本發(fā)明屬于保健食品技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種含麥角甾醇的鈣片及其制備方法。

背景技術(shù)：

麥角甾醇又稱麥角固醇，是脂溶性維生素D2的前體，當(dāng)受到紫外線照射時可轉(zhuǎn)化為維生素D2，麥角甾醇可部分代替維生素D2的作用，促進(jìn)鈣吸收。麥角甾醇可以增強(qiáng)人體抵抗疾病的能力具有明顯的抑菌、抗腫瘤舊功效。麥角甾醇也可以作為重要的醫(yī)藥化工原科，用于生產(chǎn)“可的松”、“激素黃體酮”等甾醇類藥物。

鈣質(zhì)對各年齡組的人群都具有重要營養(yǎng)作用，是人體內(nèi)最重要的礦物質(zhì)之一。根據(jù)衛(wèi)生部研究資料表明，我國有40％的兒童和60％的中老年缺鈣，但市面現(xiàn)有的補(bǔ)鈣產(chǎn)品大多價格昂貴，口味較差，且補(bǔ)鈣效果和產(chǎn)品吸收率也有待驗(yàn)證。

目前，人們?nèi)匀黄谕@得一種更為天然、口感更好、更有利于鈣吸收的鈣片。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種含麥角甾醇的鈣片的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述制備方法得到的含麥角甾醇的鈣片。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種含麥角甾醇的鈣片的制備方法，包含以下步驟：

(1)釀酒酵母的培養(yǎng)：用優(yōu)化培養(yǎng)基對釀酒酵母進(jìn)行好氧發(fā)酵培養(yǎng)，得到釀酒酵母菌液；

優(yōu)化培養(yǎng)基的組成如下：1％(w/v)酵母膏、2％(w/v)蛋白胨、2％(w/v)葡萄糖、10％(v/v)乙醇，1～3％(w/v)NaCl、0～0.01mol/ml Mg²⁺、0～0.01mol/ml Ca²⁺、0～0.01mol/ml Fe³⁺、0～0.01mol/ml NH₄⁺、0～0.01mol/ml Al³⁺、0～0.01mol/ml K⁺；

(2)含麥角甾醇的提?。?/p>

①將步驟(1)獲得的釀酒酵母菌液進(jìn)行固液分離，分別得到發(fā)酵上清和菌體；

②發(fā)酵上清冷凍干燥，得到固體物質(zhì)I；

③將菌體用無菌去離子清洗后，再用生理鹽水稀釋菌體，得到的菌體懸浮液通過脈沖電場破碎細(xì)胞，進(jìn)行固液分離，取上清；將上清進(jìn)行冷凍干燥，得到固體物質(zhì)II；

④將固體物質(zhì)I和固體物質(zhì)II合并，得到固體物質(zhì)A；

(3)含麥角甾醇的鈣片的制備：將固體物質(zhì)A50質(zhì)量份、阿拉乳鈣50質(zhì)量份、全脂奶粉80質(zhì)量份、麥芽糊精50質(zhì)量份和甘蔗提取物20質(zhì)量份混合均勻，得到混合料；再用水溶解混合料，噴霧干燥，制粒，干燥，整粒、壓片，得到含麥角甾醇的鈣片。

步驟(1)中所述的釀酒酵母優(yōu)選為釀酒酵母GIM 2.182。

步驟(1)中所述的好氧發(fā)酵培養(yǎng)的條件優(yōu)選為于25～30℃、100～200rpm條件下振蕩培養(yǎng)。

步驟(1)中所述的優(yōu)化培養(yǎng)基的組成優(yōu)選如下：1％(w/v)酵母膏、2％(w/v)蛋白胨、2％(w/v)葡萄糖、10％(v/v)乙醇，2％(w/v)NaCl、0.01mol/ml Mg²⁺。

