本發(fā)明屬于微生物降級(jí)技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種利用小孢根霉少孢變種降解玉米赤霉烯酮的方法。
技術(shù)背景
霉菌毒素是產(chǎn)玉米、小麥等谷物上生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。我國(guó)常見的幾種霉菌毒素和對(duì)動(dòng)物危害比較嚴(yán)重的霉菌毒素有：玉米赤霉烯酮(zea)、嘔吐毒素、黃曲霉毒素b1、伏馬毒素、赭曲霉毒素以及t-2毒素。飼料中霉菌毒素的污染及其危害是全球性的問題，在我國(guó)南方大部分地區(qū)夏天炎熱潮濕，對(duì)于霉菌的生長(zhǎng)提供了有利條件。所以在我國(guó)南方地區(qū)受霉菌毒素的污染十分嚴(yán)重。而我國(guó)對(duì)于霉菌毒素產(chǎn)毒條件的控制不足，霉菌毒素的污染對(duì)食品和飼料生產(chǎn)造成損失十分巨大，已經(jīng)成為阻礙我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展的難題之一。霉菌毒素降低飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，影響飼料的適口性，霉菌毒素沉積的含量過高引發(fā)畜禽的毒性反應(yīng)，降低動(dòng)物的采食量和飼料的轉(zhuǎn)化率，減緩畜禽的生長(zhǎng)速度，破壞畜禽免疫力和抵抗力。影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖能力，甚至增加畜禽的死亡率，造成器官壞死，貧血和抑制細(xì)胞中遺傳信息的傳遞，干擾遺傳物質(zhì)dna、rna的合成，進(jìn)而干擾蛋白質(zhì)的合成，對(duì)人和畜禽產(chǎn)生毒害。
zea，又稱為f-2毒素，是一類具有類雌激素作用的2,4二經(jīng)基苯甲酸內(nèi)醋化合物。玉米、小麥、燕麥和大麥等作物易受到玉米赤霉稀酮污染。zea為白色晶體溶點(diǎn)161-163℃，溶于堿性溶液、甲醇、乙醚、乙醇和苯等，不溶于水，zea具有熱穩(wěn)定性，在詞料加工過程中不易被分解。zea具有很強(qiáng)的生殖毒性和免疫毒性。尤其母豬對(duì)zea最敏感。影響母豬孕酮的分泌和子宮的功能。降低黃體生成素。由于玉米赤霉烯酮對(duì)育種的家畜和家禽危害很大，常?？梢詫?dǎo)致一個(gè)育種基地一年內(nèi)恢復(fù)不到原有的水平，而且造成大面積的品質(zhì)下降。因此，對(duì)玉米赤霉烯酮的毒害作用應(yīng)給予積極防治，減少畜產(chǎn)品的損失。另一方面，可以利用玉米赤霉烯酮在農(nóng)作物生產(chǎn)方面的調(diào)控作用，開發(fā)出高產(chǎn)高質(zhì)的新產(chǎn)品。
現(xiàn)在飼料工業(yè)中采取添加霉菌毒素的吸附劑，以降低攝入畜禽體內(nèi)霉菌毒素的作用。其中效果好的有活性炭和一些高聚合物(比如蒙脫石)等，現(xiàn)在使用較多的是一些非金屬無(wú)機(jī)礦物和有幾聚糖，如硅鋁酸鹽(因?yàn)槠淞己玫碾娯?fù)性)和不同來(lái)源的寡聚糖(因?yàn)槠渚薮蟮谋砻娣e和眾多的化學(xué)鍵)，但是有其負(fù)面效應(yīng)；其次是沸石，沸石具有良好的選擇吸附、陽(yáng)離子交換、催化激活、耐酸、熱穩(wěn)定性和分子篩等物理化學(xué)性質(zhì)和功能特性，包括飼料工業(yè)在內(nèi)的許多領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，但是效果都不太明顯?，F(xiàn)階段對(duì)于霉菌毒素的脫毒分為物理脫毒和化學(xué)處理法，都有不同程度的缺陷，而本制備方法通過微生物對(duì)飼料原料的發(fā)酵來(lái)降解霉菌毒素的沉積。從飼料制備的根本上解決這一難題，有很大的幫助。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種利用小孢根霉少孢變種降解玉米赤霉烯酮的方法，使用該方法可用于降解各種飼料中污染玉米赤霉烯酮，并且制備及應(yīng)用方法簡(jiǎn)單，操作方便、成本低廉，為動(dòng)物飼料降解玉米赤霉烯酮提供了有效方法，該霉菌容易生長(zhǎng)和培養(yǎng)，并且能高密度發(fā)酵、提高飼料的營(yíng)養(yǎng)成分、減少霉菌毒素的含量。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
