本發(fā)明屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種酸性蛋白酶在食品和/或飼料領(lǐng)域中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：凝乳酶是奶酪生產(chǎn)中使乳液凝固的關(guān)鍵性酶，它對奶酪的產(chǎn)量和風(fēng)味有重大的影響，據(jù)統(tǒng)計，凝乳酶的產(chǎn)值占整個酶制劑總產(chǎn)值的15.5％。凝乳酶可以分為3類：動物性凝乳酶，植物性凝乳酶和微生物凝乳酶。動物性凝乳酶約占市場份額的70％，其中的小牛皺胃酶是目前效果最好的凝乳酶，但新生小牛的皺胃數(shù)量有限，這種方法的成本大產(chǎn)量少，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，另外從豬羊等其他動物提取凝乳酶生產(chǎn)的奶酪的風(fēng)味不佳，無法很好的替代；植物性凝乳酶主要來自木瓜、無花果等植物，有木瓜蛋白酶、生姜蛋白酶、無花果蛋白酶、合歡蛋白酶、菠蘿蛋白酶、朝鮮薊蛋白酶等，但這些凝乳酶凝乳活性低，蛋白水解活性強且容易產(chǎn)生苦味；而微生物產(chǎn)的凝乳酶，其生產(chǎn)周期短，產(chǎn)量大，受環(huán)境因素影響小，生產(chǎn)成本較低，擁有巨大的發(fā)展前景。此外，現(xiàn)有的大部分凝乳酶熱穩(wěn)定較高，給奶酪熟化帶來不利影響，降低奶酪的產(chǎn)量，而且對風(fēng)味造成不利的影響。谷朊粉是是以小麥為原料，經(jīng)過深加工提取的一種天然谷物蛋白。它在食品、飼料、化工和造紙等工業(yè)有著廣泛的用途，如用于面包、面條、肉類、魚類、家禽產(chǎn)品、寵物食品、飼料、比薩和調(diào)味品等。但是谷朊粉蛋白含有較多的疏水性氨基酸和不帶電荷的氨基酸，分子內(nèi)的疏水作用區(qū)域較大，溶解度極低，溶解的蛋白質(zhì)在水溶液中的回收率低，往往不能滿足實際應(yīng)用中加工的需要，很大程度上限制了谷朊粉的應(yīng)用。所以目前針對于谷朊粉的改性方法研究是一個突破口，改性方法可以分為物理法、化學(xué)法和酶法。相對于物理法、化學(xué)法，酶法改性速度快，條件溫和，能耗低，反應(yīng)效率高，不需要特殊的設(shè)備，一般不會導(dǎo)致營養(yǎng)方面的損失，也不會產(chǎn)生毒理方面的問題。因此，酶法改性在提高谷朊粉的應(yīng)用價值中具有重大意義和發(fā)展前景。目前在對谷朊粉進(jìn)行酶法改性的研究中，2007年Kong的研究表明堿性蛋白酶Alcalase2.4L對谷朊粉的改性效果遠(yuǎn)好于PTN6.0S，胃蛋白酶，Neutrase，胰酶和Protamex；2014年付博菲報道了在對谷朊粉改性的效果中，復(fù)合蛋白酶＞堿性蛋白酶＞中性蛋白酶＞胃蛋白酶＞風(fēng)味蛋白酶；堿性蛋白酶由于其低廉的價格和較好的改性效果是目前谷朊粉酶解中較為理想的蛋白酶。大豆蛋白中含有甲硫氨酸，其余必需氨基酸含量均較豐富，是目前最具營養(yǎng)價值的植物性蛋白質(zhì)。而且以大豆蛋白為代表的植物蛋白，產(chǎn)量大，獲取渠道簡單，加工簡單，成本價格遠(yuǎn)低于動物性蛋白，是人類食品添加蛋白以及動物飼料添加蛋白的廉價優(yōu)質(zhì)蛋白來源。但是大豆蛋白溶解度較低，有一定抗原性，消化率和生物效價低于動物蛋白，而且其中含有抗?fàn)I養(yǎng)因子，不容易消化吸收，對喂養(yǎng)的動物產(chǎn)品尤其是水產(chǎn)動物的質(zhì)量與產(chǎn)量造成不利影響，限制了其在動物飼料中的廣泛應(yīng)用。通過水解獲得的大豆蛋白多肽，具有容易吸收，迅速為機體提供能力和氨基酸，無殘渣，分子量小，易溶于水等多項優(yōu)點，是理想的大豆深加工產(chǎn)品。2015年P(guān)ia的研究表明在大豆蛋白水解中堿性蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的效果要比Neutrase、Corolase、PTN6.0S、Flavourzyme、Protamex和ProteaseN-01要好。目前為止，尚未有人分離純化過哈茨木霉的P6281蛋白酶，更未有人將其用于乳類凝乳、谷朊粉溶解及大豆蛋白水解。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種酸性蛋白酶在食品和/或飼料領(lǐng)域中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種酸性蛋白酶在食品和/或飼料領(lǐng)域中的應(yīng)用，所述的酸性蛋白酶為蛋白酶P6281。所述的應(yīng)用優(yōu)選為所述的酸性蛋白酶在改性乳類和/或豆類中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用優(yōu)選為所述的酸性蛋白酶在乳類凝乳中的應(yīng)用。