步驟(2)①和③中所述的固液分離的方式優(yōu)選為離心。

所述的離心的條件優(yōu)選為3000r/min離心15min。

步驟(2)②和③中所述的冷凍干燥的條件優(yōu)選為0.2mbar、-50℃。

步驟(2)③中所述的生理鹽水的體積用量優(yōu)選為相當(dāng)于菌體體積的9倍。

步驟(2)③中所述的脈沖電場的條件優(yōu)選為13μs脈寬，40kV/cm電場強(qiáng)度，15個脈沖電場。

步驟(3)中所述的水的體積用量優(yōu)選為相當(dāng)于混合料體積的10倍。

所述的水優(yōu)選為純水。

步驟(3)中所述的噴霧干燥的溫度優(yōu)選為65℃。

步驟(3)中所述的制粒得到顆粒優(yōu)選為16目的濕顆粒。

步驟(3)中所述的干燥的條件優(yōu)選為溫度為70℃、蒸汽壓為1.5MPa，干燥至水分降至5％以內(nèi)。

步驟(3)中所述的整粒得到顆粒優(yōu)選為通過14目篩的顆粒。

步驟(3)中所述的壓片的條件優(yōu)選為壓力20kn、壓片直徑6mm、壓片深度8mm、片劑厚度3mm、轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)數(shù)20r/min。

一種含麥角甾醇的鈣片，通過上述制備方法得到。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明在鈣片中加入甘蔗提取物，甘蔗提取物中氨基酸和各種礦物質(zhì)，結(jié)合酵母提取物，可以改善鈣片風(fēng)味口感，同時提高人體免疫力。

(2)本發(fā)明在鈣片中加入麥角甾醇，部分代替維生素D2的作用，可以促進(jìn)鈣的吸收，同時還能抑菌，抗腫瘤。

(3)本品原料篩選過程中，具有合法性和安全性，同時具有更佳的口感。

(4)本發(fā)明將脈沖電場作用于酵母細(xì)胞，提高酵母細(xì)胞膜通透性，可顯著提高細(xì)胞內(nèi)麥角甾醇、蛋白質(zhì)和氨基酸釋放量，增加鈣離子在細(xì)胞中的濃度。

附圖說明

圖1是使用不同碳源發(fā)酵釀酒酵母08-h后菌體中麥角甾醇含量的檢測結(jié)果圖。

圖2是使用不同濃度的NaCl發(fā)酵釀酒酵母08-h后菌體中麥角甾醇含量的檢測結(jié)果圖。

圖3是使用不同金屬離子發(fā)酵釀酒酵母08-h后菌體中麥角甾醇含量的檢測結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

原始菌種中麥角甾醇的含量

(1)菌種購買

釀酒酵母08-h菌種購于廣東省微生物菌種保藏中心，編號GIM 2.182。、

(2)菌種培養(yǎng)

將4℃保藏菌種在斜面培養(yǎng)基(組成成分為：1.5％(w/v)酵母膏，0.5％(w/v)蛋白胨，1％(w/v)葡萄糖，2％(w/v)瓊脂)上活化后，接種于裝有8mL液態(tài)種子培養(yǎng)基(為YPD培養(yǎng)基，組成成分為：1％(w/v)酵母膏，2％(w/v)蛋白胨，2％(w/v)葡萄糖)的試管中，28℃下120rpm培養(yǎng)12h，得到一級液態(tài)菌種。取1mL一級液態(tài)菌種接種于裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在28℃下以150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)20h，制得二級液態(tài)菌種。

(3)發(fā)酵液處理和麥角甾醇提取

將20mL菌液(即二級液態(tài)菌種)于4000rpm，10min離心洗滌2次，收集細(xì)胞，加入醇-堿溶液(8g KOH溶解于32mL濃度為60％(v/v)乙醇溶液得到)，85～90℃皂化4h，冷卻至室溫，25mL正庚烷萃取，收集上清液，液相檢測。

(4)麥角甾醇檢測-高效液相色譜

色譜柱：Brown Validated C18(250×6mm)；

流動相為水：甲醇(體積比)＝2：98；

流速為1.5ml/min；

檢測波長為282nm。

(5)菌種的篩選和麥角甾醇初期含量的測定

利用YPD培養(yǎng)基，考察了廣東省菌種保藏中心的釀酒酵母08-h中麥角甾醇的含量，菌種添加量為2％(v/v)，于28℃下以150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)20h，對發(fā)酵液進(jìn)行處理(具體條件同步驟(3))，采用高效液相色譜對麥角甾醇含量進(jìn)行檢測(具體條件同步驟(4))，結(jié)果顯示，酵母中麥角甾醇含量達(dá)到細(xì)胞干重的1.73％，今后工作都將以釀酒酵母08-h作為實(shí)驗(yàn)菌種。

