佳；貽貝串加工，李廬峰等以新鮮海灣貽貝為原料，經清洗、蒸煮、取肉、去足絲、瀝水、調味、裹外衣、穿串、速凍、冷藏等工藝制得產品。

隨著對貽貝加工利用研究的日益廣泛與深入，開發(fā)具有生理活性的貽貝深加工產品具有巨大的發(fā)展前景。尤其采用酶解法制備水產功能性的多肽，jurlg等模擬腸胃消化貽貝，從中得到一種分子量為1.5kda的14肽(lvgdeqavpavcvp)，具有抗多不飽和脂肪酸氧化的作用，其抗氧化活性比vc和ve更強；他們從貽貝發(fā)酵液中純化分離了一種5肽fghpy(分子量為620da)，在200μg／ml濃度時具有較強的清除自由基的能力。而rajapakse等人卻從貽貝發(fā)酵液中純化分離了一種抗氧化肽7肽hfgdpfh(分子量為962）；劉尊英等采用酶法制各的貽貝的酶解產物對果蔬病原菌botryiscinerea有良好的抗菌活性；韓國學者je等從發(fā)酵的紫貽貝液中純化分離得到的10個氨基酸殘基的降血壓肽，其ic50為19．34mg／ml,具有很強的抑制ace酶的活性；另外從紫貽貝中分離得到一個22個氨基酸的抗凝血(anticoagulant)肽，其序列為eadidgdgqvnyeefvammtsk，分子量為2．5kda，能夠與關鍵的血凝因子作用，從而延長321s血液凝固時間。另外從mgalloprovincialis中發(fā)現(xiàn)一種含有15種必需和非必需氨基酸的萃取物，具有明顯的抗炎效應，可用于皮膚燒傷愈合治療。隨著對貽貝加工技術越來越深入的研究，更多的酶解活性肽被提取出來，但由于貽貝酶解液的不穩(wěn)定性導致貽貝沒有涉足飲料行業(yè)，貽貝多肽口服液也未見有報道研究。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在通過酶解工藝流程，主要利用胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶對紫貽貝進行酶解，通過添加乳化劑、穩(wěn)定劑、調味料，制備一種新型的貽貝多肽口服液，為功能性食品行業(yè)提供一種新型的貽貝多肽口服液產品。

本發(fā)明的技術方案是這樣實現(xiàn)的：一種貽貝多肽口服液的制備方法，步驟如下：1）紫貽貝預處理：新鮮紫貽貝清洗、去殼、去足絲后，將貽貝肉剪碎后勻漿；2）酶解：選擇胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶分別在ph2~4、ph7.5~9.0、ph7~8和25~40℃、37~45℃、37~50℃條件下酶解，滴加調節(jié)溶液維持酶解過程中溶液ph恒定不變；待酶解完成后沸水浴滅酶，離心即得貽貝多肽酶解液；3）將添加劑完全溶解在水中，將貽貝多肽酶解液與一定體積含添加劑的溶液攪拌混合均勻，使貽貝多肽液最終蛋白濃度為0.1~3.0%w/v，得到貽貝多肽口服液。

進一步地，剪碎的貽貝肉5000-10000rpm/2-5min進行勻漿。

進一步地，所述酶解過程，料液比1:2-1:5。

進一步地，所述調節(jié)溶液為0.1mol/lhcl和0.2mol/lnaoh。

進一步地，待酶解完成后沸水浴滅酶5-15min；酶解液8000-10000rpm離心10-20min。

進一步地，所述添加劑為cmc-na、黃原膠、β-環(huán)狀糊精、z-trim等食品穩(wěn)定劑的一種或者多種。

進一步地，添加劑溶于70℃水中，然后在磁力攪拌器上攪拌30min。

進一步地，所述添加劑的添加總量為酶解液的0.05～3%w/v。

進一步地，調配后在60～90℃、3000-5000rpm均質2-20min，降低貽貝多肽液體系的粒度，增加其乳化性和蛋白質穩(wěn)定性。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明以紫貽貝蛋白酶解上清液為主要原料，配合一定比例的食品添加劑、均質、殺菌，調配成易為消費者接受的貽貝多肽口服液，一方面通過深加工提高貽貝的附加值；另一方面，為人類的健康發(fā)展又提供一類新的營養(yǎng)保健品，一種穩(wěn)定性好、口味佳的貽貝多肽口服液。采用不同酶的酶解技術，在不同溫度、ph、時間、酶活下的酶解條件；采用添加不同種類的蛋白穩(wěn)定劑、乳化劑、調味劑，減少蛋白質分子間的聚合趨勢、提高體系的乳化穩(wěn)定性、減少因脂肪析出造成的顆粒變大和水溶特性下降。