所述的乳類優(yōu)選為脫脂奶粉、全脂奶粉、配方奶粉、鮮乳和加工乳中的一種或至少兩種。所述的食品優(yōu)選為奶酪。所述的應(yīng)用優(yōu)選為所述的酸性蛋白酶在溶解谷朊粉中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用優(yōu)選為所述的酸性蛋白酶在大豆蛋白水解中的應(yīng)用。所述的蛋白酶P6281的應(yīng)用條件優(yōu)選為：pH為2.5～6，溫度為35℃±5℃；進(jìn)一步優(yōu)選為pH為2.5，溫度為40℃。所述的蛋白酶P6281優(yōu)選通過如下步驟制備得到：克隆p6281編碼基因，并構(gòu)建可以表達(dá)P6281的菌株，表達(dá)蛋白酶P6281，純化后獲得蛋白酶P6281。所述的p6281編碼基因來源于哈茨木霉。所述的哈茨木霉優(yōu)選為哈茨木霉GIM3.442。所述的菌株優(yōu)選為畢赤酵母；進(jìn)一步優(yōu)選為畢赤酵母GS115。所述的蛋白酶P6281更優(yōu)選通過如下具體步驟得到：(1)培養(yǎng)哈茨木霉；(2)提取哈茨木霉總RNA；(3)通過RT-PCR獲得p6281編碼基因；(4)獲取TA克隆與重組質(zhì)粒的篩選鑒定；(5)將經(jīng)過鑒定的基因p6281轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115；(6)酸性蛋白酶P6281的發(fā)酵誘導(dǎo)及純化；(7)重組蛋白的SDS-PAGE檢測。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：1.目前尚未有人分離純化過哈茨木霉的P6281蛋白酶，更未有人將其用于凝乳、谷朊粉溶解及大豆蛋白水解。本發(fā)明在首次成功表達(dá)純化了哈茨木霉的酸性蛋白酶P6281的基礎(chǔ)上，首次將其應(yīng)用于凝乳、谷朊粉溶解及大豆蛋白水解。2.本發(fā)明所用的P6281蛋白酶，其發(fā)酵液蛋白酶活為每毫升321.8個單位，比酶活為每毫克4373.1個單位，高于現(xiàn)有技術(shù)中木霉屬酸性蛋白酶，如2007年Liu在釀酒酵母表達(dá)的哈茨木霉SA76酸性蛋白酶發(fā)酵液酶活10.5U/mL，2010年Guo在釀酒酵母表達(dá)的粗糙鏈孢菌酸性蛋白酶發(fā)酵液酶活6.8U/mL，2013年Yang在畢赤酵母表達(dá)的棘孢木霉酸性蛋白酶發(fā)酵液酶活18.5U/mL，2014年Dou在大腸桿菌表達(dá)的棘孢木霉ASP55酸性蛋白酶純酶液酶活9.52U/mL。3.蛋白酶P6281的凝乳活性好，且熱穩(wěn)定性較低，解決了現(xiàn)有技術(shù)中的蛋白酶會給奶酪熟化帶來不利影響，降低奶酪的產(chǎn)量，影響風(fēng)味等技術(shù)問題。4.蛋白酶P6281對谷朊粉或大豆蛋白的高效水解，效果均優(yōu)于目前在谷朊粉體外水解中被認(rèn)為是效果最好的堿性蛋白酶和水解大豆蛋白性能最好的堿性蛋白酶和胃蛋白酶。同時，蛋白酶P6281作為酸性蛋白酶，更適合在哺乳動物酸性胃液中發(fā)揮作用。谷朊粉和大豆蛋白都是動物飼料的重要原料，酸性蛋白酶P6281對其高效水解，使其在食品或飼料中具有很好的應(yīng)用前景。附圖說明圖1是蛋白酶P6281熱穩(wěn)定性測定的結(jié)果分析圖。圖2是蛋白酶P6281的凝乳效果照片圖。圖3是蛋白酶P6281對提高谷朊粉溶解度的效果照片圖。圖4是重組表達(dá)載體pPIC9BM-p6281的質(zhì)粒圖譜圖。圖5是重組蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖，其中，M表示標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，泳道1是經(jīng)過4天發(fā)酵誘導(dǎo)后得到的粗酶液，泳道2是經(jīng)過5天發(fā)酵誘導(dǎo)后純化后的樣品，泳道3是經(jīng)過5天發(fā)酵誘導(dǎo)的粗酶液，泳道4是經(jīng)過5天誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化空載體的畢赤酵母上清液。具體實施方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。以下實施例中所用的堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、大豆蛋白均購自奧博星生物技術(shù)公司；脫脂奶粉、BCA試劑盒均購自生工生物工程股份有限公司；谷朊粉(總蛋白量為75％)購自蜜丹兒天貓旗艦店。