(6)碳源對麥角甾醇含量的影響

利用YPD培養(yǎng)基，葡萄糖、蔗糖、糖蜜、果糖、麥芽糖分別作為碳源(YPD培養(yǎng)基中本身含2％葡萄糖，其他碳源相應(yīng)取代同樣量的葡萄糖得到不同碳源的培養(yǎng)基)，釀酒酵母08-h菌種添加量為2％(v/v)，于28℃下以150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)20h，對發(fā)酵液進(jìn)行處理(具體條件同步驟(3))，采用高效液相色譜對麥角甾醇含量進(jìn)行檢測(具體條件同步驟(4))，結(jié)果如圖1顯示，同樣消耗等量基質(zhì)，在葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中麥角甾醇含量最高，達(dá)到1.67％。

(7)鹽脅迫對麥角甾醇含量的影響

Na⁺脅迫時，由各種信號傳導(dǎo)途徑將脅迫信號逐級放大，并最終啟動Na+脅迫的各種應(yīng)答蛋白的表達(dá)，對麥角甾醇含量會有一定影響。

本實(shí)驗(yàn)中以葡萄糖為碳源，YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)釀酒酵母08-h菌種，在該培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的NaCl，菌種添加量為2％(v/v)，于28℃下以150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)20h，對得到的發(fā)酵液進(jìn)行處理(具體條件同步驟(3))，采用高效液相色譜對麥角甾醇含量進(jìn)行檢測(具體條件同步驟(4))。結(jié)果如圖2所示，NaCl濃度為2％時，麥角甾醇含量達(dá)到1.87％，比對照組提高了16.1％。

(8)金屬離子對麥角甾醇含量的影響

許多金屬離子對微生物生理活性的作用與其濃度相關(guān)，低濃度時往往呈刺激作用，高濃度時卻表現(xiàn)出抑制作用。最適濃度要依據(jù)菌種的生理特性和發(fā)酵工藝條件來確定。

本實(shí)驗(yàn)中以葡萄糖為碳源，YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)釀酒酵母08-h菌種，在該培養(yǎng)基中分別添加在該培養(yǎng)基中分別添加0.01mol/ml的10種金屬離子，分別是Fe²⁺、Fe³⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Na⁺、NH₄⁺、Mg²⁺、Al³⁺、K⁺，菌種添加量為2％(v/v)，于28℃下以150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)20h，對得到的發(fā)酵液進(jìn)行處理(具體條件同步驟(3))，采用高效液相色譜對麥角甾醇含量進(jìn)行檢測(具體條件同步驟(4))。結(jié)果如圖3所示，可見Mg²⁺和Fe³⁺離子的刺激作用最為明顯，麥角甾醇含量達(dá)到2.05％和1.98％，比對照組分別提高了28.9％和24.5％，F(xiàn)e²⁺、Mn²⁺和Cu²⁺離子對酵母表現(xiàn)出抑制作用，相比對照組，麥角甾醇含量明顯降低。

(9)本實(shí)驗(yàn)將釀酒酵母08-h作為原始菌種，發(fā)酵條件為如下：

對照培養(yǎng)基：1％(w/v)酵母膏、2％(w/v)蛋白胨、2％(w/v)葡萄糖。

優(yōu)化培養(yǎng)基：1％(w/v)酵母膏、2％(w/v)蛋白胨、2％(w/v)葡萄糖、10％(v/v)乙醇，2％(w/v)NaCl、0.01mol/ml Mg²⁺。

發(fā)酵培養(yǎng)條件：2％(v/v)接種量，28℃、150rpm恒溫振蕩培養(yǎng)20h。

提取方式：收集菌體，微波+超聲共同作用；微波的條件為：500w，60℃，超聲的條件為：600w，作用10s，停止10s，共同作用30min。

檢測方法：同步驟(4)。

結(jié)果：經(jīng)過條件最佳優(yōu)化后，達(dá)到2.34％，比原始含量的1.73％提高35.3％。

實(shí)施例2高脈沖電泳(HPEF)對酵母進(jìn)行處理，以提高發(fā)酵液中麥角甾醇的釋放量。

(1)酵母預(yù)處理：2～4℃水洗離心(3000r/min、15min)，0.5％質(zhì)量體積比NaHCO₃洗滌三次，離心(3000r/min、15min)，收集上清液，用生理鹽水將沉淀稀釋10倍，備用。