一種利用小孢根霉少孢變種降解玉米赤霉烯酮的方法，步驟如下：
a.將小孢根霉少孢變種(rhizopusmicrosporusvar.oligosporus)活化培養(yǎng)：用無(wú)菌吸管吸取滅菌pbs緩沖液，滴入放有小孢根霉少孢變種凍干粉的安瓿管內(nèi)，pbs緩沖液與小孢根霉少孢變種凍干粉的用量比例為0.2～0.5ml：2g，輕輕振蕩，使凍干小孢根霉少孢變種菌體溶解呈懸浮狀；
b.擴(kuò)大培養(yǎng)：將步驟a中活化后的菌種接種于121℃高壓濕熱滅菌后冷卻至30-40℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂pda培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，28℃，72小時(shí)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；
所述pda培養(yǎng)基按照下列比例組成：馬鈴薯浸出粉5.0g；葡萄糖20g；瓊脂14g在室溫25℃中ph值為5.6±0.2；配制方法：稱取pda7.8g于200ml蒸餾水或去離子水中加熱至完全溶解，pda與蒸餾水或去離子水的比例為7.8g：200ml，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘，滅菌結(jié)束后搖勻，以防瓊脂沉積于器皿底部而凝固，備用
c.將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種用pbs緩沖液洗滌至250ml錐形瓶中，菌液濃度為1×106cfu/ml-1×107cfu/ml，取混合均勻菌液接種至粉碎玉米中，在28-30℃進(jìn)行固體發(fā)酵，所述的玉米原料中添加了無(wú)菌水，菌液、玉米和無(wú)菌水的用量比例為10ml：200g：70ml，121℃高壓濕熱滅菌后冷卻至30-40℃。
所述pbs緩沖液為：nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l,ph值7.2。配制方法為：稱取原料后加去離子水約800ml充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加入濃鹽酸調(diào)ph至7.2，最后定容到1l。高溫高壓滅菌后置于4℃冰箱保存待用。
所述的小孢根霉少孢變種(rhizopusmicrosporusvar.oligosporus)(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)cgmcc3.4392)，菌種購(gòu)自北京豫鼎鑫捷科技有限公司。
所述玉米購(gòu)自飼料原料市場(chǎng)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:利用小孢根霉少孢變種對(duì)飼料原料的固體發(fā)酵過程中，不僅對(duì)飼料原料的營(yíng)養(yǎng)成分有不同程度的提升，而且對(duì)玉米赤霉烯酮有降解的效果。益生霉菌的發(fā)酵有雙重的效果,通過降解部分多糖、蛋白質(zhì)、脂肪，消除抗?fàn)I養(yǎng)因子和積累有益的代謝物等大分子物質(zhì)，形成有機(jī)酸和可溶性多肽等小分子物質(zhì)，形成營(yíng)養(yǎng)性豐富、適口性好和活菌含量較高的生物飼料不僅對(duì)飼料原料的營(yíng)養(yǎng)成分有提升還能降解嘔吐毒素的含量。不存在二次污染的問題，提高飼料原料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。提高產(chǎn)品的質(zhì)量,提高糧食利用率，保證人畜的安全問題，還具有生產(chǎn)使用成本低、簡(jiǎn)單、易操作，玉米赤霉烯酮降解安全、高效等優(yōu)點(diǎn)利用，對(duì)于企業(yè)生產(chǎn)有良好的借鑒基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明實(shí)施例中小孢根霉少孢變種(rhizopusmicrosporusvar.oligosporus)(中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，編號(hào)cgmcc3.4392)，菌種購(gòu)自北京豫鼎鑫捷科技有限公司，玉米從飼料廠購(gòu)買飼料原料。