實施例1蛋白酶P6281的獲得與酶活測定(1)將通過基因工程技術(shù)獲得的重組畢赤酵母接種到BMGY培養(yǎng)基(酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，YNB13.4g，甘油10mL，1M磷酸鉀(pH6.0)100mL，蒸餾水定容至1000mL)中，在30℃下220rpm培養(yǎng)1～2天，離心獲得菌體沉淀并轉(zhuǎn)接于2倍體積的BMMY培養(yǎng)基中，在28℃下220rpm培養(yǎng)5天，每隔24小時添加相當(dāng)于1.5％培養(yǎng)基體積的甲醇，最終獲得發(fā)酵液；(2)將發(fā)酵液離心獲得粗酶液，通過鎳柱親和層析和SephadexG-75分子篩層析獲得純酶液，其中鎳柱親和層析所用洗脫液為0.01M咪唑、0.5MNaCl、0.02M磷酸緩沖液(pH7.4)；SephadexG-75柱層析所用沖洗液為0.05MNaCl、0.02M磷酸緩沖液(pH6.0)；(3)蛋白酶活測定：采用《SB/T10317-1999蛋白酶活力測定法》中的“福林法”測定P6281的蛋白酶活。把1mL用pH2.5乳酸緩沖液(0.1M乳酸鈉溶液用乳酸調(diào)至pH＝2.5)適當(dāng)稀釋的酶液與1mL含有2％酪蛋白的pH2.5乳酸緩沖液分別在40℃預(yù)熱10分鐘，充分混勻后在40℃水浴反應(yīng)20分鐘，馬上加入2mL0.4M三氯乙酸終止反應(yīng)，在12000rpm離心10分鐘后吸取1mL上清加入5mL0.4M的碳酸鈉溶液，然后再加入1mL稀釋的福林酚溶液，充分混勻后在40℃水浴顯色20分鐘，然后在660nm吸光度測量吸光值，并根據(jù)實驗前作好的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白梯度濃度溶液-吸光值曲線計算蛋白酶酶活，以100℃沸水浴10分鐘的酶液作為空白對照。(4)熱穩(wěn)定性測定：先把1mL用pH2.5乳酸緩沖液適當(dāng)稀釋的酶液分別置于30℃、35℃、40℃、45℃和50℃下溫育相應(yīng)時間(不溫育、溫育5min、10min、30min、60min、120min)，再用前述蛋白酶活測定方法分別測定蛋白酶酶活。以在pH2.5、40℃下每分鐘水解生產(chǎn)1μg酪氨酸所需的酶量為1個酶活單位(U)測得發(fā)酵液蛋白酶活為每毫升321.8個單位，比酶活為每毫克4373.1個單位。與現(xiàn)有報道的木霉屬酸性蛋白酶相比處于較高水平，如2007年Liu在釀酒酵母表達(dá)的哈茨木霉SA76酸性蛋白酶發(fā)酵液酶活10.5U/mL，2010年Guo在釀酒酵母表達(dá)的粗糙鏈孢菌酸性蛋白酶發(fā)酵液酶活6.8U/mL，2013年Yang在畢赤酵母表達(dá)的棘孢木霉酸性蛋白酶發(fā)酵液酶活18.5U/mL，2014年Dou在大腸桿菌表達(dá)的棘孢木霉ASP55酸性蛋白酶純酶液酶活9.52U/mL。蛋白酶P6281的最適作用溫度為40℃，溫度超過40℃不穩(wěn)定。熱穩(wěn)定性測試結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示熱穩(wěn)定性不強。最適作用pH為2.5，在pH3.0～6.0較為穩(wěn)定；米氏動力學(xué)常數(shù)Km為1.880g/L，Kmax為1.961g/L；Pepstatin(胃蛋白酶抑制劑)對P6281有非常顯著的抑制作用，Ca2+，Mn2+和Cu2+對酶有促進(jìn)作用，非離子型離子去污劑幾乎不影響酶的活性。實施例2蛋白酶P6281凝乳活性測定蛋白酶P6281凝乳活性測定再用Arima法，用pH3.0的乳酸緩沖液配制含有10mMCaCl2的10％的脫脂奶粉溶液，在脫脂奶粉溶液中添加0.1mL適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液，在35℃水浴反應(yīng)直至奶粉溶液凝固，記錄反應(yīng)時間，按照MCU＝(24,000×D)/t計算凝乳酶活，其中D為稀釋倍數(shù)，t為反應(yīng)時間。以在pH3.0、35℃每40分鐘凝固1mL脫脂奶粉溶液所需的酶量為1個酶活單位(MCU)。測得發(fā)酵液凝乳活性為每毫升64.3個單位，比酶活為每毫克2188.6個單位，熱穩(wěn)定性較低。圖2為P6281對脫脂奶粉溶液的凝乳效果，左邊為加入經(jīng)沸水浴10分鐘滅活后的P6281對照組的凝乳結(jié)果，右邊為P6281的凝乳結(jié)果；該結(jié)果可以看出經(jīng)蛋白酶P6281處理后的脫脂奶粉溶液已經(jīng)凝集成固體，可粘附在倒置的試管底部，而添加滅活酶的脫脂奶粉溶液依然是液態(tài)。實施例3蛋白酶P6281在谷朊粉溶解中應(yīng)用的效果實驗用pH2.5的乳酸緩沖液配制5％(w/v)谷朊粉溶液，分別加入P6281與沸水浴10分鐘滅活的P6281，40℃水浴6小時，5000rpm離心10分鐘。圖3為加入已滅活的蛋白酶P6281水浴6小時(左邊)和經(jīng)P6281酶解6小時后(右邊)谷朊粉不溶物殘余量的對比，酶解后的谷朊粉中可溶解蛋白明顯增多，不溶物明顯減少。