(2)選擇HPEF參數(shù)：在13μs脈寬下，分別在10、20、30、40kV/cm電場強(qiáng)度下循環(huán)處理，記錄處理的時間或循環(huán)次數(shù)。根據(jù)系統(tǒng)中液體流速、脈沖頻率、處理循環(huán)次數(shù)來計算處理介質(zhì)被處理的脈沖數(shù)，分別在0、15、30、45、60個脈沖時采樣，處理結(jié)束時測蛋白質(zhì)、氨基酸、麥角甾醇溶出量，以未用電場處理的酵母懸浮液作對照。

(3)結(jié)果：對酵母細(xì)胞進(jìn)行脈沖電場處理，經(jīng)過40kV/cm電場強(qiáng)度15個脈沖電場處理后，酵母細(xì)胞全部死亡；經(jīng)過30kV/cm電場強(qiáng)度15個脈沖電場處理后，酵母細(xì)胞半數(shù)死亡，并隨脈沖處理數(shù)增加酵母細(xì)胞死亡率增大；經(jīng)過10kV/cm電場強(qiáng)度15-60個脈沖電場處理后的酵母細(xì)胞全部存活。通過顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)處理前的釀酒酵母細(xì)胞表面光滑，體積飽滿。處理后的釀酒酵母細(xì)胞發(fā)現(xiàn)空洞，有內(nèi)容物流出，細(xì)胞體積縮小或變塌陷。最后確定13μs脈寬，40kV/cm電場強(qiáng)度，15個脈沖電場作為最終條件。

實(shí)施例3麥角甾醇鈣片制備

(1)在最優(yōu)化發(fā)酵條件(使用實(shí)施例1步驟(9)的優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件)下培養(yǎng)酵母，將酵母細(xì)胞進(jìn)行離心，收集上清液，用冷凍干燥機(jī)(0.2mbar，-50℃)進(jìn)行干燥，得到固體物質(zhì)I。收集菌體，用無菌水清洗兩次。

(2)用生理鹽水和菌體按體積比9：1混合，懸浮菌體。在最優(yōu)化條件(即13μs脈寬，40kV/cm電場強(qiáng)度，15個脈沖電場)下，對酵母細(xì)胞進(jìn)行脈沖電場處理，結(jié)束后離心酵母(3000r/min、15min)，收集上清液，利用冷凍干燥機(jī)干燥上清液(0.2mbar，-50℃)，收集固體物質(zhì)II。將固體物質(zhì)I和固體物質(zhì)II合并，得到固體物質(zhì)A。

(3)配料：按比例稱量阿拉乳鈣，奶粉，麥芽糊精，甘蔗提取物，麥角甾醇，與步驟(2)得到的固體物質(zhì)混合30min。其中，各成分按質(zhì)量份計：固體物質(zhì)A 50份，阿拉乳鈣50份，全脂奶粉80份，麥芽糊精50份，甘蔗提取物20份。

(4)干燥：將步驟(1)制得的混合料用相當(dāng)于混合料10倍體積的純水溶解后，65℃噴霧干燥。

(5)制粒：置于制粒機(jī)中，制得16目的濕顆粒。

(6)干燥：將濕顆粒送入高效沸騰干燥機(jī)，設(shè)定溫度70℃，蒸汽壓1.5MPa，將水分降至5％以內(nèi)干燥。

(7)整粒：干燥后的顆粒通過高效整粒機(jī)的14目篩。

(8)壓片：壓片壓力20kn，壓片直徑6mm，壓片深度8mm，片劑厚度3mm，轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)數(shù)20r/min。

經(jīng)過以上方法制備的鈣片，因添加了酵母被脈沖電場作用后其胞內(nèi)物質(zhì)釋放物，提高了其中氨基酸、蛋白質(zhì)、麥角甾醇的含量；因含有麥角甾醇，可以促進(jìn)人體對鈣的吸收，甘蔗提取物的添加，既增加了鈣片營養(yǎng)，也有效改善了鈣片風(fēng)味。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。