pbs緩沖液為：nacl137mmol/l，kcl2.7mmol/l，na2hpo410mmol/l，kh2po42mmol/l。稱取137mmolnacl、2.7mmolkcl、10mmolna2hpo4和2mmolkh2po4加去離子水約800ml充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加入濃鹽酸調(diào)ph至7.2，最后定容到1l，高溫高壓滅菌后置于4℃冰箱保存待用。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)培養(yǎng)基：馬鈴薯浸出粉5.0g；葡萄糖20g；瓊脂14g在室溫25℃中ph值為5.6±0.2；配制方法：稱取pda7.8g于200ml蒸餾水或去離子水中(可按比例增加或者減少配置量)加熱至完全溶解，分裝，121℃高壓滅菌15分鐘，滅菌結(jié)束后搖勻，以防瓊脂沉積于器皿底部而凝固，備用
實(shí)施例1：
一種利用小孢根霉少孢變種固體發(fā)酵降解玉米赤霉烯酮的方法，步驟如下：
1.小孢根霉少孢變種菌液的制備
首先將菌粉活化培養(yǎng)用無(wú)菌吸管，吸取0.2ml滅菌pbs緩沖液滴入2g凍干菌體的安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，分別配置五組懸浮液；
2.馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)培養(yǎng)基的制備
首先將高溫滅菌的pda分別倒入五個(gè)培養(yǎng)皿中，冷卻至室溫。然后將活化好的五組霉菌菌種，接種至pda培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)皿中用200ul移液槍吸取菌液200ul至五個(gè)培養(yǎng)皿中，再用接種環(huán)涂布均勻，放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將溫度調(diào)節(jié)至小孢根霉少孢變種適宜生長(zhǎng)溫度28℃，進(jìn)行72h培養(yǎng)。
在72h后，將五個(gè)生長(zhǎng)霉菌的培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱中取出，分別用pbs緩沖液洗滌培養(yǎng)皿中的小孢根霉少孢變種，每個(gè)培養(yǎng)皿洗滌5次，每次10ml，盡量將生長(zhǎng)的霉菌洗滌至300ml錐形瓶中,5個(gè)培養(yǎng)皿一共洗滌25次，菌液為250ml，然后調(diào)節(jié)菌液的濃度，用25格x16格血球計(jì)數(shù)板技術(shù)，用200ul移液槍滴一滴菌液至血球計(jì)數(shù)板中，放置顯微鏡下計(jì)數(shù)。公式為：霉菌數(shù)/ml＝80小格內(nèi)霉菌細(xì)胞個(gè)數(shù)/80×400×10四次方×稀釋倍數(shù)，將菌液的濃度保持在1×107cfu/ml。
3.固體發(fā)酵培養(yǎng)
飼料原料的制備方法：粉碎玉米原料稱重200g，添加70ml無(wú)菌水，121℃高壓濕熱滅菌后冷卻至40℃。取步驟2中菌液10ml接種至200g粉碎玉米原料中，菌液的濃度保持在1×107cfu/ml，固體發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間為72小時(shí)。
設(shè)立空白對(duì)照組不進(jìn)行霉菌接種，作為對(duì)照。稱取粉碎玉米200g，添加80ml無(wú)菌水，121℃高壓濕熱滅菌后冷卻至40℃，固體發(fā)酵溫度為30℃,發(fā)酵時(shí)間為72小時(shí)。
上述應(yīng)用中，所述的粉碎玉米都是從飼料廠購(gòu)買飼料原料。