用乳酸緩沖液配制pH2.5、質(zhì)量體積濃度為5％的谷朊粉溶液，按每克谷朊粉配比2000U酶活加入P6281純酶液，得到最終總體積為10mL的溶液；用磷酸緩沖液(0.05M磷酸鈉緩沖液)配制pH6.0、質(zhì)量體積濃度為5％的谷朊粉溶液，按每克谷朊粉配比2000U酶活加入木瓜蛋白酶，得到最終總體積為10mL的溶液；用碳酸鈉緩沖液(0.05M碳酸鈉緩沖液)配制pH11.0、質(zhì)量體積濃度為5％的谷朊粉溶液，按每克谷朊粉配比2000U酶活加入堿性蛋白酶，得到最終總體積為10mL的溶液。將得到的三組溶液分別在不同蛋白酶各自的最適pH和溫度條件(即P6281在pH2.5和40℃、木瓜蛋白酶在pH6.0和60℃、堿性蛋白酶在pH11.0和45℃)下，水浴反應(yīng)6小時，然后在100℃沸水浴10分鐘，5000rpm離心10分鐘，上清用BCA試劑盒測定可溶性蛋白質(zhì)含量，計算可溶蛋白量占初始谷朊粉中總蛋白量的比例為其蛋白回收率。測得蛋白酶P6281蛋白回收率為79.7％，蛋白回收效果比木瓜蛋白酶(16.8％)和堿性蛋白酶(73.2％)好。在谷朊粉體外水解中，堿性蛋白酶被認(rèn)為是目前效果最好的蛋白酶。在本發(fā)明中，P6281對谷朊粉的水解優(yōu)于堿性蛋白酶，并且P6281作為酸性蛋白酶，更適合在哺乳動物酸性胃液中發(fā)揮作用。谷朊粉是動物飼料的重要原料之一，酸性蛋白酶P6281對其高效水解，使其在飼料用的蛋白酶中有很好的應(yīng)用前景。蛋白酶P6281處理谷朊粉后水溶回收率與其它蛋白酶的比較結(jié)果見表1：表1不同蛋白酶處理谷朊粉的蛋白回收率蛋白酶谷朊粉的蛋白回收率未添加蛋白酶3.2％木瓜蛋白酶16.8％堿性蛋白酶73.2％蛋白酶P628179.7％實施例4蛋白酶P6281在大豆蛋白水解中應(yīng)用的效果實驗分別用乳酸緩沖液、磷酸緩沖液和碳酸鈉緩沖液配制大豆蛋白在pH2.5，6.0，11.0下飽和濃度的溶液。5000rpm離心10分鐘取上清，然后分別用BCA試劑盒測定大豆蛋白上清溶液的蛋白濃度，并以之作為大豆蛋白分別在pH2.5、pH6.0、11.0下的最大溶解濃度，作為樣品中原大豆蛋白濃度。取1000U量的P6281純酶液、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶，和上述離心后得到的大豆蛋白上清溶液在40℃分別預(yù)熱10min，然后分別混合(總體積為10mL)，分別在蛋白酶P6281、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶各自對應(yīng)的最適條件下(溫度和pH條件同實施例3)反應(yīng)6個小時，沸水浴10min終止反應(yīng)。分別取上清用甲醛滴定法測定氨基酸含量，取2mL上清加入5mL蒸餾水，用0.1MNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)pH至8.2，加入己用0.1MNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液中和的甲醛(pH8.2)，然后用0.1MNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定pH到9.2，記錄消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積V1。用蒸餾水代替樣品，操作方法相同，測得空白體積V0。則樣品中游離氨基的濃度(mmol/L)＝1000×0.1×(V1-V0)/5.0，樣品水解度為DH(％)＝100(1000×0.1×(V1-V0)/5.0/C-0.33)/7.8,其中，C為樣品中原大豆蛋白濃度(即上文測得的不同pH下的最大溶解濃度)，g/L；0.33為大豆蛋白中游離氨基濃度，mmol/g；7.8為每克大豆蛋白的肽鍵當(dāng)量數(shù)，mmol/g；通過甲醛滴定法測得蛋白酶P6281的水解度為15.68％，水解度高于其它蛋白酶。不同酶處理大豆蛋白水解度的測定結(jié)果見表2：表2不同蛋白酶處理大豆蛋白的水解度酶類大豆蛋白水解度木瓜蛋白酶5.69％堿性蛋白酶8.66％蛋白酶P628115.68％堿性蛋白酶和胃蛋白酶是水解大豆蛋白性能最好的蛋白酶。堿性蛋白酶價格較低，但是它不適合在動物酸性的胃液及中性的腸道中發(fā)揮作用，而胃蛋白酶價格昂貴，都限制了它們在動物飼料中的添加。本發(fā)明中，P6281對大豆蛋白的水解度遠(yuǎn)高于堿性蛋白酶，并且P6281作為酸性蛋白酶，更適合在哺乳動物酸性胃液中發(fā)揮作用。大豆蛋白是動物飼料的重要原料之一，酸性蛋白酶P6281對其高效水解，使其在飼料用的蛋白酶中有很好的應(yīng)用前景。上述結(jié)果表明酸性蛋白酶P6281具備乳類凝乳、提高谷朊粉溶解度及大豆蛋白水解的應(yīng)用潛力。