具體實施方式

下面結合具體實施例對發(fā)明作進一步解釋說明。

（1）紫貽貝樣品預處理：購買的新鮮紫貽貝用自來水徹底沖洗干凈,然后用去離子水潤洗；去殼、去足絲后；將貽貝肉剪碎；5000-10000rpm/2-5min勻漿；

（2）酶解：料液比1:2-1:5；分別用1mol/lhcl和0.5mol/lnaoh調節(jié)溶液ph；選擇3000-5000u/g的胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶分別在ph2、ph8.5、ph7.5，37℃、45℃、40℃條件下酶解60-180min；滴加0.1mol/lhcl、0.2mol/lnaoh維持酶解過程中溶液ph恒定不變；待酶解完成后沸水浴滅酶10min；酶解液8000-10000rpm離心10-20min，即得貽貝多肽酶解液。

（3）調配工藝：貽貝多肽液，放70℃水浴鍋中靜置使其水合；將cmc-na、黃原膠、β-環(huán)狀糊精、z-trim溶解于70℃的去離子水中，于磁力攪拌器上攪拌30min至完全溶解，靜置使其充分水合；將貽貝多肽酶解液與一定體積含添加劑的溶液攪拌混合均勻，使貽貝多肽液最終蛋白濃度為1%(w/v)，70℃、3000-5000rpm均質10min，降低貽貝多肽液體系的粒度，增加其乳化性和蛋白質穩(wěn)定性。

相關測定方法

（1）考馬斯亮藍法測蛋白

考馬斯亮藍(coomassiebrilliantblue)法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質與染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法?？捡R斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸(特別是精氨酸)和芳香族氨基酸殘基相結合。經測定儲存前后蛋白含量后計算結果顯示含有cmc-na、黃原膠、β-環(huán)狀糊精、z-trim體系的蛋白質沉淀率分別為8.59%、7.32%、1.95%、8.23%。

（2）蛋白質測定方法

采用自動凱氏定氮法進行測定。稱取0.2g貽貝酶解上清液，精確至0.001g。按照儀器說明書的要求進行檢測。計算的時候氮的換算為蛋白質的系數為6.38。以重復性條件下獲得的三次獨立測定結果的算術平均值表示，蛋白質含量≥1g/100g時，結果保留三位有效數字。經測定新鮮貽貝蛋白質含量為10%，其干品蛋白質含量為60%。

（3）內源熒光光譜測定

通過熒光光譜儀對貽貝多肽液進行內源性熒光測定，用10mm的磷酸鹽緩沖溶液（ph8）將貽貝多肽溶液稀釋100倍，設定激發(fā)波長λex為290nm，熒光發(fā)射和激發(fā)狹縫均為5.0nm，在260～350nm范圍內測定貽貝多肽液的熒光發(fā)射光譜。儲存后的熒光強度從儲存前的2000降為1800，并發(fā)生了藍移，熒光強度黃原膠和cmc-na較其他兩種添加劑從儲存前較低的熒光強度變?yōu)閮Υ婧筝^高的熒光強度。

（4）貽貝多肽液粒度測定

利用zetasize3000hsa激光粒度分析儀對貽貝多肽液體系的粒度大小分布進行測定，分別以以光強度為權重的平均粒徑(di)，體積為權重的平均粒徑(dv)和數均粒徑（dn）來表述不同酶解體系的粒度分布情況。以準確度較高的di值來表示4種體系儲存前后的粒徑分布情況，儲存前cmc-na、黃原膠、β-環(huán)狀糊精、z-trim的平均粒徑分別為323.6nm、626nm、221.6nm、333.9nm，儲存后將明顯的大顆粒沉淀離心去除后測上清液的粒度分布情況為569.6nm、712.1nm、1351.1nm、315.9nm，β-環(huán)狀糊精粒度變化最為明顯,體系最為不穩(wěn)定。

（5）貽貝多肽液zeta-電位測定

用10mm的磷酸鹽緩沖溶液（ph8）將貽貝多肽液稀釋10倍，通過zetasize3000hsa激光粒度分析儀測貽貝多肽液體系的zeta-電位。經測定cmc-na、黃原膠、β-環(huán)狀糊精、z-trim的zeta-電位值分別為-48.8、-49.2、-29、-35.2。通常帶正電荷的微粒，其zeta-電位為正值；反之為負值。體系中貽貝多肽液中蛋白與不同添加劑的相互作用以zeta-電位值的變化表示，zeta-電位絕對值越大，體系越穩(wěn)定。添加不同穩(wěn)定劑體系的穩(wěn)定性結果顯示黃原膠＞cmc-na>z-trim>β-環(huán)狀糊精。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內，根據本發(fā)明的技術方案及其發(fā)明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。