試驗(yàn)結(jié)束。收集發(fā)酵前后的飼料原料稱重后，進(jìn)行65℃風(fēng)干，再進(jìn)行粉碎，-20℃保存待測(cè)。
4.小孢根霉少孢變種發(fā)酵前后玉米營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的變化
分別測(cè)定小孢根霉少孢變種發(fā)酵前后玉米的總能，粗脂肪，粗蛋白，營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的變化。統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)用spss19軟件的一般線性模型進(jìn)行單因素分析，粗脂肪的含量顯著低于空白對(duì)照組的粗脂肪含量。因?yàn)槊咕纳L(zhǎng)和繁殖需要碳水化合物來(lái)維持。粗脂肪以此來(lái)作為碳源來(lái)維持生長(zhǎng)。所以在小孢根霉少孢變種發(fā)酵過程中生成總能和粗蛋白的含量有上升。具體結(jié)果見下表。
5.小孢根霉少孢變種發(fā)酵前后玉米赤霉烯酮含量的變化
經(jīng)過小孢根霉少孢變種固體發(fā)酵后使玉米赤霉烯酮的含量顯著下降。
經(jīng)過少孢根霉固體發(fā)酵后使玉米赤霉烯酮的含量顯著下降。
實(shí)施例2：
一種利用少孢根霉降解玉米赤霉烯酮的方法，步驟如下：
a.將小孢根霉少孢變種(rhizopusmicrosporusvar.oligosporus)活化培養(yǎng)：用無(wú)菌吸管吸取0.5ml滅菌pbs緩沖液，滴入放有2g小孢根霉少孢變種凍干粉的安瓿管內(nèi)，輕輕振蕩，使凍干小孢根霉少孢變種菌體溶解呈懸浮狀；
b.擴(kuò)大培養(yǎng)：將步驟a中活化后的菌種接種于121℃高壓濕熱滅菌后冷卻至30℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂pda培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，28℃，72小時(shí)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；
c.將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種用pbs緩沖液洗滌至250ml錐形瓶中，菌液濃度為1×106cfu/ml，200g粉碎玉米原料中添加了70ml無(wú)菌水，121℃高壓濕熱滅菌后冷卻至30-40℃，取混合均勻菌液10ml接種至粉碎玉米中，在28℃進(jìn)行固體發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間72h。
設(shè)立空白對(duì)照組不進(jìn)行霉菌接種，作為對(duì)照。稱取粉碎玉米200g，添加80ml無(wú)菌水，121℃高壓濕熱滅菌后冷卻至30℃，固體發(fā)酵溫度為28℃,發(fā)酵時(shí)間為72小時(shí)。
試驗(yàn)結(jié)束。收集發(fā)酵前后的飼料原料稱重后，進(jìn)行65℃風(fēng)干，再進(jìn)行粉碎，-20℃保存待測(cè)。
玉米小孢根霉少孢變種發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量的變化分別測(cè)定玉米小孢根霉少孢變種(發(fā)酵前后的總能，粗脂肪，粗蛋白，營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)的變化。統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)用spss19軟件的一般線性模型進(jìn)行單因素方差分析，粗脂肪的含量顯著低于空白對(duì)照組的粗脂肪含量。因?yàn)槊咕纳L(zhǎng)和繁殖需要碳水化合物來(lái)維持。粗脂肪以此來(lái)作為碳源來(lái)維持生長(zhǎng)。所以在小孢根霉少孢變種發(fā)酵過程中生成總能和粗蛋白的含量有上升。具體結(jié)果見下表。
玉米小孢根霉少孢變種發(fā)酵前后玉米赤霉烯酮含量的變化為：經(jīng)過小孢根霉少孢變種固體發(fā)酵后使玉米赤霉烯酮的含量顯著下降。