實施例5蛋白酶P6281的異源表達(dá)及純化(一)哈茨木霉培養(yǎng)：將哈茨木霉GIM3.442(購于廣東省微生物菌種保藏中心)接種至PDA固體培養(yǎng)基(馬鈴薯粉濾過液200mL，葡萄糖4g，硫酸鎂0.75g，磷酸二氫鉀0.75g，瓊脂粉4g)中，30℃培養(yǎng)2天。(二)哈茨木霉總RNA提?。?1)用高壓蒸汽滅菌后的鑷子攝取約100mg的菌絲體放入液氮預(yù)冷的研缽中，加入少量液氮，用研缽快速研磨，再加入少量液氮，繼續(xù)研磨，反復(fù)3次，直至全部菌絲體徹底變成白色粉末。(2)向研缽中加入2mLRNAisoPlus(購于大連寶生物工程有限公司)，盡量將粉末完全覆蓋，然后室溫靜置，直至RNAisoPlus完全融化，用研缽繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。將所得的裂解液等量轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，室溫靜置5分鐘。12000rpm，4℃離心5分鐘，小心吸取上清液，移入新的離心管中(切勿吸取沉淀)。(3)向步驟(2)中得到的上清液加入400μL氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈振蕩15秒。待溶液充分乳化后，再室溫靜置數(shù)分鐘后12000rpm，4℃離心15分鐘。(4)從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，無色的上清液、中間的白色蛋白層和帶有顏色的下層有機相。吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；(5)向步驟(4)得到的上清液中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在室溫下靜置10分鐘后，12000rpm，4℃離心10分鐘。(6)離心之后，試管底部有沉淀。小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入1mL75％的乙醇(切勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒，洗滌離心管管壁，12000rpm，4℃離心5分鐘后小心棄去乙醇。(7)打開離心管蓋子，倒置管子，室溫干燥沉淀5分鐘，加入20μL的RNase-free水溶解沉淀，待沉淀完全溶解后，將溶解液轉(zhuǎn)移至RNase-free離心管中，置于-80℃保存。(三)RT-PCR克隆p6281編碼序列：(1)把下列組分加入到一個無核酶的PCR管中：表3RT-PCR體系(2)65℃保溫上述混合物5分鐘后迅速置于冰上，再加入4μL5×First-Strandbuffer，2μL0.1MDTT，1μL40U/mLRNase抑制劑于上述混合物中，輕輕混合并在37℃培養(yǎng)2分鐘；(3)加入1μL反轉(zhuǎn)錄酶，輕輕混合后在37℃培養(yǎng)50分鐘；(4)70℃培養(yǎng)15分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶，置于-20℃保存；(5)設(shè)計正向引物F(5’-CTGCGAATTCTCGCCGGTAAAGCCAAGT-3’)和反向引物R(5’-ACTTACGCGTAGCGGCGGTAGCAAAGC-3’)，下劃線的序列分別表示EcoRI酶切位點和MluI酶切位點。以上一步獲得的哈茨木霉cDNA為模板，按照以下PCR體系及程序，進(jìn)行PCR反應(yīng)獲得目的DNA片段；表4PCR體系PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30秒；51℃退火30秒；72℃延伸2分鐘；32個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘；然后將產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，瓊脂糖濃度為1.5％，電泳條件為120V，25min，瓊脂糖凝膠電泳的操作過程參見《分子克隆實驗指南》。得到酸性蛋白酶基因條帶大小約為1100bp，使用凝膠回收試劑盒回收目的基因。(四)TA克隆與重組質(zhì)粒的篩選鑒定(1)高保真酶產(chǎn)物經(jīng)切膠回收后，利用Ex-taq酶進(jìn)行加A反應(yīng)，按以下體系將步驟(三)得到的目的基因片段(p6281)與pMD18-T載體(購于大連寶生物工程有限公司)連接，連接條件16℃，2h；表5T載體連接體系然后42℃熱擊70秒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(購買于大連寶生物工程有限公司)，涂布含有氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，蒸餾水定容至1000mL)中，37℃培養(yǎng)過夜。然后使用2×TaqPCRMix進(jìn)行菌落PCR篩選陽性菌落，反應(yīng)體系及程序如下：表6菌落PCR體系菌落PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30秒；51℃退火30秒；72℃延伸1分鐘；32個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘；然后將產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定，瓊脂糖濃度為1％，電泳條件為120V，25min，得到酸性蛋白酶基因條帶大小約為1100bp；(2)挑取陽性克隆加入到含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基于37℃，220rpm搖床上擴大培養(yǎng)12h。取擴大培養(yǎng)的菌液于離心管中，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，經(jīng)過測序測得克隆基因長度為1107bp，測序結(jié)果如下：其核苷酸序列如SEQIDNo:3所示；(五)基因p6281轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115：(1)提取克隆有酸性蛋白酶基因的pMD18-T-p6281克隆載體質(zhì)粒，以之為模板進(jìn)行PCR擴增，PCR體系參照前文表4，然后將產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用試劑盒純化回收。把表達(dá)載體pPIC9K(購買于Invitrogen公司)多酶切位點改造，依次為BamHI，EcoRI，ApaI和MluI，并命名為pPIC9BM(圖4)。構(gòu)建載體使用RF克隆，引物為5’-GAAGCTGGATCCGAATTCCCGCTCGAGGGGCCCACGCGTCATCATCATCATC-3’(下劃線的序列分別表示EcoRI酶切位點和MluI酶切位點)，反應(yīng)體系為：表7RF克隆體系反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性3min；98℃變性10秒；58℃退火15秒；72℃延伸8分鐘；32個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘；產(chǎn)物測序鑒定；使用EcoRI和MluI對回收產(chǎn)物和pPIC9BM載體按照說明書進(jìn)行雙酶切(雙酶切體系如表8)，用普通DNA回收試劑盒對酶切后的DNA分別進(jìn)行純化回收，然后用核酸濃度檢測儀檢測DNA濃度；表8雙酶切體系酶切條件37℃，4h；(2)將純化回收的蛋白酶基因片段p6281和pPIC9BM載體片斷按摩爾比為1：5的比例利用T4連接酶進(jìn)行體外連接，連接條件22℃，8h，連接體系如下表。表9T4連接酶連接體系將連接后的重組質(zhì)粒42℃熱擊70秒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株中。在含有的平板上挑選陽性單菌落，提取其質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，并且對該菌株也進(jìn)行菌液和質(zhì)粒測序鑒定；對構(gòu)建成功的表達(dá)質(zhì)粒命名為pPIC9BM-p6281。(3)采用質(zhì)粒小提試劑盒從陽性克隆菌株的菌懸液中提取表達(dá)質(zhì)粒載體，然后對表達(dá)質(zhì)粒載體用BglII內(nèi)切酶酶切，將表達(dá)質(zhì)粒載體線性化，酶切體系如下：表10單酶切體系酶切之后，用回收試劑盒回收質(zhì)粒并測定濃度；(4)制備畢赤酵母GS115感受態(tài)，具體步驟如下：a.將-80℃凍存的畢赤酵母GS115菌株于YPD平板(胰蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g，瓊脂粉20g，蒸餾水定容至1000mL)上劃線接種，30℃培養(yǎng)3天；b.挑取畢赤酵母GS115菌株的單菌落接種至含有25mLYPD培養(yǎng)液(胰蛋白胨20g,酵母提取物10g,葡萄糖20g，蒸餾水定容至1000mL)的250mL三角瓶中，30℃、220rpm振蕩培養(yǎng)2天；c.取1mL步驟b最終得到的菌懸液接種至另一瓶含有50mLYPD培養(yǎng)液三角瓶中，30℃、220rpm振蕩培養(yǎng)數(shù)小時，至菌懸液的OD600達(dá)到2.0；d.將菌懸液轉(zhuǎn)移已滅菌的50mL離心管中，5000rpm，4℃離心5分鐘，去上清，用預(yù)冷的無菌水10mL將菌體重懸，然后轉(zhuǎn)移至15mL離心管中；e.5000rpm，4℃離心5分鐘，去上清，用預(yù)冷的1M山梨醇10mL將菌體重懸，重復(fù)一次；f.5000rpm，4℃離心5分鐘，去上清，用1mL1M山梨醇重懸菌體，置于冰上用于電轉(zhuǎn)化；(5)使用電轉(zhuǎn)化法把步驟(3)得到的線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，電擊條件為1.5kV，2mm電轉(zhuǎn)杯，10ng線性化質(zhì)粒。把電轉(zhuǎn)化后的菌液涂布MD平板，30℃培養(yǎng)2天，挑選5個單菌落分別接種YPD液體培養(yǎng)基，然后低溫裂解畢赤酵母轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，裂解方法如下：a.從MD平板(葡萄糖20g，YNB13.4g，瓊脂粉20g，蒸餾水定容至1000mL)上，挑取10個畢赤酵母轉(zhuǎn)化子單菌落分別接種至2mLYPD培養(yǎng)液中，30℃，220rpm振蕩培養(yǎng)2天；b.分別將1mL菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，8000rpm離心2min，棄上清；c.加入1mLTEbuffer重懸菌體，8000rpm離心2min，棄上清，重復(fù)一次；d.沸水浴30min后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱放置一個小時，然后沸水浴10min；e.8000rpm離心2min，所得上清置于-20℃保存；使用2×TaqPCRMix進(jìn)行菌落PCR鑒定，反應(yīng)體系及程序參照表6；(六)P6281的發(fā)酵誘導(dǎo)及純化：挑選陽性重組畢赤酵母菌株劃線MD平板，30℃培養(yǎng)2天，挑取單菌落接種于裝有50mLBMGY培養(yǎng)液(酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，YNB13.4g，甘油10mL，1M磷酸鉀(pH6.0)100mL，蒸餾水定容至1000mL)的三角瓶中，30℃，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600≈5.0。然后離心收集菌體，等量轉(zhuǎn)移菌體沉淀至裝有100mLBMMY培養(yǎng)液的三角瓶中28℃，220rpm振蕩培養(yǎng)，每24小時添加1.5％的甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)4～5天。發(fā)酵液5000rpm，4℃離心10min取得上清測定酶活；采用《SB/T10317-1999蛋白酶活力測定法》中的“福林法”測定P6281的蛋白酶活。然后使用鎳柱親和層析和SephadexG-75柱層析純化目的蛋白，其中鎳柱親和層析上樣量為150mL，所用洗脫液為0.01M咪唑、0.5MNaCl、0.02M磷酸緩沖液(pH7.4)；SephadexG-75柱層析上樣量為95mL，沖洗液為0.05MNaCl、0.02M磷酸緩沖液(pH6.0)。以轉(zhuǎn)化空載體pPIC9BM的GS115菌株作為實驗對照。通過前述方法，測得本發(fā)明所得的發(fā)酵液蛋白酶活為321.8U/mL，比酶活為4373.1U/mg。通過生工生物工程(上海)股份有限公司的BCA蛋白濃度試劑盒測得純化后的蛋白酶的產(chǎn)量為116.5mg/1000mL發(fā)酵液。Suarez等曾分別添加1％的P.ultimum，B.cinerea，R.solani細(xì)胞壁和幾丁質(zhì)作為碳源對哈茨木霉的蛋白表達(dá)進(jìn)行研究，哈茨木霉在其中添加B.cinerea細(xì)胞壁的條件下表達(dá)P6281表達(dá)量最大，但其表達(dá)的總蛋白量僅為18μg/300mL(包含P6281，未純化)。由此可見，本發(fā)明不僅首次成功異源表達(dá)純化得到P6281，且產(chǎn)量實現(xiàn)了明顯提高。(七)重組蛋白的SDS-PAGE檢測：利用SDS-PAGE凝膠電泳來確認(rèn)重組蛋白酶的表達(dá)情況、純度和分子質(zhì)量的大小。采用的濃縮膠濃度為12％以及分離膠濃度為5％，上樣量為20μL，以標(biāo)準(zhǔn)分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為Marker。SDS-PAGE凝膠電泳的操作過程參見《蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)》。對于發(fā)酵液樣品的制備，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的重組蛋白酶的量較高，可以直接將發(fā)酵液稀釋1倍后與上樣緩沖液混勻，沸水煮沸10min后，12000rpm離心1min，上樣后進(jìn)行電泳。粗酶液(指未經(jīng)過鎳柱親和層析和SephadexG-75柱層析的發(fā)酵液)與純化后酶液的SDS-PAGE電泳圖如圖5所示，M表示標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白，泳道1是經(jīng)過4天發(fā)酵誘導(dǎo)后得到的粗酶液，泳道2是經(jīng)過5天發(fā)酵誘導(dǎo)后通過親和層析和分子篩層析純化的樣品，泳道3是經(jīng)過5天發(fā)酵誘導(dǎo)的粗酶液，泳道4是經(jīng)過5天誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化空載體的畢赤酵母上清液。由圖中可以看出，轉(zhuǎn)化空載體的畢赤酵母并無蛋白表達(dá)，而未經(jīng)純化的陽性誘導(dǎo)(即泳道1和泳道3)的上清液中均有一深一淺兩個蛋白條帶，其中深色條帶大小接近40kDa，與預(yù)期結(jié)果相符；而誘導(dǎo)5天的蛋白表達(dá)量比4天要大，由泳道2可看出，經(jīng)過純化處理后只剩下單一的預(yù)期蛋白條帶，表明已經(jīng)成功獲得電泳純級別的酸性蛋白酶P6281。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>華南理工大學(xué)<120>一種酸性蛋白酶在食品和/或飼料領(lǐng)域中的應(yīng)用<130>1<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>28<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>RT-PCR正向引物F<400>1ctgcgaattctcgccggtaaagccaagt28<210>2<211>27<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>RT-PCR反向引物R<400>2acttacgcgtagcggcggtagcaaagc27<210>3<211>1107<212>DNA<213>哈茨木霉<220><223>哈茨木霉蛋白酶p6281目的基因<400>3tcgccggtaaagccaagtgccaagactgccgcgctatcagtgaagcgtgtctcgaacgtc60aaatcattgaagaatattgtccaaaagggccaggcacgcatcaacaagatcaacggcgtc120aaagacatcgaggccagagctagcggcccagccaccaacgaggatgttagctatgttgcc180tcggtcactattggtggtaaatcctgggacctcatcgtcgacactggatcttcaaacacg240tggtgtggtgctcaaagctcatgcgagccttcatctactggcaagtccacgggcggttcc300gtccaggtcagctatggttccggctccttctccggcaccgagtacaaggacacagttagc360ttcggtggtttgactgtcacatcacagtcggttggagctgcccgttcatcctctggcttt420tcaggtgtcgatggaattattggctttggtccggtggatctcactgaggacaccgtctcc480aacgccaacacggttccaaccttcttggataatctctacagccaaggttccatctcgact540gaggtgctgggcgtttctttcaagccagagtctggcagtgacagtgatgacaccaacggc600gagttgaccctcggcggtactgatagctccaagtacacgggctctctcacctacttctca660actctcaagagtggctctgctgctccctactggggcatctctattgctagtttcacctac720ggctcgacgaccctcgcatcgtctgcgaccggcattgtcgacactggtactacgctcatc780tacatccccaccaaggcttacaatgcattcctgtctgccgctggtggcaagactgacagc840tcttctggcctcgccgtcttctcaaaagcgccaacatccaactttgctatcaagtttggc900tcaacgacctacaccctcacaccttctcaatacttggttcccacctctcagtacagcttc960tacggactcagctctggaaagtactacgcttggattaacgacggtggcagctcgggtgtc1020aacaccattattggccagaagttcctggaaaactactactccgtttttgatactaccaac1080ggccgcatcggctttgctaccgccgct1107<210>4<211>52<212>DNA<213>ArtificialSequence<220><223>RF克隆引物<400>4gaagctggatccgaattcccgctcgaggggcccacgcgtcatcatcatcatc52當(dāng)前第1頁1 2 3